实验九酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 本实验为学生提供一个较全面的实践机会,学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶, 并对这种酶的性质,尤其是动力学性质作初步的研究 自1860年 Bertholet从酒酵母 Saccharomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来,它已 被广泛地进行了研究。蔗糖酶( Invertase)(β一D—呋喃果糖苷果糖水解酶) ( fructofuranoside fructohydrolase)(EC.3.21.26)特异地催化非还原糖中的α一呋喃果糖 苷键水解,具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖,也能催化棉子糖 水解,生成密二糖和果糖 本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内 侧,在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶( external yeast invertase),其活力占蔗糖酶 活力的大部分,是含有50%糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖
222 实验九 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶， 并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。 自 1860 年 Bertholet 从酒酵母 Sacchacomyces Cerevisiae 中发现了蔗糖酶以来，它已 被广泛地进行 了研究。蔗 糖酶（invertase）（ —D—呋 喃果糖苷果 糖水解酶） （fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的—呋喃果糖 苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖 水解，生成密二糖和果糖。 本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内 侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶 活力的大部分，是含有 50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖
酶( internal yeast invertase),含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基,二聚体, 两种形式的酶的氨基酸组成不同,外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸,Ser和Met,它 们的分子量也不同,外酶约为27万(或22万,与酵母的来源有关),内酶约为135万 尽管这两种酶在组成上有较大的差别,但其底物专一性和动力学性质仍十分相似,因此, 本实验未区分内酶与外酶,而且由于内酶含量很少,极难提取,本实验提取纯化的主要 是外酶 两种酶的性质对照表如下 名称 糖含 量 亚为蔗为棉等电最适稳定最适 糖的子糖点 温度 的K 范围 外27万50%双|26mM150 50|4.93.53.0 60℃ 酶(22万) mM ~5.5)75 内13.5|<3%双25mM|150 酶万 mM ~5.5)90 实验中,用测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖水解的速度,在给定 的实验条件下,每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的 活力单位数。 本实验共有九个分实验: 蔗糖酶的提取与部分纯化 、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 四、反应时间对产物形成的影响 五、pH对酶活性的影响和最适pH的测定 六、温度对酶活性的影响和反应活化能的测定 七、底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数K和最大反应速度V的测定 八、尿素(脲)抑制蔗糖酶的实验 九、棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验 (一)蔗糖酶的提取与部分纯化 实验目的: 学习酶的纯化方法,并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。 二、试剂 1.啤酒酵母 2.二氧化硅
223 酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体， 两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser 和 Met，它 们的分子量也不同，外酶约为 27 万(或 22 万，与酵母的来源有关)，内酶约为 13.5 万。 尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此， 本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要 是外酶。 两种酶的性质对照表如下： 名 称 MW 糖 含 量 亚基 底 物 为 蔗 糖 的 Km 底 物 为 棉 子 糖 的 Km 等 电 点 pI 最适 pH 稳定 pH 范围 最适 温度 外 酶 27 万 (22 万) 50% 双 26mM 150 mM 5.0 4.9(3.5 ～5.5) 3.0 ～ 7.5 60℃ 内 酶 13.5 万 ＜3% 双 25mM 150 mM 4.5(3.5 ～5.5) 6.0 ～ 9.0 实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定 的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的 活力单位数。 本实验共有九个分实验： 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 四、反应时间对产物形成的影响 五、pH 对酶活性的影响和最适 pH 的测定 六、温度对酶活性的影响和反应活化能的测定 七、底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数 Km和最大反应速度 Vmax 的测定 八、尿素（脲）抑制蔗糖酶的实验 九、棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验 （一） 蔗糖酶的提取与部分纯化 一、实验目的： 学习酶的纯化方法，并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。 二、试剂： 1. 啤酒酵母 2. 二氧化硅
3.甲苯(使用前预冷到0℃以下) 4.去离子水(使用前冷至4℃左右) 5.冰块、食盐 6.1N乙酸 7.95%乙醇 、仪器: 研钵1个 2.离心管3个 3.滴管3个 4.量筒50ml1个 5.水浴锅1个 6.恒温水浴 7.烧杯100m12个 8.广泛pH试纸 9.高速冷冻离心机 四、操作步骤: 1.提取 (1)准备一个冰浴,将研钵稳妥放入冰浴中。 (2)称取5g干啤酒酵母和20g湿啤酒酵母,称20mg蜗牛酶及适量(约10g)二氧 化硅,放入研钵中。二氧化硅要予先研细 (3)量取预冷的甲苯3om缓慢加入酵母中,边加边研磨成糊状,约需60分钟。研 磨时用显微镜检査硏磨的效果,至酵母细胞大部分硏碎。 (4)缓慢加入预冷的40ml去离子水,每次加2ml左右,边加边研磨,至少用30分 钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。 (5)将混合物转入两个离心管中,平衡后,用高速冷离心机离心,4℃,10000pm, omin。如果中间白色的脂肪层厚,说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。 (6)用滴管小心地取出脂肪层下面的水相,转入另一个清洁的离心管中,4℃, 1000pm,离心10min (7)将清液转入量筒,量出体积,留出1.5ml测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转 入清洁离心管中 (8)用广泛pH试纸检查清液pH,用1N乙酸将pH调至50,称为“粗级分I 2.热处理 (1)予先将恒温水浴调到50℃,将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中,50℃ 下保温30分钟,在保温过程中不断轻摇离心管。 (2)取出离心管,于冰浴中迅速冷却,用4℃,1000m,离心10min (3)将上清液转入量筒,量出体积,留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量(称为“热 级分II 3.乙醇沉淀 将热级分Ⅱ转入小烧杯中,放入冰盐浴(没有水的碎冰撒入少量食盐),逐滴加入
224 3. 甲苯（使用前预冷到 0℃以下） 4. 去离子水（使用前冷至 4℃左右） 5. 冰块、食盐 6. 1N 乙酸 7. 95%乙醇 三、仪器： 1. 研钵 1 个 2. 离心管 3 个 3. 滴管 3 个 4. 量筒 50ml 1 个 5. 水浴锅 1 个 6. 恒温水浴 7. 烧杯 100ml 2 个 8. 广泛 pH 试纸 9. 高速冷冻离心机 四、操作步骤： 1. 提取 （1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。 （2）称取 5g 干啤酒酵母和 20g 湿啤酒酵母，称 20mg 蜗牛酶及适量（约 10g）二氧 化硅，放入研钵中。二氧化硅要予先研细。 （3）量取预冷的甲苯 30ml 缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需 60 分钟。研 磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。 （4）缓慢加入预冷的 40ml 去离子水，每次加 2ml 左右，边加边研磨，至少用 30 分 钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。 （5）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心，4℃，10000rpm， 10min。如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。 （6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃， 10000rpm，离心 10min。 （7）将清液转入量筒，量出体积，留出 1.5ml 测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转 入清洁离心管中。 （8）用广泛 pH 试纸检查清液 pH，用 1N 乙酸将 pH 调至 5.0，称为“粗级分 I”。 2. 热处理 （1）予先将恒温水浴调到 50℃，将盛有粗级分 I 的离心管稳妥地放入水浴中，50℃ 下保温 30 分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。 （2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用 4℃，10000rpm，离心 10min。 （3）将上清液转入量筒，量出体积，留出 1.5ml 测定酶活力及蛋白质含量（称为“热 级分 II”）。 3. 乙醇沉淀 将热级分 II 转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入
等体积预冷至一20℃的95%乙醇,同时轻轻搅拌,共需30分钟,再在冰盐浴中放置10 分钟,以沉淀完全。于4℃,1000rpm,离心10min,倾去上清,并滴干,沉淀保存于 离心管中,盖上盖子或薄膜封口,然后将其放入冰箱中冷冻保存(称为“醇级分Ⅲ”) 废弃上清液之前,要用尿糖试纸检査其酶活性(于下一个实验一起做) (二)离子交换柱层析纯化蔗糖酶 、试剂 1.DEAE纤维素:DE-231.5克 2.0.5N NaOH 100ml 3.0.5N HCL 50ml 4.0.02mol/LpH7.3 Tris-HCI缓冲液250ml 5.0.02mol/LpH73(含0.2mol/L浓度NaCl)的 Tris-HCl缓冲液50ml 二、仪器 1.层析柱 2.部分收集器 3.磁力搅拌器及搅拌子 4.50m小烧杯2个 5.玻璃砂漏斗 6.真空泵与抽滤瓶 7.精密pH试纸或pH计 8.三通管 9.止水夹 10.吸耳球 11.塑料紫外比色杯 12.电导率仪 13.尿糖试纸 三、操作步骤 1.离子交换剂的处理 称取15克DEAE纤维素(DE-23)干粉,加入0.5 mol/L Naoh溶液(约50ml), 轻轻搅拌,浸泡至少0.5小时(不超过1小时),用玻璃砂漏斗抽滤,并用去离子水洗至 近中性,抽干后,放入小烧杯中,加50m10.5 Mol/L HCI,搅匀,浸泡05小时,同上 用去离子水洗至近中性,再用0.5mo/ L NaOh重复处理一次,用去离子水洗至近中性后 抽干备用。(因DEAE纤维素昂贵,用后务必回收)。实际操作时,通常纤维素是已浸泡 过回收的,按“碱→酸”的顺序洗即可,因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过 滤困难,可以先浮选除去细颗粒,抽干后用05 mol/L NaOH-0.5 mol/L NaCI溶液处理, 然后水洗至中性 2.装柱与平衡
225 等体积预冷至－20℃的 95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需 30 分钟，再在冰盐浴中放置 10 分钟，以沉淀完全。于 4℃，10000rpm，离心 10min，倾去上清，并滴干，沉淀保存于 离心管中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“醇级分Ⅲ”）。 废弃上清液之前，要用尿糖试纸检查其酶活性（于下一个实验一起做）。 （二）离子交换柱层析纯化蔗糖酶 一、试剂 1. DEAE 纤维素：DE-23 1.5 克 2. 0.5N NaOH 100ml 3. 0.5 N HCL 50ml 4. 0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液 250ml 5. 0.02 mol/L pH7.3（含 0.2 mol/L 浓度 NaCl）的 Tris-HCl 缓冲液 50ml 二、仪器 1. 层析柱 2. 部分收集器 3. 磁力搅拌器及搅拌子 4. 50ml 小烧杯 2 个 5. 玻璃砂漏斗 6. 真空泵与抽滤瓶 7. 精密 pH 试纸或 pH 计 8. 三通管 9. 止水夹 10. 吸耳球 11. 塑料紫外比色杯 12. 电导率仪 13. 尿糖试纸 14. 点滴板 三、操作步骤 1. 离子交换剂的处理： 称取 1.5 克 DEAE 纤维素（DE-23）干粉，加入 0.5mol/L NaOH 溶液（约 50ml）， 轻轻搅拌，浸泡至少 0.5 小时（不超过 1 小时），用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至 近中性，抽干后，放入小烧杯中，加 50ml 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸泡 0.5 小时，同上， 用去离子水洗至近中性，再用 0.5 mol/L NaOH 重复处理一次，用去离子水洗至近中性后， 抽干备用。（因 DEAE 纤维素昂贵，用后务必回收）。实际操作时，通常纤维素是已浸泡 过回收的，按“碱→酸”的顺序洗即可，因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过 滤困难，可以先浮选除去细颗粒，抽干后用 0.5 mol/L NaOH－0.5 mol/L NaCl 溶液处理， 然后水洗至中性。 2. 装柱与平衡：
先将层析柱垂直装好,在烧杯内用002 mol/L pH7.3 Tris-HCI缓冲液洗纤维素几 次,用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱,然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率 与缓冲液相同或接近时即可上样 3.上样与洗脱: 上样前先准备好梯度洗脱液,本实验采用20ml0.02MpH7.3的 Tris-HCI缓冲液和 20ml含02M浓度NaCl的0.02 mol/L pH73的 Tris-HCI缓冲液,进行线性梯度洗脱。取 两个相同直径的50ml小烧杯,一个装20m含NaCl的高离子强度溶液,另一个装入20ml 低离子强度溶液,放在磁力搅拌器上,在低离子强度溶液的烧杯内放入一个小搅拌子(在 细塑料管内放入一小段铁丝,两端用酒精灯加热封口),将此烧杯置于搅拌器旋转磁铁 的上方。将玻璃三通插入两个烧杯中,上端接一段乳胶管,夹上止水夹,用吸耳球小心 地将溶液吸入三通(轻轻松一下止水夹),立即夹紧乳胶管,使两烧杯溶液形成连通, 注意两个烧杯要放妥善,切勿使一杯高、一杯低 用5ml0.02 mol/L pH7.3的 Tris-HCI缓冲液充分溶解醇级分Ⅲ,(注意玻璃搅棒头必 须烧园、搅拌溶解时不可将离心管划伤),若溶液混浊,则用小试管,400opm离心除 去不溶物。取1.5m上清液(即醇级分Ⅲ样品,留待下一个实验测酶活力及蛋白含量), 将剩余的35m清液小心地加到层析柱上,不要扰动柱床,注意要从上样开始使用部分 收集器收集,每管2.5~30mJl0min。上样后用缓冲液洗两次,然后再用约20m缓冲液 洗去柱中未吸附的蛋白质,至A280降到0.1以下,夹住层析柱出口,将恒流泵入口的细 塑料导管放入不含NaCl的低离子强度溶液的小烧杯中,用胶布固定塑料管,接好层析 柱,打开磁力搅拌器,放开层析柱出口,开始梯度洗脱,连续收集洗脱液,两个小烧杯 中的洗脱液用尽后,为洗脱充分,也可将所配制的剩余30ml高离子强度洗脱液倒入小 烧杯继续洗脱,控制流速2.5~3,0 ml/10min。 测定每管洗脱液的A280光吸收值和电导率。(使用DJS-10电导电极) 测定不含NaCl的0.02 mol/L pH73 Tris-HCI缓冲液和含0.2moL浓度NaCl的 0.02mol/Lph73 Tris-HCI缓冲液的电导率,用电导率与NaCl浓度作图,利用此图将每 管所测电导率换算成NaCl浓度,并利用此曲线估计出蔗糖酶活性峰洗出时的NaCl浓度 4.各管洗脱液酶活力的定性测定 在点滴板上每一孔内,加一滴02 mol/L pH49的乙酸缓冲液,一滴0.5moL蔗糖和 滴洗脱液,反应5分钟,在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸,10~20mi后观察试 纸颜色的变化。用“+”号的数目,表示颜色的深浅,即各管酶活力的大小。合并活性 最高的2~3管,量出总体积,并将其分成10份,分别倒入10个小试管,用保鲜膜封口, 冰冻保存,使用时取出一管。此即“柱级分IV”。 注意:从上样开始收集,可能有两个活性峰,梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附 物,本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰 在同一张图上画出所有管的酶活力,NaCl浓度(可用电导率代替)和光吸收值A280 的曲线和洗脱梯度线
226 先将层析柱垂直装好，在烧杯内用 0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液洗纤维素几 次，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率 与缓冲液相同或接近时即可上样。 3. 上样与洗脱： 上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采用 20ml 0.02M pH7.3 的 Tris-HCl 缓冲液和 20ml 含 0.2M 浓度 NaCl 的 0.02mol/L pH7.3 的 Tris-HCl 缓冲液，进行线性梯度洗脱。取 两个相同直径的 50ml 小烧杯，一个装 20ml 含 NaCl 的高离子强度溶液，另一个装入 20ml 低离子强度溶液，放在磁力搅拌器上，在低离子强度溶液的烧杯内放入一个小搅拌子（在 细塑料管内放入一小段铁丝，两端用酒精灯加热封口），将此烧杯置于搅拌器旋转磁铁 的上方。将玻璃三通插入两个烧杯中，上端接一段乳胶管，夹上止水夹，用吸耳球小心 地将溶液吸入三通（轻轻松一下止水夹），立即夹紧乳胶管，使两烧杯溶液形成连通， 注意两个烧杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。 用 5ml 0.02mol/L pH7.3 的 Tris-HCl 缓冲液充分溶解醇级分Ⅲ，（注意玻璃搅棒头必 须烧园、搅拌溶解时不可将离心管划伤），若溶液混浊，则用小试管，4000rpm 离心除 去不溶物。取 1.5ml 上清液（即醇级分Ⅲ样品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含量）， 将剩余的 3.5ml 清液小心地加到层析柱上，不要扰动柱床，注意要从上样开始使用部分 收集器收集，每管 2.5~3.0ml/10min。上样后用缓冲液洗两次，然后再用约 20ml 缓冲液 洗去柱中未吸附的蛋白质，至 A280 降到 0.1 以下，夹住层析柱出口，将恒流泵入口的细 塑料导管放入不含 NaCl 的低离子强度溶液的小烧杯中，用胶布固定塑料管，接好层析 柱，打开磁力搅拌器，放开层析柱出口，开始梯度洗脱，连续收集洗脱液，两个小烧杯 中的洗脱液用尽后，为洗脱充分，也可将所配制的剩余 30ml 高离子强度洗脱液倒入小 烧杯继续洗脱，控制流速 2.5~3.0ml/10min。 测定每管洗脱液的 A280 光吸收值和电导率。（使用 DJS-10 电导电极） 测定不含 NaCl 的 0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl 缓冲液和含 0.2mol/L 浓度 NaCl 的 0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl 缓冲液的电导率，用电导率与 NaCl 浓度作图，利用此图将每 管所测电导率换算成NaCl浓度，并利用此曲线估计出蔗糖酶活性峰洗出时的NaCl浓度。 4. 各管洗脱液酶活力的定性测定 在点滴板上每一孔内，加一滴 0.2mol/L pH4.9 的乙酸缓冲液，一滴 0.5mol/L 蔗糖和 一滴洗脱液，反应 5 分钟，在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸，10～20min 后观察试 纸颜色的变化。用“+”号的数目，表示颜色的深浅，即各管酶活力的大小。合并活性 最高的 2~3 管，量出总体积，并将其分成 10 份，分别倒入 10 个小试管，用保鲜膜封口， 冰冻保存，使用时取出一管。此即“柱级分 IV”。 注意：从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附 物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。 在同一张图上画出所有管的酶活力，NaCl 浓度（可用电导率代替）和光吸收值 A280 的曲线和洗脱梯度线
(三)蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 、实验目的 掌握蔗糖酶活性测定方法,了解各级分酶的纯化情况 、原理 为了评价酶的纯化步骤和方法,必须测定各级分酶活性和比活 测定蔗糖酶活性的方法有许多种,如费林试剂法、 Nelson's试剂法、水杨酸试剂法 等,本实验先使用费林试剂法,以后测米氏常数Km和最大反应速度Vm时再用 Nelson’s 试剂法。 费林试剂法灵敏度较高,但数据波动较大,因为反应后溶液的颜色随时间会有变化, 因此加样和测定光吸收值时最好能计时。其原理是在酸性条件下,蔗糖酶催化蔗糖水解, 生成一分子葡萄糖和一分子果糖。这些具有还原性的糖与碱性铜试剂混合加热后被氧 化,二价铜被还原成棕红色氧化亚铜沉淀,氧化亚铜与磷钼酸作用,生成兰色溶液,其 兰色深度与还原糖的量成正比,于650nm测定光吸收值。 三、试剂 1.碱性铜试剂(用毕回收) 称10g无水NaCO3,加入100ml去离子水溶解,另称1.88g酒石酸,用100m去离 子水溶解,混合二溶液,再加入1.13克结晶 CuSo,溶解后定容到250ml 2.磷钼酸试剂(用毕回收) 在烧杯内加入钼酸175g,钨酸钠25g,10%NaOH100ml,去离子水10ml,混合 后煮沸约30min(小心不要蒸干),驱去钼酸中存在的氨,直到无氨味为止,冷却后加 85%磷酸63ml,混合并稀释到250ml。 3.025%苯甲酸200m,配葡萄糖用,防止时间长溶液长菌,也可以用去离子水代替 4.葡萄糖标准溶液: (1)贮液:精确称取无水葡萄糖(应在105℃恒重过)0.1802克,以0.25%苯甲酸溶 液溶解后,定容到100ml容量瓶中(浓度10 mmol/L)。 (2)操作溶液:用移液管取贮液10m,置于50m容量瓶中,以用0.25%苯甲酸或去 离子水稀释至刻度(浓度为2mmo/L)。 5.0molL蔗糖溶液5om,分装于小试管中冰冻保存,因蔗糖极易水解,用时取出一 管化冻后摇匀 6.0.2moL乙酸缓冲液,pH49,200ml 7.牛血清清蛋白标准蛋白质溶液(浓度范围:200~50oμg/ml,精确配制50ml)。 8.考马斯亮兰G-250染料试剂,100mg考马斯亮兰G-250全溶于50ml95%乙醇后, 加入120ml85%磷酸,用去离子水稀释到1L(公用) 四、仪器 1.试管20支,试管架1个 2.秒表1块,或用手表。 3.移液管:0.1、0.2、2.0、50ml
227 （三）蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 一、实验目的 掌握蔗糖酶活性测定方法，了解各级分酶的纯化情况。 二、原理 为了评价酶的纯化步骤和方法，必须测定各级分酶活性和比活。 测定蔗糖酶活性的方法有许多种，如费林试剂法、Nelson’s 试剂法、水杨酸试剂法 等，本实验先使用费林试剂法，以后测米氏常数 Km和最大反应速度 Vmax 时再用 Nelson’s 试剂法。 费林试剂法灵敏度较高，但数据波动较大，因为反应后溶液的颜色随时间会有变化， 因此加样和测定光吸收值时最好能计时。其原理是在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解， 生成一分子葡萄糖和一分子果糖。这些具有还原性的糖与碱性铜试剂混合加热后被氧 化，二价铜被还原成棕红色氧化亚铜沉淀，氧化亚铜与磷钼酸作用，生成兰色溶液，其 兰色深度与还原糖的量成正比，于 650nm 测定光吸收值。 三、试剂 1. 碱性铜试剂（用毕回收） 称 10g 无水 NaCO3 ,加入 100ml 去离子水溶解，另称 1.88g 酒石酸，用 100ml 去离 子水溶解，混合二溶液，再加入 1.13 克结晶 CuSO4，溶解后定容到 250ml。 2. 磷钼酸试剂（用毕回收） 在烧杯内加入钼酸 17.5g，钨酸钠 2.5g，10% NaOH 100ml, 去离子水 100ml，混合 后煮沸约 30min（小心不要蒸干），驱去钼酸中存在的氨，直到无氨味为止，冷却后加 85%磷酸 63ml,混合并稀释到 250ml。 3. 0.25%苯甲酸 200ml，配葡萄糖用，防止时间长溶液长菌，也可以用去离子水代替。 4. 葡萄糖标准溶液： （1）贮液：精确称取无水葡萄糖（应在 105℃恒重过）0.1802 克，以 0.25%苯甲酸溶 液溶解后，定容到 100ml 容量瓶中（浓度 10mmol/L）。 （2）操作溶液：用移液管取贮液 10ml，置于 50ml 容量瓶中，以用 0.25%苯甲酸或去 离子水稀释至刻度（浓度为 2mmol/L）。 5. 0.2mol/L 蔗糖溶液 50ml，分装于小试管中冰冻保存，因蔗糖极易水解，用时取出一 管化冻后摇匀。 6. 0.2mol/L 乙酸缓冲液，pH4.9，200ml。 7. 牛血清清蛋白标准蛋白质溶液（浓度范围：200～500g/ml，精确配制 50ml）。 8. 考马斯亮兰 G-250 染料试剂，100mg 考马斯亮兰 G-250 全溶于 50ml 95%乙醇后， 加入 120ml 85%磷酸，用去离子水稀释到 1L（公用）。 四、仪器 1. 试管 20 支，试管架 1 个 2. 秒表 1 块，或用手表。 3. 移液管：0.1、0.2、2.0、5.0ml
4.塑料可见比色杯(杯上和器皿染色后可用少量95%的乙醇荡洗) 5.水浴锅 6.电炉 7.保鲜膜 8.橡皮筋 五、各级分蛋白质含量的测定 采用考马斯亮兰染料法( Bradford法)的微量法测定蛋白质含量,参见实验-“蛋 白质含量的测定法”(因Tris会干扰 Lowry法的测定)。标准蛋白的取样量为0.1、02 03、04、0.5、0.6、0.8、1.0ml,用去离子水补足到1.0ml 各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数,并详细记录稀释倍数的计算(使用移液 管和量筒稀释)。下列稀释倍数仅供参考: 粗级分I:10~50倍 热级分Ⅱ:10~50倍 醇级分Ⅲ10~50倍 柱级分IV:不稀释 确定了稀释倍数后,每个级分取3个不同体积的样进行测定,然后取平均值,计算 出各级分蛋白质浓度 六、级分I、II、III蔗糖酶活性测定 用002 mol/L pH49乙酸缓冲液(也可以用pH~6的去离子水代替)稀释各级分酶 液,试测出测酶活合适的稀释倍数 1000~10000倍 Il:1000~10000倍 1000~10000倍 以上稀释倍数仅供参考。 按“表1”的顺序在试管中加入各试剂,进行测定,为简化操作可取消保鲜膜封口 沸水浴加热改为用90~95℃水浴加热8~10min 七、柱级分ⅣV酶活力的测定 1.酶活力的测定参照“表1”设计一个表格,反应混合物仍为lmls 2.第1管仍为蔗糖对照,9、10管为葡萄糖的空白与标准,与“表1”中的1l、12 管相同。 3.2~7管加入柱级分IV(取样前先试测出合适的稀释倍数),分别为002ml、005ml 0.1ml、0.2ml、0.4ml和0.6ml,然后各加0.2m乙酸缓冲液(02 mol/L pH49),每管用 去离子水补充到08ml 4!.1-7管各加入02ml02mol/L的蔗糖,每管由加入蔗糖开始计时,室温下准确反应 l0min,立即加入lml碱性铜试剂中止反应,然后按“表1”中的步骤进行测定 5.第8管为θ时间对照,与第7管相同,只是在加入02m蔗糖之前,先加入碱性铜 试剂,防止酶解作用。此管只用于观察,不进行计算 6.计算柱级分IV的酶活力: Units/ml原始溶液。 7.以每分钟生成的还原糖的μmoes数为纵座标,以试管中1m反应混合物中的酶浓
228 4. 塑料可见比色杯（杯上和器皿染色后可用少量 95% 的乙醇荡洗） 5. 水浴锅 6. 电炉 7. 保鲜膜 8. 橡皮筋 五、各级分蛋白质含量的测定 采用考马斯亮兰染料法（Bradford 法）的微量法测定蛋白质含量，参见 实验－“蛋 白质含量的测定法”（因 Tris 会干扰 Lowry 法的测定）。标准蛋白的取样量为 0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0ml，用去离子水补足到 1.0ml。 各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数，并详细记录稀释倍数的计算（使用移液 管和量筒稀释）。下列稀释倍数仅供参考： 粗级分 I： 10～50 倍 热级分 II： 10～50 倍 醇级分 III： 10～50 倍 柱级分 IV： 不稀释 确定了稀释倍数后，每个级分取 3 个不同体积的样进行测定，然后取平均值，计算 出各级分蛋白质浓度。 六、级分 I、II、III 蔗糖酶活性测定 用 0.02mol/L pH4.9 乙酸缓冲液（也可以用 pH5～6 的去离子水代替）稀释各级分酶 液，试测出测酶活合适的稀释倍数： I ： 1000～10000 倍 II ： 1000～10000 倍 III ： 1000～10000 倍 以上稀释倍数仅供参考。 按“表 1”的顺序在试管中加入各试剂，进行测定，为简化操作可取消保鲜膜封口， 沸水浴加热改为用 90～95℃水浴加热 8～10min。 七、柱级分 IV 酶活力的测定 1. 酶活力的测定参照“表 1”设计一个表格，反应混合物仍为 1ml。 2. 第 1 管仍为蔗糖对照，9、10 管为葡萄糖的空白与标准，与“表 1”中的 11、12 管相同。 3. 2～7 管加入柱级分 IV（取样前先试测出合适的稀释倍数），分别为 0.02 ml、0.05 ml、 0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml 和 0.6ml，然后各加 0.2ml 乙酸缓冲液（0.2mol/L pH4.9），每管用 去离子水补充到 0.8ml。 4. 1~7 管各加入 0.2 ml 0.2mol/L 的蔗糖，每管由加入蔗糖开始计时，室温下准确反应 10min，立即加入 1ml 碱性铜试剂中止反应，然后按“表 1”中的步骤进行测定。 5. 第 8 管为 0 时间对照，与第 7 管相同，只是在加入 0.2ml 蔗糖之前，先加入碱性铜 试剂，防止酶解作用。此管只用于观察，不进行计算。 6. 计算柱级分 IV 的酶活力： Units / ml 原始溶液。 7. 以每分钟生成的还原糖的moles 数为纵座标，以试管中 1ml 反应混合物中的酶浓
度(mg蛋白/m)为横座标,画出反应速度与酶浓度的关系曲线 表1级分I、Ⅱ、Ⅲ的酶活力测定 各管名称 对照粗级分1 热级分Ⅱ 醇级分Ⅲ葡萄糖 管数→ 101 酶液(m) 000050200500050200500050200.507 060550400.10050200100550400.101008 乙酸缓冲液 0.20.20.20.2020.20.20.20.20.2/ 蔗糖0.2moL 0.20.20.20.2020.20.20.20.20.2/ 加入蔗糖,立即摇匀开始计时,室温准确反应10min后,立即加碱性铜 试剂中止反应。 碱性铜试剂 01.01.01.01.01.01.01.01.01.0 用保鲜膜封口,扎眼,沸水浴加热8mm,立即用自来水冷却。 磷钼酸试剂 1.01.01.01.01010101.01.01.01.01.0 5.0505.0505.05.05.05.0505.0505.0 u mol/min·ml Units/ml原始组 稀释后酶液的活力(按还原糖计算): A650×0.2×2 H moles E A650×10× b min x ml 式中:A650—第2~10管所测A50 A‘650—第12管所测A650 第12管葡萄糖取样量 标准葡萄糖浓度2mmoL=2μ mol/ml 10—反应10min B——每管加入酶液ml数 原始酶液的酶活力E=(平均E'/2)×稀释倍数( Units/ml原始组分) 八、计算各级分的比活力,纯化倍数及回收率,并将数据列于下表: 为了测定和计算下面纯化表中的各项数据,对各个级分都必须取样,每取一次样 对于下一级分来说会损失一部分量,因而要对下一个级分的体积进行校正,以使回收率 的计算不致受到不利的影响
229 度（mg 蛋白/ml）为横座标，画出反应速度与酶浓度的关系曲线。 表 1 级分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的酶活力测定 各管名称→ 对照 粗级分Ⅰ 热级分Ⅱ 醇级分Ⅲ 葡萄糖 管数→ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 酶液(ml) 0.0 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 / / H2O(ml) 0.6 0.55 0.40 0.10 0.05 0.20 0.10 0.55 0.40 0.10 1.0 0.8 乙酸缓冲液 (0.2mol/L pH4.9) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / 葡萄糖 2mmol/L / / / / / / / / / / / 0.2 蔗糖 0.2mol/L 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / 加入蔗糖，立即摇匀开始计时，室温准确反应 10min 后，立即加碱性铜 试剂中止反应。 碱性铜试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 用保鲜膜封口，扎眼，沸水浴加热 8min，立即用自来水冷却。 磷钼酸试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 H2O 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 A650nm E’=μmol/min·ml 平均 E’ μmol/min·ml Units/ml 原 始 组 分 稀释后酶液的活力(按还原糖计算)： 式中： A650 ──第 2~10 管所测 A650 A’650──第 12 管所测 A650 0.2 ── 第 12 管葡萄糖取样量 2 ── 标准葡萄糖浓度 2mmol/L = 2μmol/ml 10 ──反应 10min B ──每管加入酶液 ml 数 原始酶液的酶活力 E = (平均 E’/2)×稀释倍数（Units / ml 原始组分） 八、计算各级分的比活力，纯化倍数及回收率，并将数据列于下表： 为了测定和计算下面纯化表中的各项数据，对各个级分都必须取样，每取一次样， 对于下一级分来说会损失一部分量，因而要对下一个级分的体积进行校正，以使回收率 的计算不致受到不利的影响。 ） μ（ ml moles A B A E = ' 10 min 0.2 2 ' 650 650
酶的纯化表如下 级记录校正蛋白质总蛋白U总比活|纯化回 分体积体积(mgm)(mg) Un倍数收 (ml)(ml) g 1.01 Il [注]:一个酶活力单位Unts,是在给定的实验条件下,每分钟能催化 humble蔗糖水 解所需的酶量,而水解lμmole蔗糖则生成2μ moles还原糖,计算时请注意 下面是对假定的各级分记录体积进行校正计算的方法和结果: 记录体积 取样体积校正后体积 级分 核正体积计算 1.5 15.00 13.5×(15/13.5) Ⅲ 5×(15/135)×(13.5/12) 15 6.25 ⅣV 6 6×(15/135)×(13.5/12)×(5/3.5) 10.71 (四)反应时间对产物形成的影响 酶的动力学性质分析,是酶学研究的重要方面。下面将通过一系列实验,研究pH 温度和不同的抑制剂对蔗糖酶活性的影响,测定蔗糖酶的最适pH、最适温度、蔗糖酶 230
230 酶的纯化表如下： 级 分 记录 体积 (ml) 校 正 体积 (ml) 蛋白质 (mg/ml) 总蛋白 (mg) Units/ ml 总 Units 比活 Units/ mg 纯 化 倍数 回 收 率% Ⅰ 1.0 100 Ⅱ Ⅲ Ⅳ ［注］：一个酶活力单位 Units，是在给定的实验条件下，每分钟能催化 1mole 蔗糖水 解所需的酶量，而水解 1mole 蔗糖则生成 2moles 还原糖，计算时请注意。 下面是对假定的各级分记录体积进行校正计算的方法和结果： 级分 记录体积 ml 核正体积计算 取样体积 ml 校正后体积 ml Ⅰ 15 15 1.5 15.00 Ⅱ 13.5 13.5×(15/13.5) 1.5 15.00 Ⅲ 5 5×(15/13.5)×(13.5/12) 1.5 6.25 Ⅳ 6 6×(15/13.5)×(13.5/12)×(5/3.5 ) ── 10.71 （四） 反应时间对产物形成的影响 酶的动力学性质分析，是酶学研究的重要方面。下面将通过一系列实验，研究 pH、 温度和不同的抑制剂对蔗糖酶活性的影响，测定蔗糖酶的最适 pH、最适温度、蔗糖酶
催化反应的活化能,测定米氏常数Km、最大反应速度Vmax和各种抑制剂常数K1,由 此掌握酶动力学性质分析的一般实验方法 本实验是以蔗糖为底物,测定蔗糖酶与底物反应的时间进程曲线,即在酶反应的最 适条件下,每间隔一定的时间测定产物的生成量,然后以酶反应时间为横座标,产物生 成量为纵座标,画出酶反应的时间进程曲线,由该曲线可以看出,曲线的起始部分在某 段时间范围内呈直线,其斜率代表酶反应的初速度。随着反应时间的延长,曲线斜率 不断减小,说明反应速度逐渐降低,这可能是因为底物浓度降低和产物浓度增高而使逆 反应加强等原因所致,因此测定准确的酶活力,必须在进程曲线的初速度时间范围内进 行,测定这一曲线和初速度的时间范围,是酶动力学性质分析中的组成部分和实验基础。 实验方法见“表2”: 1.准备12支试管,按“表2”进行测定。用反应时间为0的第一管作空白对照,此 试管要先加碱性铜试剂后加酶。第10支试管是校正蔗糖的酸水解。用第11管作为对照, 测定第12管葡萄糖标准的光吸收值,用以计算第2~9各测定管所生成还原糖的 “μ umoles”数 2.“表2”中底物蔗糖的量为每管0.25μ moles,全部反应后可产生0.5 umoles的还原 糖,所有的蔗糖和酶浓度应使底物在20min内基本反应完。 3.画出生成的还原糖的μ moles数(即产物浓度 umoles/m)与反应时间的关系曲线, 即反应的时间进程曲线,求出反应的初速度。 表2反应时间对产物浓度的影响 匚管数→ 25mm0L蔗糖|01010101010101010101 乙酸缓冲液 0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2/ H,O 0404040404040404040.71.008 葡萄糖2 mmol/L|/7 //0. 减性铜试剂 由加酶开始计时 蔗糖酶(-1:5)0.30.30.30.30.30.30.30.30.377 应时间min0134812203040 反应到时后立即向“2~12”管加入lml碱性铜试剂中止反应 碱性铜试剂 /1010101010101010101010 盖薄膜,扎孔,沸水浴上煮8min后速冷 磷钼酸试剂1.01.01.010101.0101.0101.01.010 HO 505050505050505050505050 测定A650 生成还原糖的 oles数
231 催化反应的活化能，测定米氏常数 Km、最大反应速度 Vmax 和各种抑制剂常数 KI ，由 此掌握酶动力学性质分析的一般实验方法。 本实验是以蔗糖为底物，测定蔗糖酶与底物反应的时间进程曲线，即在酶反应的最 适条件下，每间隔一定的时间测定产物的生成量，然后以酶反应时间为横座标，产物生 成量为纵座标，画出酶反应的时间进程曲线，由该曲线可以看出，曲线的起始部分在某 一段时间范围内呈直线，其斜率代表酶反应的初速度。随着反应时间的延长，曲线斜率 不断减小，说明反应速度逐渐降低，这可能是因为底物浓度降低和产物浓度增高而使逆 反应加强等原因所致，因此测定准确的酶活力，必须在进程曲线的初速度时间范围内进 行，测定这一曲线和初速度的时间范围，是酶动力学性质分析中的组成部分和实验基础。 实验方法见“表 2”： 1. 准备 12 支试管，按“表 2”进行测定。用反应时间为 0 的第一管作空白对照，此 试管要先加碱性铜试剂后加酶。第 10 支试管是校正蔗糖的酸水解。用第 11 管作为对照， 测定第 12 管葡萄糖标准的光吸收值，用以计算第 2～9 各测定管所生成还原糖的 “moles”数。 2. “表 2”中底物蔗糖的量为每管 0.25 moles，全部反应后可产生 0.5moles 的还原 糖，所有的蔗糖和酶浓度应使底物在 20min 内基本反应完。 3. 画出生成的还原糖的moles 数（即产物浓度moles/ml）与反应时间的关系曲线， 即反应的时间进程曲线，求出反应的初速度。 表 2 反应时间对产物浓度的影响 管数→ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2.5mmol/L 蔗糖 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 / / 乙酸缓冲液 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / H2O 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.7 1.0 0.8 葡萄糖 2mmol/L / / / / / / / / / / / 0.2 碱性铜试剂 1.0 / / / / / / / / / / / 由加酶开始计时 蔗糖酶(~1:5) 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 / / / 反应时间 min 0 1 3 4 8 12 20 30 40 反应到时后立即向“2～12”管加入 1ml 碱性铜试剂中止反应 碱性铜试剂 / 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 盖薄膜，扎孔，沸水浴上煮 8min 后速冷 磷钼酸试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 H2O 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 测定 A650 生成还原糖的 moles 数