H2O,进行水封,以消除弯月面使胶柱顶端平坦。胶管垂直聚合约30分钟,聚合完成时 可观察到水封下的折光面 3.装槽和电泳 用滤纸条吸去胶管上端的水封,除去下端的薄膜,水封端向上,将胶管垂直插入圆 盘电泳槽内,调节好各管的高度,记下管号。每支管约1/3在上槽,2/3在下槽。上槽 加入500ml0.IMH3PO4,下槽加入500ml0. IM NaOh,淹没各管口和电极,用注射器或 滴管吸去管口的气泡。上槽接正极,下槽接负极,开启电泳仪,恒压160V,聚焦2至3 小时,至电流近于零不再降低时,停止电泳。 4.剥胶 取下胶管,用H2O将胶管和两端洗2次,用注射器沿管壁轻轻插入针头,在转动 胶管和内插针头的同时分别向胶管两端注入H2O少许,胶条即自行滑出,若不滑出可用 洗耳球轻轻挤出。胶条置于小培养皿内,记住正极端为“头”,负极端为“尾”,若分不 清时,可用pH试纸鉴定,酸性端为正,碱性端为负 5.固定 取2支胶条置于一个小培养皿内,倒入10%三氯乙酸溶液至没过胶条,进行固定 约半小时后,即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。固定完毕,倒出固定液,用直尺量 出胶条长度“L”和正极端到蛋白质白色沉淀带中心(即聚焦部位)的长度“L”。 固定后的胶条可在康强860紫外/可见分光光度计上用280nm或238nm波长作凝胶扫描, 然后用扫描图作相应的测量和计算 6.测定pH梯度 将放在另一个培养皿内未固定的胶条,用直尺量出待测pH胶条的长度“L”。按 照由正极至负极的顺序,用镊子和小刀依次将胶条切成10mm长的小段,分别置于小试 管中,加入1mlH2O,浸泡半小时以上或过夜,用仔细校正后的带细长pH复合电极的 pH计测出每管浸出液的pH值。 七、数据处理 以胶条长度(mm)为横座标,p值为纵座标作图,得到一条pH梯度曲线。所 测每管的pH值为I0mm胶条的pH的混合平均值。作图时将此pH值取为10mm小段中 心即5mm处的pH值。 2.用下式计算蛋白质聚焦部位至胶条正极端的实际长度L IxLI 上式中:L—一量出蛋白质的白色沉淀带中心至胶条正极端的长度 L——测pH的胶条的长度 L2-—固定后胶条的长度 3.根据计算出的L,由pH梯度曲线上查出相应的pH值,即为该蛋白质的等电点。 画出固定后所测胶条的示意图。187 H2O，进行水封，以消除弯月面使胶柱顶端平坦。胶管垂直聚合约 30 分钟，聚合完成时 可观察到水封下的折光面。 3. 装槽和电泳 用滤纸条吸去胶管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，将胶管垂直插入圆 盘电泳槽内，调节好各管的高度，记下管号。每支管约 1/3 在上槽，2/3 在下槽。上槽 加入 500ml 0.1M H3PO4，下槽加入 500ml 0.1M NaOH，淹没各管口和电极，用注射器或 滴管吸去管口的气泡。上槽接正极，下槽接负极，开启电泳仪，恒压 160V，聚焦 2 至 3 小时，至电流近于零不再降低时，停止电泳。 4. 剥胶 取下胶管，用 H2O 将胶管和两端洗 2 次，用注射器沿管壁轻轻插入针头，在转动 胶管和内插针头的同时分别向胶管两端注入 H2O 少许，胶条即自行滑出，若不滑出可用 洗耳球轻轻挤出。胶条置于小培养皿内，记住正极端为“头”，负极端为“尾”，若分不 清时，可用 pH 试纸鉴定，酸性端为正，碱性端为负。 5. 固定 取 2 支胶条置于一个小培养皿内，倒入 10%三氯乙酸溶液至没过胶条，进行固定， 约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。固定完毕，倒出固定液，用直尺量 出胶条长度“L2”和正极端到蛋白质白色沉淀带中心（即聚焦部位）的长度“L’”。 固定后的胶条可在康强860紫外/可见分光光度计上用280nm或238nm波长作凝胶扫描， 然后用扫描图作相应的测量和计算。 6. 测定 pH 梯度 将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直尺量出待测 pH 胶条的长度“L1”。按 照由正极至负极的顺序，用镊子和小刀依次将胶条切成 10mm 长的小段，分别置于小试 管中，加入 1ml H2O，浸泡半小时以上或过夜，用仔细校正后的带细长 pH 复合电极的 pH 计测出每管浸出液的 pH 值。 七、数据处理 1. 以胶条长度（mm）为横座标，pH 值为纵座标作图，得到一条 pH 梯度曲线。所 测每管的 pH 值为 10mm 胶条的 pH 的混合平均值。作图时将此 pH 值取为 10mm 小段中 心即 5mm 处的 pH 值。 2. 用下式计算蛋白质聚焦部位至胶条正极端的实际长度 L ： 上式中： L’——量出蛋白质的白色沉淀带中心至胶条正极端的长度。 L1——测 pH 的胶条的长度 L2——固定后胶条的长度 3. 根据计算出的 L，由 pH 梯度曲线上查出相应的 pH 值，即为该蛋白质的等电点。 4. 画出固定后所测胶条的示意图。 2 1 ' L L L = L 