5离心技术 离心技术在生物科学,特别是在生物化学和分子生物学研究领域,已得到十分广 泛的应用,每个生物化学和分子生物学实验室都要装备多种型式的离心机。离心技术 主要用于各种生物样品的分离和制备,生物样品悬浮液在高速旋转下,由于巨大的离 心力作用,使悬浮的微小颗粒(细胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降, 从而与溶液得以分离,而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。 5.1基本原理 当一个粒子(生物大分子或细胞器)在高速旋转下受到离心力作用时,此离心力 “F”由下式定义,即: F=m·a=m·o2 a一粒子旋转的加速度,m一沉降粒子的有效质量,ω一粒子旋转的角速 度,r粒子的旋转半径(cm) 通常离心力常用地球引力的倍数来表示,因而称为相对离心力“RCF”。或者用数 字乘“g”来表示,例如25000×g,则表示相对离心力为25000。相对离心力是指在 离心场中,作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数,单位是重力加速度“g (980cm/sec2),此时“RCF”相对离心力可用下式计算: F2r 980 60 ∴RCF=1.9×105×(rpm)2r (rpm- revolutions per minute每分钟转数,r/min) 由上式可见,只要给出旋转半径r,则RCF和rpm之间可以相互换算。但是由于 转头的形状及结构的差异,使每台离心机的离心管,从管口至管底的各点与旋转轴之 间的距离是不一样的,所以在计算是规定旋转半径均用平均半径“rav”代替: r的测量如下图所示:
120 5 离心技术 离心技术在生物科学，特别是在生物化学和分子生物学研究领域，已得到十分广 泛的应用，每个生物化学和分子生物学实验室都要装备多种型式的离心机。离心技术 主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离 心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降， 从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。 5.1 基本原理 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力 “F”由下式定义，即： F = m·a = m·ω2 r a — 粒子旋转的加速度， m — 沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速 度， r—粒子的旋转半径( cm )。 通常离心力常用地球引力的倍数来表示，因而称为相对离心力 “ RCF ”。或者用数 字乘“g”来表示，例如 25000×g，则表示相对离心力为 25000。相对离心力是指在 离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g” （980cm/sec2），此时“RCF”相对离心力可用下式计算： 980 2 r RCF ω ＝ 60 2π rpm ω＝ ∴ RCF = 1.119×10－5×(rpm)2 r ( rpm — revolutions per minute 每分钟转数，r/min ) 由上式可见，只要给出旋转半径 r，则 RCF 和 rpm 之间可以相互换算。但是由于 转头的形状及结构的差异，使每台离心机的离心管，从管口至管底的各点与旋转轴之 间的距离是不一样的，所以在计算是规定旋转半径均用平均半径“ra v”代替： ra v=( r min＋rmax) / 2 r 的测量如下图所示：
旋转 般情况下,低速离心时常以转速“rpm”来表示,高速离心时则以“g”表示 计算颗粒的相对离心力时,应注意离心管与旋转轴中心的距离“r”不同,即沉降颗粒 在离心管中所处位置不同,则所受离心力也不同。因此在报告超离心条件时,通常总 是用地心引力的倍数“×g”代替每分钟转数“rpm”,因为它可以真实地反映颗粒在 离心管内不同位置的离心力及其动态变化。科技文献中离心力的数据通常是指其平均 值( RCFay),即离心管中点的离心力。 为便于进行转速和相对离心力之间的换算,Dole和 Cotzias利用RCF的计算公 式,制作了转速“rpm”、相对离心力“RCF”和旋转半径“r”三者关系的列线图 图式法比公式计算法方便(列线图参见附录)。换算时,先在r标尺上取已知的半径 和在rpm标尺上取已知的离心机转数,然后将这两点间划一条直线,与图中RCF标尺 上的交叉点即为相应的相对离心力数值。注意,若已知的转数值处于rpm标尺的右 边,则应读取RCF标尺右边的数值,转数值处于rpm标尺左边,则应读取RCF标尺 左边的数值。 5.2离心机的主要构造和类型 离心机可分为工业用离心机和实验用离心机。实验用离心机又分为制备性离心机 和分析性离心机,制备性离心机主要用于分离各种生物材料,每次分离的样品容量比 较大,分析性离心机一般都带有光学系统,主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理 化性质,依据待测物质在离心场中的行为(用离心机中的光学系统连续监测),能推 断物质的纯度、形状和分子量等。分析性离心机都是超速离心机。 1.制备性高心机可分为三类 (1)普通离心机:最大转速6000rpm左右,最大相对离心力近6000×g,容量为
121 34º rmin 旋转轴 rav rmax 一般情况下，低速离心时常以转速“rpm”来表示，高速离心时则以“g” 表示。 计算颗粒的相对离心力时，应注意离心管与旋转轴中心的距离“r”不同，即沉降颗粒 在离心管中所处位置不同，则所受离心力也不同。因此在报告超离心条件时，通常总 是用地心引力的倍数“×g”代替每分钟转数“rpm”，因为它可以真实地反映颗粒在 离心管内不同位置的离心力及其动态变化。科技文献中离心力的数据通常是指其平均 值（RCFa v），即离心管中点的离心力。 为便于进行转速和相对离心力之间的换算，Dole 和 Cotzias 利用 RCF 的计算公 式，制作了转速“rpm”、相对离心力“RCF”和旋转半径“r”三者关系的列线图， 图式法比公式计算法方便（列线图参见附录）。换算时，先在 r 标尺上取已知的半径 和在 rpm 标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，与图中 RCF 标尺 上的交叉点即为相应的相对离心力数值。注意，若已知的转数值处于 rpm 标尺的右 边，则应读取 RCF 标尺右边的数值，转数值处于 rpm 标尺左边，则应读取 RCF 标尺 左边的数值。 5.2 离心机的主要构造和类型 离心机可分为工业用离心机和实验用离心机。实验用离心机又分为制备性离心机 和分析性离心机，制备性离心机主要用于分离各种生物材料，每次分离的样品容量比 较大，分析性离心机一般都带有光学系统，主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理 化性质，依据待测物质在离心场中的行为（用离心机中的光学系统连续监测），能推 断物质的纯度、形状和分子量等。分析性离心机都是超速离心机。 1. 制备性离心机可分为三类： ⑴ 普通离心机：最大转速 6000 rpm 左右，最大相对离心力近 6000×g，容量为
几十毫升至几升,分离形式是固液沉降分离,转子有角式和外摆式,其转速不能严格 控制,通常不带冷冻系统,于室温下操作,用于收集易沉降的大颗粒物质,如红血 球、酵母细胞等。这种离心机多用交流整流子电动机驱动,电机的碳刷易磨损,转速 是用电压调压器调节,起动电流大,速度升降不均匀,一般转头是置于一个硬质钢轴 上,因此精确地平衡离心管及内容物就极为重要,否则会损坏离心机 (2)高速冷冻离心机:最大转速为20000-2500rpm(r/min),最大相对离心力 为89000g,最大容量可达3升,分离形式也是固液沉降分离,转头配有各种角式转 头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头、一般都有制冷系 统,以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量,离心室的温度可以调节和维 持在0~4C,转速、温度和时间都可以严格准确地控制,并有指针或数字显示,通常 用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作 但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。 (3)超速离心机:转速可达5000080000pm,相对离心力最大可达510000g, 最著名的生产厂商有美国的贝克曼公司和日本的日立公司等,离心容量由几十毫升至 2升,分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离,离心管平衡允许的误差要小于 0.1克。超速离心机的出现,使生物科学的研究领域有了新的扩展,它能使过去仅仅在 电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级分离,还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖 超速离心机主要由驱动和速度控制、温度控制、真空系统和转头四部分组成。超 速离心机的驱动装置是由水冷或风冷电动机通过精密齿轮箱或皮带变速,或直接用变 频感应电机驱动,并由微机进行控制,由于驱动轴的直径较细,因而在旋转时此细轴 可有一定的弹性弯曲,以适应转头轻度的不平衡,而不致于引起震动或转轴损伤,除 速度控制系统外,还有一个过速保护系统,以防止转速超过转头最大规定转速而引起 转头的撕裂或爆炸,为此,离心腔用能承受此种爆炸的装甲钢板密闭 温度控制是由安装在转头下面的红外线射量感受器直接并连续监测离心腔的温 度,以保证更准确更灵敏的温度调控,这种红外线温控比髙速离心机的热电偶控制装 置更敏感,更准确 超速离心机装有真空系统,这是它与高速离心机的主要区别。离心机的速度在 2000rpm以下时,空气与旋转转头之间的磨擦只产生少量的热,速度超过20000rpm 时,由磨擦产生的热量显著增大,当速度在40000pm以上时,由磨擦产生的热量就
122 几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离，转子有角式和外摆式，其转速不能严格 控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血 球、酵母细胞等。这种离心机多用交流整流子电动机驱动，电机的碳刷易磨损，转速 是用电压调压器调节，起动电流大，速度升降不均匀，一般转头是置于一个硬质钢轴 上，因此精确地平衡离心管及内容物就极为重要，否则会损坏离心机。 ⑵ 高速冷冻离心机：最大转速为 20000～25000rpm（r/min），最大相对离心力 为 89000×g，最大容量可达 3 升，分离形式也是固液沉降分离，转头配有各种角式转 头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头、一般都有制冷系 统，以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量，离心室的温度可以调节和维 持在 0～4 0C，转速、温度和时间都可以严格准确地控制，并有指针或数字显示，通常 用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作， 但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。 ⑶ 超速离心机：转速可达 50000～80000 rpm，相对离心力最大可达 510000×g， 最著名的生产厂商有美国的贝克曼公司和日本的日立公司等，离心容量由几十毫升至 2 升，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，离心管平衡允许的误差要小于 0.1 克。超速离心机的出现，使生物科学的研究领域有了新的扩展，它能使过去仅仅在 电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖 等。 超速离心机主要由驱动和速度控制、温度控制、真空系统和转头四部分组成。超 速离心机的驱动装置是由水冷或风冷电动机通过精密齿轮箱或皮带变速，或直接用变 频感应电机驱动，并由微机进行控制，由于驱动轴的直径较细，因而在旋转时此细轴 可有一定的弹性弯曲，以适应转头轻度的不平衡，而不致于引起震动或转轴损伤，除 速度控制系统外，还有一个过速保护系统，以防止转速超过转头最大规定转速而引起 转头的撕裂或爆炸，为此，离心腔用能承受此种爆炸的装甲钢板密闭。 温度控制是由安装在转头下面的红外线射量感受器直接并连续监测离心腔的温 度，以保证更准确更灵敏的温度调控，这种红外线温控比高速离心机的热电偶控制装 置更敏感，更准确。 超速离心机装有真空系统，这是它与高速离心机的主要区别。离心机的速度在 2000 rpm 以下时，空气与旋转转头之间的磨擦只产生少量的热，速度超过 20000 rpm 时，由磨擦产生的热量显著增大，当速度在 40000 rpm 以上时，由磨擦产生的热量就
成为严重问题,为此,将离心腔密封,并由机械泵和扩散泵串联工作的真空泵系统抽 成真空,温度的变化容易控制,磨擦力很小,这样才能达到所需的超高转速 2转头: (1)角式转头:角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头。它是由一块完 整的金属制成的,其上有4~12个装离心管用的机制孔穴,即离心管腔,孔穴的中心 轴与旋转轴之间的角度在20~40度之间,角度越大沉降越结实,分离效果越好。这种 转头的优点是具有较大的容量,且重心低,运转平衡,寿命较长,颗粒在沉降时先沿 离心力方向撞向离心管,然后再沿管壁滑向管底,因此管的一侧就会出现颗粒沉积, 此现象称为“壁效应”,壁效应容易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱,影响 分离效果。 (2)荡平式转头:这种转头是由吊着的4或6个自由活动的吊桶(离心套管)构 成。当转头静止时,吊桶垂直悬挂,当转头转速达到每分钟200到800转时,吊桶荡 至水平位置,这种转头最适合做密度梯度区带离心,其优点是梯度物质可放在保持垂 直的离心管中,离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴,而不像角式转头中样品沉 淀物的界面与离心管成一定角度,因而有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各 样品带。其缺点是颗粒沉降距离长,离心所需时间也长 (3)区带转头:区带转头无离心管,主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成,转 子桶中装有十字型隔板装置,把桶内分隔成四个或多个扇形小室,隔板内有导管,梯 度液或样品液从转头中央的进液管泵入,通过这些导管分布到转子四周,转头内的隔 板可保持样品带和梯度介质的稳定。沉降的样品颗粒在区带转头中的沉降情况不同于 角式和外摆式转头,在径向的散射离心力作用下,颗粒的沉降距离不变,因此区带转 头的“壁效应”极小,可以避免区带和沉降颗粒的紊乱,分离效果好,而且还有转速 高,容量大,回收梯度容易和不影响分辨率的优点,使超离心用于制备和工业生产成 为可能。区带转头的缺点是样品和介质直接接触转头,耐腐蚀要求高,操作复杂 (4)垂直转头:其离心管是垂直放置,样品颗粒的沉降距离最短,离心所需时间 也短,适合用于密度梯度区带离心,离心结束后液面和样品区带要作九十度转向,因 而降速要慢。 (5)连续流动转头:可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离,转头与区带转头 类似,由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成,离心时样品液由入口连续 流入转头,在离心力作用下,悬浮颗粒沉降于转子桶壁,上清液由出口流出
123 成为严重问题，为此，将离心腔密封，并由机械泵和扩散泵串联工作的真空泵系统抽 成真空，温度的变化容易控制，磨擦力很小，这样才能达到所需的超高转速。 2. 转头： ⑴ 角式转头：角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头。它是由一块完 整的金属制成的，其上有 4～12 个装离心管用的机制孔穴，即离心管腔，孔穴的中心 轴与旋转轴之间的角度在 20～40 度之间，角度越大沉降越结实，分离效果越好。这种 转头的优点是具有较大的容量，且重心低，运转平衡，寿命较长，颗粒在沉降时先沿 离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧就会出现颗粒沉积， 此现象称为“壁效应”，壁效应容易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱，影响 分离效果。 ⑵ 荡平式转头：这种转头是由吊着的 4 或 6 个自由活动的吊桶（离心套管）构 成。当转头静止时，吊桶垂直悬挂，当转头转速达到每分钟 200 到 800 转时，吊桶荡 至水平位置，这种转头最适合做密度梯度区带离心，其优点是梯度物质可放在保持垂 直的离心管中，离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴，而不像角式转头中样品沉 淀物的界面与离心管成一定角度，因而有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各 样品带。其缺点是颗粒沉降距离长，离心所需时间也长。 ⑶ 区带转头：区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成，转 子桶中装有十字型隔板装置，把桶内分隔成四个或多个扇形小室，隔板内有导管，梯 度液或样品液从转头中央的进液管泵入，通过这些导管分布到转子四周，转头内的隔 板可保持样品带和梯度介质的稳定。沉降的样品颗粒在区带转头中的沉降情况不同于 角式和外摆式转头，在径向的散射离心力作用下，颗粒的沉降距离不变，因此区带转 头的“壁效应”极小，可以避免区带和沉降颗粒的紊乱，分离效果好，而且还有转速 高，容量大，回收梯度容易和不影响分辨率的优点，使超离心用于制备和工业生产成 为可能。区带转头的缺点是样品和介质直接接触转头，耐腐蚀要求高，操作复杂。 ⑷ 垂直转头：其离心管是垂直放置，样品颗粒的沉降距离最短，离心所需时间 也短，适合用于密度梯度区带离心，离心结束后液面和样品区带要作九十度转向，因 而降速要慢。 ⑸ 连续流动转头：可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离，转头与区带转头 类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成，离心时样品液由入口连续 流入转头，在离心力作用下，悬浮颗粒沉降于转子桶壁，上清液由出口流出
3.离心管: 离心管主要用塑料和不锈钢制成,塑料离心管常用材料有聚乙烯(PE),聚碳酸 酯(PC),聚丙烯(PP)等,其中PP管性能较好。塑料离心管的优点是透明(或半透 明),硬度小,可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形,抗有机溶剂腐蚀性差,使用寿 命短 不锈钢管强度大,不变形,能抗热,抗冻,抗化学腐蚀。但用时也应避免接触 强腐蚀性的化学药品,如强酸、强碱等 塑料离心管都有管盖,离心前管盖必须盖严,倒置不漏液。管盖有三种作用 ①防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时,这点尤其重要。②防止样 品挥发。③支持离心管,防止离心管变形。 4.分析性离心机: 分析性离心机使用了特殊设计的转头和光学检测系统,以便连续地监视物质在一 个离心场中的沉降过程。从而确定其物理性质。 分析性超速离心机的转头是椭圆形的,以避免应力集中于孔处。此转头通过一个 有柔性的轴联接到一个高速的驱动装置上,转头在一个冷冻的和真空的腔中旋转,转 头上有2~6个装离心杯的小室,离心杯是扇形石英的,可以上下透光,离心机中装有 个光学系统,在整个离心期间都能通过紫外吸收或折射率的变化监测离心杯中沉降 着的物质,在预定的期间可以拍摄沉降物质的照片,在分析离心杯中物质沉降情况 寸,在重颗粒和轻颗粒之间形成的界面就像一个折射的透镜,结果在检测系统的照像 底板上产生了一个“峰”,由于沉降不断进行,界面向前推进,因此峰也移动,从峰 移动的速度可以计算出样品颗粒的沉降速度。 分析性超速离心机和主要特点就是能在短时间内,用少量样品就可以得到一些重 要信息,能够确定生物大分子是否存在,其大致的含量,计算生物大分子的沉降系 数,结合界面扩散,估计分子的大小,检测分子的不均一性及混合物中各组份的比 例,测定生物大分子的分子量,还可以检测生物大分子的构象变化等。 5.3制备性超速离心的分离方法: 1.差速沉降离心法:这是最普通的离心法。即采用逐渐增加离心速度或低速和高 速交替进行离心,使沉降速度不同的颗粒,在不同的离心速度及不同离心时间下分批 分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒 差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在 124
124 3. 离心管： 离心管主要用塑料和不锈钢制成，塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸 酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中 PP 管性能较好。塑料离心管的优点是透明（或半透 明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿 命短。 不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触 强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。 塑料离心管都有管盖，离心前管盖必须盖严，倒置不漏液。管盖有三种作用： ①防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时，这点尤其重要。②防止样 品挥发。③支持离心管，防止离心管变形。 4. 分析性离心机： 分析性离心机使用了特殊设计的转头和光学检测系统，以便连续地监视物质在一 个离心场中的沉降过程。从而确定其物理性质。 分析性超速离心机的转头是椭圆形的，以避免应力集中于孔处。此转头通过一个 有柔性的轴联接到一个高速的驱动装置上，转头在一个冷冻的和真空的腔中旋转，转 头上有 2～6 个装离心杯的小室，离心杯是扇形石英的，可以上下透光，离心机中装有 一个光学系统，在整个离心期间都能通过紫外吸收或折射率的变化监测离心杯中沉降 着的物质，在预定的期间可以拍摄沉降物质的照片，在分析离心杯中物质沉降情况 时，在重颗粒和轻颗粒之间形成的界面就像一个折射的透镜，结果在检测系统的照像 底板上产生了一个“峰”，由于沉降不断进行，界面向前推进，因此峰也移动，从峰 移动的速度可以计算出样品颗粒的沉降速度。 分析性超速离心机和主要特点就是能在短时间内，用少量样品就可以得到一些重 要信息，能够确定生物大分子是否存在，其大致的含量，计算生物大分子的沉降系 数，结合界面扩散，估计分子的大小，检测分子的不均一性及混合物中各组份的比 例，测定生物大分子的分子量，还可以检测生物大分子的构象变化等。 5.3 制备性超速离心的分离方法： 1. 差速沉降离心法： 这是最普通的离心法。即采用逐渐增加离心速度或低速和高 速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批 分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。 差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在
定的离心时间内进行离心时,在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀,分出 的上清液在加大转速下再进行离心,又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和 较轻颗粒的上清液,如此多次离心处理,即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此 法所得的沉淀是不均一的,仍杂有其它成分,需经过2~3次的再悬浮和再离心,才能 得到较纯的颗粒。 此法主要由于组织匀浆液中分离细胞器和病毒,其优点是:操作简易,离心后用 倾倒法即可将上清液与沉淀分开,并可使用容量较大的角式转子。缺点是:须多次离 心,沉淀中有夹带,分离效果差,不能一次得到纯颗粒,沉淀于管底的颗粒受挤压, 容易变性失活。 2.密度梯度区带离心法(筒称区带离心法) 区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡,在一定的离 力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上,形成不同区带的分离方法。此法的优点 是:①分离效果好,可一次获得较纯颗粒:②适应范围广,能象差速离心法一样分离 具有沉降系数差的颗粒,又能分离有一定浮力密度差的颗粒:③颗粒不会挤压变形, 能保持颗粒活性,并防止已形成的区带由于对流而引起混合 此法的缺点是:①离心时间较长;②需要制备惰性梯度介质溶液:③操作严格, 不易掌握 密度梯度区带离心法又可分为两种: (1)差速区带离心法:当不同的颗粒间存在沉降速度差时(不需要像差速沉降 离心法所要求的那样大的沉降系数差)。在一定的离心力作用下,颗粒各自以一定的 速度沉降,在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。此法 仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒(20%的沉降系数差或更少)或分子量相差3倍 的蛋白质,与颗粒的密度无关,大小相同,密度不同的颗粒(如线粒体,溶酶体等) 不能用此法分离。 离心管先装好密度梯度介质溶液,样品液加在梯度介质的液面上,离心时,由 于离心力的作用,颗粒离开原样品层,按不同沉降速度向管底沉降,离心一定时间 后,沉降的颗粒逐渐分开,最后形成一系列界面清楚的不连续区带,沉降系数越大, 往下沉降越快,所呈现的区带也越低,离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结 東,样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液,其最大密度 和浓度可达1.28kg/cm3和60%
125 一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出 的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和 较轻颗粒的上清液，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此 法所得的沉淀是不均一的，仍杂有其它成分，需经过 2～3 次的再悬浮和再离心，才能 得到较纯的颗粒。 此法主要由于组织匀浆液中分离细胞器和病毒，其优点是：操作简易，离心后用 倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：须多次离 心，沉淀中有夹带，分离效果差，不能一次得到纯颗粒，沉淀于管底的颗粒受挤压， 容易变性失活。 2. 密度梯度区带离心法（简称区带离心法）： 区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离 心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法的优点 是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样分离 具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形， 能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格， 不易掌握。 密度梯度区带离心法又可分为两种： （1）差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降 离心法所要求的那样大的沉降系数差）。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的 速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。此法 仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差 3 倍 的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等） 不能用此法分离。 离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由 于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间 后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大， 往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结 束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度 和浓度可达 1.28 kg/cm3 和 60％
此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间 (2)等密度区带离心法:离心管中预先放置好梯度介质,样品加在梯度液面 上,或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管,通过离心形成梯度,这就是预形 成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式 离心时,样品的不同颗粒向上浮起,一直移动到与它们的密度相等的等密度点 的特定梯度位置上,形成几条不同的区带,这就是等密度离心法。体系到达平衡状态 后,再延长离心时间和提高转速已无意义,处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和 位置均不再受离心时间所影响,提高转速可以缩短达到平衡的时间,离心所需时间以 最小颗粒到达等密度点(即平衡点)的时间为基准,有时长达数日。 等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差,密度差越大,分离效 果越好,与颗粒大小和形状无关,但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带 宽度。 等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝CsCl,其密度可达1.7g/cm3。 此法可分离核酸、亚细胞器等,也可以分离复合蛋白质,但简单蛋白质不适用。 收集区带的方法有许多种,例如: (1)用注射器和滴管由离心管上部吸出。 (2)有针刺穿离心管底部滴出。 (3)用针刺穿离心管区带部份的管壁,把样品区带抽出 (4)用一根细管插入离心管底,泵入超过梯度介质最大密度的取代液,将样品 和梯度介质压出,用自动部分收集器收集。 5.4离心操作的注意事项 高速与超速离心机是生化实验教学和生化科研的重要精密设备,因其转速高,产 生的离心力大,使用不当或缺乏定期的检修和保养,都可能发生严重事故,因此使用 离心机时都必须严格遵守操作规程 1.使用各种离心机时,必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物,平衡 时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围,每个离心机不同的转头有各 自的允许差值,转头中绝对不能装载单数的管子,当转头只是部分装载时,管子必须 互相对称地放在转头中,以便使负载均匀地分布在转头的周围。 2.装载溶液时,要根据各种离心机的具体操作说明进行,根据待离心液体的性 质及体积选用适合的离心管,有的离心管无盖,液体不得装得过多,以防离心时甩
126 此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间 （2）等密度区带离心法：离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面 上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心形成梯度，这就是预形 成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。 离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点 的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度离心法。体系到达平衡状态 后，再延长离心时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和 位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以 最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。 等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效 果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带 宽度。 等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝 CSCl，其密度可达 1.7 g/cm3。 此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。 收集区带的方法有许多种，例如： （1） 用注射器和滴管由离心管上部吸出。 （2） 有针刺穿离心管底部滴出。 （3） 用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出。 （4）用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品 和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。 5.4 离心操作的注意事项： 高速与超速离心机是生化实验教学和生化科研的重要精密设备，因其转速高，产 生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用 离心机时都必须严格遵守操作规程。 1. 使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡 时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各 自的允许差值，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须 互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。 2. 装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性 质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩
出,造成转头不平衡、生锈或被腐蚀,而制备性超速离心机的离心管,则常常要求必 须将液体装满,以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。每次使用后,必须仔细检査 转头,及时清洗、擦干,转头是离心机中须重点保护的部件,搬动时要小心,不能碰 撞,避免造成伤痕,转头长时间不用时,要涂上一层上光腊保护,严禁使用显著变 形、损伤或老化的离心管 3.若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机 的转头室内预冷。 4.离心过程中不得随意离开,应随时观察离心机上的仪表是否正常工作,如有 异常的声音应立即停机检查,及时排除故障 5.每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时,使用转头时要查阅说明书, 不得过速使用。每一转头都要有一份使用档案,记录累积的使用时间,若超过了该转 头的最高使用限时,则须按规定降速使用
127 出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必 须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。每次使用后，必须仔细检查 转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰 撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护，严禁使用显著变 形、损伤或老化的离心管。 3. 若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机 的转头室内预冷。 4. 离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有 异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。 5. 每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书， 不得过速使用。每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转 头的最高使用限时，则须按规定降速使用
6分光光度技术 6.1基本原理 利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱,利用此吸收光谱对 物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法,称为分光光度法或分光光度技术,使 用的仪器称为分光光度计,这种分光光度计灵敏度高,测定速度快,应用范围广,其 中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。因此 本章重点讨论紫外/可见分光光度法的基本原理、仪器构造及其在生化领域中的应用 1.光谱: 光是电磁波,可用波长“”表示,电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所 组成,对于生物化学来说,最重要的波长区域是可见光和紫外光 光的波长是二个相邻的波峰之间的距离 光的传播是由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量“H”所构成。 A=C/v λ一—波长C——一光速V一频率,单位时间通过一个定点的波数。 光又可以看作是由具有能量的粒子所组成。这些粒子所具有的原能量“E”由下 式算出: H—普朗克常数(6.624×10-27尔格·秒) 频率 紫外区可分为紫外(近紫外)和真空紫外(远紫外)。由于吸收池(又称样品 池、比色杯等)和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光,因此常规紫外测定 集中在近紫外区,即200nm~400nm。可见光区为400nm~800nm 组成物质的分子均处于一定能态并不停地运动着,分子的运动可分为平动、转 动、振动和分子内电子的运动,每种运动状态都处于一定的能级,因此分子的能量可 以写成: E=E0+E平+E转+E握+E电 Eo是分子内在的不随分子运动而改变的能量,平动能E平只是温度的函数,因此 与光谱有关的能量变化是分子的转动能量、振动能量和分子的电子能量。 128
128 6 分光光度技术 6.1 基本原理 利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对 物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使 用的仪器称为分光光度计，这种分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其 中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。因此 本章重点讨论紫外/可见分光光度法的基本原理、仪器构造及其在生化领域中的应用 等。 1. 光谱： 光是电磁波，可用波长“λ”表示，电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所 组成，对于生物化学来说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。 光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。 光的传播是由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量“H”所构成。 λ＝C/ν λ——波长 C——光速 ν——频率，单位时间通过一个定点的波数。 光又可以看作是由具有能量的粒子所组成。这些粒子所具有的原能量“E”由下 式算出： E＝h·ν H——普朗克常数（ 6.624×10-27 尔格·秒） ν——频率 紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。由于吸收池（又称样品 池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于 190nm 波长的光，因此常规紫外测定 集中在近紫外区，即 200nm～400nm。可见光区为 400nm～800nm。 组成物质的分子均处于一定能态并不停地运动着，分子的运动可分为平动、转 动、振动和分子内电子的运动，每种运动状态都处于一定的能级，因此分子的能量可 以写成： E＝E0+E 平+E 转+E 振+E 电 E0 是分子内在的不随分子运动而改变的能量，平动能 E 平只是温度的函数，因此 与光谱有关的能量变化是分子的转动能量、振动能量和分子的电子能量
分子的每一种能量都有一系列的能级,能级不是任意的,而是具有量子化特征 的,通常分子处于基态,当它吸收一定能量跃迁到激发态,则产生吸收光谱。分子转 动、振动和电子能级的跃迁,相应地产生转动、振动及电子光谱。 按照量子力学原理,分子能态按一定的规律跳跃式地变化,物质在入射光的照 射下,分子吸收光时,其能量的增加是不连续的,物质只能吸收一定能量的光,吸收 光的频率和两个能级间的能量差要符合下列关系: E=E-E=h E1、E2分别表示初能态和终能态的能量,初能态与终能态之间的能量差愈大, 则所吸收的光的频率愈高(即波长愈短),反之则所吸收的光的频率愈低(即波长愈 长)。由于吸收是不连续的,因此在光的一定部位出现一系列吸收暗带。因为分子转 动、振动及电子能级跃迁的能量差别较大,因此,它们的吸收光谱出现在不同的光谱 区域。分子转动能级级差小,△E<0.05电子伏特(ev),分子转动光谱的吸收出现在 红外或微波区。振动能级纵间的差别较大,E=0.05~1.0cv,振动光谱出现在中红 外区。电子能级的级差更大,E=1~20ev,所以由电子跃迁得到的光谱出现在可 见、紫外或波长更短的光谱区。 可见光、紫外光吸收光谱,是由于分子中联系较松散的价电子被激发产生跃迁从 而吸收光辐射能量形成的,即分子由基态变为激发态,电子由一个低能级的轨道(即 成键轨道),吸收了光能量跃迁到高能级轨道(称为反键轨道)。 与吸收光谱有关的三种电子是: (1)二个原子的电子沿其对称方向相互形成的共价键(即单键),称σ键,构成 键的电子称0电子,如C-C、C-H键。 (2)平行于二个原子轨道形成的价键(即双键),称π键,形成π键的电子称为 π电子,如C=C键 (3)未共享成键的电子,称n电子。 各种电子跃迁所需能量大小的顺序是: n→*<Ⅱ→丌*≤n→0*<丌→0*<0→π*<0→0 紫外吸收光谱主要是由于双键电子,尤其是共轭双键中的π电子和未共享的电子 对的激发所产生的。所以各种物质分子对紫外光的吸光性质取决于该分子的双键数目 和未共享电子对的共轭情况等
129 分子的每一种能量都有一系列的能级，能级不是任意的，而是具有量子化特征 的，通常分子处于基态，当它吸收一定能量跃迁到激发态，则产生吸收光谱。分子转 动、振动和电子能级的跃迁，相应地产生转动、振动及电子光谱。 按照量子力学原理，分子能态按一定的规律跳跃式地变化，物质在入射光的照 射下，分子吸收光时，其能量的增加是不连续的，物质只能吸收一定能量的光，吸收 光的频率和两个能级间的能量差要符合下列关系： E＝E2- E1＝h E1、E2 分别表示初能态和终能态的能量，初能态与终能态之间的能量差愈大， 则所吸收的光的频率愈高（即波长愈短），反之则所吸收的光的频率愈低（即波长愈 长）。由于吸收是不连续的，因此在光的一定部位出现一系列吸收暗带。因为分子转 动、振动及电子能级跃迁的能量差别较大，因此，它们的吸收光谱出现在不同的光谱 区域。分子转动能级级差小，△E＜0.05 电子伏特（ev），分子转动光谱的吸收出现在 远红外或微波区。振动能级纵间的差别较大， E＝0.05～1.0 ev，振动光谱出现在中红 外区。电子能级的级差更大， E＝1～20 ev，所以由电子跃迁得到的光谱出现在可 见、紫外或波长更短的光谱区。 可见光、紫外光吸收光谱，是由于分子中联系较松散的价电子被激发产生跃迁从 而吸收光辐射能量形成的，即分子由基态变为激发态，电子由一个低能级的轨道（即 成键轨道），吸收了光能量跃迁到高能级轨道（称为反键轨道）。 与吸收光谱有关的三种电子是： ⑴ 二个原子的电子沿其对称方向相互形成的共价键（即单键），称σ 键， 构成 键的电子称 σ电子，如 C－C、C－H 键。 ⑵ 平行于二个原子轨道形成的价键（即双键），称π 键，形成π键的电子称为 π电子，如 C=C 键。 ⑶ 未共享成键的电子，称 n 电子。 各种电子跃迁所需能量大小的顺序是： n→π*＜π→π*≤ n→σ*＜π→σ*＜σ→π*＜σ→σ* 紫外吸收光谱主要是由于双键电子，尤其是共轭双键中的π电子和未共享的电子 对的激发所产生的。所以各种物质分子对紫外光的吸光性质取决于该分子的双键数目 和未共享电子对的共轭情况等