定的离心时间内进行离心时,在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀,分出 的上清液在加大转速下再进行离心,又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和 较轻颗粒的上清液,如此多次离心处理,即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此 法所得的沉淀是不均一的,仍杂有其它成分,需经过2~3次的再悬浮和再离心,才能 得到较纯的颗粒。 此法主要由于组织匀浆液中分离细胞器和病毒,其优点是:操作简易,离心后用 倾倒法即可将上清液与沉淀分开,并可使用容量较大的角式转子。缺点是:须多次离 心,沉淀中有夹带,分离效果差,不能一次得到纯颗粒,沉淀于管底的颗粒受挤压, 容易变性失活。 2.密度梯度区带离心法(筒称区带离心法) 区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡,在一定的离 力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上,形成不同区带的分离方法。此法的优点 是:①分离效果好,可一次获得较纯颗粒:②适应范围广,能象差速离心法一样分离 具有沉降系数差的颗粒,又能分离有一定浮力密度差的颗粒:③颗粒不会挤压变形, 能保持颗粒活性,并防止已形成的区带由于对流而引起混合 此法的缺点是:①离心时间较长;②需要制备惰性梯度介质溶液:③操作严格, 不易掌握 密度梯度区带离心法又可分为两种: (1)差速区带离心法:当不同的颗粒间存在沉降速度差时(不需要像差速沉降 离心法所要求的那样大的沉降系数差)。在一定的离心力作用下,颗粒各自以一定的 速度沉降,在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。此法 仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒(20%的沉降系数差或更少)或分子量相差3倍 的蛋白质,与颗粒的密度无关,大小相同,密度不同的颗粒(如线粒体,溶酶体等) 不能用此法分离。 离心管先装好密度梯度介质溶液,样品液加在梯度介质的液面上,离心时,由 于离心力的作用,颗粒离开原样品层,按不同沉降速度向管底沉降,离心一定时间 后,沉降的颗粒逐渐分开,最后形成一系列界面清楚的不连续区带,沉降系数越大, 往下沉降越快,所呈现的区带也越低,离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结 東,样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液,其最大密度 和浓度可达1.28kg/cm3和60%。125 一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出 的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和 较轻颗粒的上清液，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此 法所得的沉淀是不均一的，仍杂有其它成分，需经过 2～3 次的再悬浮和再离心，才能 得到较纯的颗粒。 此法主要由于组织匀浆液中分离细胞器和病毒，其优点是：操作简易，离心后用 倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：须多次离 心，沉淀中有夹带，分离效果差，不能一次得到纯颗粒，沉淀于管底的颗粒受挤压， 容易变性失活。 2. 密度梯度区带离心法（简称区带离心法）： 区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离 心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法的优点 是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样分离 具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形， 能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格， 不易掌握。 密度梯度区带离心法又可分为两种： （1）差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降 离心法所要求的那样大的沉降系数差）。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的 速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。此法 仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差 3 倍 的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等） 不能用此法分离。 离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由 于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间 后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大， 往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结 束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度 和浓度可达 1.28 kg/cm3 和 60％