实验五小牛胸腺DNA的制备 、实验目的 了解DNA的存在状态,增加感性认识。 2.掌握DNA的制备方法以及细胞分级,细胞核制备,细胞膜裂解和解离DNA-蛋白 复合体(DNP)的技术 3.学习用紫外分光光度计测定DNA含量的方法。 实验原理 核酸是重要的生物大分子。在细胞核内,核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合 物,即以脱氧核糖核蛋白(DNP)和核糖核蛋白(RNP)的形式存在。因此,在提取和 制备DNA时,首先必须设法将这两类核蛋白分开。 在不同浓度的盐溶液中,RNP与DNP的溶解度有很大的差别。在低浓度的NaCl 溶液中,DNP的溶解度随着NaCl浓度的增加而逐渐下降,当NaCl浓度为0.14mo/时, DNP的溶解度仅为其在纯水中溶解度的1%,而当NaCl浓度继续增加时,DNP的溶解 度又渐次增大,当NaCl浓度增至0.5molL时,DNP的溶解度约与其在纯水中的溶解度 近似,当NaCl浓度继续增加至1.0mol/L时,DNP的溶解度约为其在纯水中的溶解度的 两倍,且随着盐浓度的上升,其溶解度仍继续呈增大的趋势。但RNP则与之不同,在 0.14mol/L的盐溶液中,DNP溶解度很低,而RNP的溶解度仍相当大,因此,通常采用 14molL的盐溶液来除去RNP,使DNP仍保持在沉淀中,然后使用浓盐溶液(1.7moL 浓度以上的NaC1)来提取DNP。 提取出DNA-蛋白质复合体(DNP)后,还必须将其中的蛋白质除去,因此,提取 纯化DNA要经过以下四个步骤 1.制备细胞核 2.裂解细胞核; 3.解离DNA一蛋白质复合体 4.从可溶性物质中分离出DNA 小牛胸腺、猪脾、鱼精子和植物种子的胚胎等生物材料,细胞核含量比例大,因而 含有丰富的DNA,是提取DNA的好材料。本实验以小牛胸腺或猪脾为材料。小牛胸腺 不仅DNA含最高,而且其脱氧核糖核酸酶( DNase)的活性较低,在制备过程中由此酶 所引起的DNA降解损失也较小。为了防止 DNase的作用,在用于提取的缓冲液中均含 有 lmmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸)螫合剂,以除去保持 DNase活性所必须的Mg++
203 实验五 小牛胸腺 DNA 的制备 一、实验目的 1. 了解 DNA 的存在状态，增加感性认识。 2. 掌握 DNA 的制备方法以及细胞分级，细胞核制备，细胞膜裂解和解离 DNA-蛋白 复合体（DNP）的技术。 3. 学习用紫外分光光度计测定 DNA 含量的方法。 二、实验原理 核酸是重要的生物大分子。在细胞核内，核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合 物，即以脱氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在。因此，在提取和 制备 DNA 时，首先必须设法将这两类核蛋白分开。 在不同浓度的盐溶液中，RNP 与 DNP 的溶解度有很大的差别。在低浓度的 NaCl 溶液中，DNP 的溶解度随着 NaCl 浓度的增加而逐渐下降，当 NaCl 浓度为 0.14mol/L 时， DNP 的溶解度仅为其在纯水中溶解度的 1%，而当 NaCl 浓度继续增加时，DNP 的溶解 度又渐次增大，当 NaCl 浓度增至 0.5 mol/L 时，DNP 的溶解度约与其在纯水中的溶解度 近似，当 NaCl 浓度继续增加至 1.0 mol/L 时，DNP 的溶解度约为其在纯水中的溶解度的 两倍，且随着盐浓度的上升，其溶解度仍继续呈增大的趋势。但 RNP 则与之不同，在 0.14 mol/L 的盐溶液中，DNP 溶解度很低，而 RNP 的溶解度仍相当大，因此，通常采用 0.14 mol/L 的盐溶液来除去 RNP，使 DNP 仍保持在沉淀中，然后使用浓盐溶液（1.7 mol/L 浓度以上的 NaCl）来提取 DNP。 提取出 DNA-蛋白质复合体（DNP）后，还必须将其中的蛋白质除去，因此，提取 纯化 DNA 要经过以下四个步骤： 1. 制备细胞核； 2. 裂解细胞核； 3. 解离 DNA—蛋白质复合体； 4. 从可溶性物质中分离出 DNA。 小牛胸腺、猪脾、鱼精子和植物种子的胚胎等生物材料，细胞核含量比例大，因而 含有丰富的 DNA，是提取 DNA 的好材料。本实验以小牛胸腺或猪脾为材料。小牛胸腺 不仅 DNA 含最高，而且其脱氧核糖核酸酶（DNase）的活性较低，在制备过程中由此酶 所引起的 DNA 降解损失也较小。为了防止 DNase 的作用，在用于提取的缓冲液中均含 有 1mmol/L 的 EDTA（乙二胺四乙酸）螫合剂，以除去保持 DNase 活性所必须的 Mg++
离子。为防止DNA的变性和降解,操作要尽可能在低温下进行。 本实验通过匀浆、离心得到细胞核组分,然后用SDS(十二烷基硫酸钠, sodium dodecyl sulfate)裂解核膜,释放出DNA-蛋白质复合物,再加入高浓度NaCl,以增加 DNP的溶解度,然后加入氯仿一异戊醇混合液,振荡、乳化,使蛋白质变性,DNP复合 物解离,离心后,DNA溶于上层水相,蛋白质沉淀夹在水相和有机相之间得以除去,最 后用有机溶剂沉淀出DNA。 提取纯化后的小牛胸腺DNA用紫外分光光度法进行鉴定分析,并计算其收率和纯 度。 本实验所得的DNA样品将用于实验五的Tm测定 三、器材与试剂 器材: 1.高速冷冻离心机,50m塑料离心管,300m塑料离心管 2.食品加工机和高速分散器 3.恒温水浴 4.磁力搅拌器 5.量筒:50ml、250m、500ml 6.烧杯:100ml、500ml、1000ml 7.具塞三角瓶:250ml 8.小培养皿 9.吹风机 10.可扫描的紫外分光光度计 试剂: a0.01M柠檬酸钠-9mg/ mI Nacl- lmmol/L EDTA,pH7.0,300ml b.0.5M柠檬酸纳-1 mmoL/LEDTA,pH7.0,300ml c.20%SDS(公用) d.氯仿一异戊醇(24:1)混合液500ml e.95%乙醇和无水乙醇 f.丙酮 g. 0. Imol/L NaOH 四、实验步骤 1制备细胞核 (1)取小牛胸腺(或猪脾)在冰块上去除脂肪和结缔组织,切碎,称10g,放入食品
204 离子。为防止 DNA 的变性和降解，操作要尽可能在低温下进行。 本实验通过匀浆、离心得到细胞核组分，然后用 SDS（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate）裂解核膜，释放出 DNA-蛋白质复合物，再加入高浓度 NaCl，以增加 DNP 的溶解度，然后加入氯仿—异戊醇混合液，振荡、乳化，使蛋白质变性，DNP 复合 物解离，离心后，DNA 溶于上层水相，蛋白质沉淀夹在水相和有机相之间得以除去，最 后用有机溶剂沉淀出 DNA。 提取纯化后的小牛胸腺 DNA 用紫外分光光度法进行鉴定分析，并计算其收率和纯 度。 本实验所得的 DNA 样品将用于实验五的 Tm 测定。 三、器材与试剂 器材： 1. 高速冷冻离心机，50ml 塑料离心管，300ml 塑料离心管 2.食品加工机和高速分散器 3. 恒温水浴 4. 磁力搅拌器 5. 量筒：50ml、250ml、500ml 6. 烧杯：100ml、500ml、1000ml 7. 具塞三角瓶：250ml 8. 小培养皿 9. 吹风机 10. 可扫描的紫外分光光度计 试剂： a. 0.01M 柠檬酸钠－9mg/ml Nacl－1mmol/L EDTA ，pH 7.0，300ml b. 0.15M 柠檬酸纳－1mmol/L EDTA，pH 7.0 ，300ml c. 20% SDS （公用） d. 氯仿－异戊醇（24 : 1）混合液 500ml e. 95% 乙醇和无水乙醇 f. 丙酮 g. 0.1mol/L NaOH 四、实验步骤 1.制备细胞核 ⑴ 取小牛胸腺（或猪脾）在冰块上去除脂肪和结缔组织，切碎，称 10g，放入食品
加工机,加入予冷的试剂a溶液60m,打碎三次,每次20秒,仃20秒。将打碎后溶液 倒入小烧杯,用高速分散器匀浆三次,每次20秒,仃20秒。 (2)将匀浆后溶液分装于两个50m离心管,仔细平衡后,用高速冷冻离心机,4℃ 10000/min,离心10min,弃去上清(脂肪层等)留沉淀, (3)将沉淀置于小烧杯,加50ml予冷a液,用高速分散器同样再匀浆分散三次,同 样4℃,10000/min,离心10min,弃去上清留沉淀。 (4)取出沉淀加6ml予冷b液,再高速分散二至三次,每次分散10秒,仃10秒。 2.裂解细胞核 将悬浮液移入250m烧杯中,在磁力搅拌器上边搅拌边滴λ8mI20‰%SDS,应观察 到溶液明显变粘稠(报告中回答:为什么?)。用55℃水浴温热10min~15min,然后在 搅拌下缓慢加入8~10gNaC,再搅拌10min,使NaCl全溶,此时应观察到溶液变稀(为 什么?)。冷却至室温 3解高DNA一蛋白质复合体 (1)将溶液倒入250ml具塞三角瓶中,加入此溶液二分之一体积的d液(氯仿用于 变性蛋白质,异戊醇用于消除泡沫,也可用异丙醇、异丁醇),剧烈振荡10min,倒入 300m离心管中,4℃,10000min,离心5~10min,用滴管取出上层水相,中层蛋白质 界面弃去,下层有机相倒入回收并。 (2)取出的上层水相重复加d液、振荡、离心,至中层界面无混浊为止 4.提取DNA (1)将取出的水相滴入予冷的95%乙醇中,边滴加边用玻璃棒搅拌起白色纤维状 DNA沉淀。搅拌速度对产率有影响,若产出减少可补加或换新乙醇。(观察并解释实验 现象)(回收乙醇) (2)搅起的DNA置于已称重的小培养皿内,依次用95%乙醇和无水乙醇清洗纤维状 DNA沉淀至无浑浊为止,最后再用丙酮清洗一次,用吹风机将DNA吹干, (3)称重,并计算产率 5.测定DNA (1)准确称取50~100 mg dna,加少量0. Imol/L NaoH溶解,加HO定容至50ml。 (2)用可扫描的紫外分光光度计测定制备的DNA的紫外吸收曲线,测定A260和A28, 并计算比值:A260/A280,纯DNA的此比值约为1.8。 (3)根据:每毫升1微克的纯DNA的Ax60值=0020,计算所得DNA的纯度,并讨 论纯度较低的原因和解决办法
205 加工机，加入予冷的试剂 a.溶液 60ml，打碎三次，每次 20 秒，仃 20 秒。将打碎后溶液 倒入小烧杯，用高速分散器匀浆三次，每次 20 秒，仃 20 秒。 ⑵ 将匀浆后溶液分装于两个 50ml 离心管，仔细平衡后，用高速冷冻离心机，4℃， 10000r/min，离心 10min，弃去上清（脂肪层等）留沉淀。 ⑶ 将沉淀置于小烧杯，加 50ml 予冷 a 液，用高速分散器同样再匀浆分散三次，同 样 4℃，10000r/min，离心 10min，弃去上清留沉淀。 ⑷ 取出沉淀加 60ml 予冷 b 液，再高速分散二至三次，每次分散 10 秒，仃 10 秒。 2. 裂解细胞核 将悬浮液移入 250ml 烧杯中，在磁力搅拌器上边搅拌边滴入 8ml 20% SDS，应观察 到溶液明显变粘稠（报告中回答：为什么？）。用 55℃水浴温热 10min～15min，然后在 搅拌下缓慢加入 8～10g NaCl，再搅拌 10min，使 NaCl 全溶，此时应观察到溶液变稀（为 什么？）。冷却至室温。 3. 解离 DNA—蛋白质复合体 ⑴ 将溶液倒入 250ml 具塞三角瓶中，加入此溶液二分之一体积的 d 液（氯仿用于 变性蛋白质，异戊醇用于消除泡沫，也可用异丙醇、异丁醇），剧烈振荡 10min，倒入 300ml 离心管中，4℃，10000r/min，离心 5～10min，用滴管取出上层水相，中层蛋白质 界面弃去，下层有机相倒入回收并。 ⑵取出的上层水相重复加 d 液、振荡、离心，至中层界面无混浊为止。 4. 提取 DNA ⑴ 将取出的水相滴入予冷的 95%乙醇中，边滴加边用玻璃棒搅拌起白色纤维状 DNA 沉淀。搅拌速度对产率有影响，若产出减少可补加或换新乙醇。（观察并解释实验 现象）（回收乙醇）。 ⑵ 搅起的 DNA 置于已称重的小培养皿内，依次用 95%乙醇和无水乙醇清洗纤维状 DNA 沉淀至无浑浊为止，最后再用丙酮清洗一次，用吹风机将 DNA 吹干。 ⑶ 称重，并计算产率。 5. 测定 DNA ⑴ 准确称取 50～100mg DNA，加少量 0.1mol/L NaOH 溶解，加 H2O 定容至 50ml。 ⑵ 用可扫描的紫外分光光度计测定制备的 DNA 的紫外吸收曲线，测定 A260和 A280， 并计算比值：A260/A280，纯 DNA 的此比值约为 1.8。 ⑶ 根据：每毫升 1 微克的纯 DNA 的 A260 值= 0.020，计算所得 DNA 的纯度，并讨 论纯度较低的原因和解决办法
实验六小牛胸腺DMA熔解温度的测量 、实验目的 1.了解DNA的变性性质,及其熔解温度的意义和用途。 2.掌握测量熔解温度的方法。 二、实验原理 当DNA暴露在变性环境(加热,有机溶液等)中时,其紫外吸收曲线就会显著改 变。如下图所示,从25℃加热至80℃,光吸收变化很小,但是当温度继续上升时,紫外 吸收急剧增加,然后趋向一个恒定的A26值,这条曲线叫做DNA的熔解曲线,曲线中 吸收增加的中点所对应的温度,定义为熔解温度(Tm)。大多数DNA的熔解温度都在 80~90℃之间,光吸收通常增加40%。DNA分子中GC碱基对的含量越高,其双螺旋结 构就越稳定,Tm也就越高:DNA样品中的杂质越多,光吸收的增加也就越小。每种DNA 分子都有其特有的Tm,可以用于DNA的鉴定与特征分析 DNA的熔解曲线 206
206 实验六 小牛胸腺 DNA 熔解温度的测量 一、实验目的 1. 了解 DNA 的变性性质，及其熔解温度的意义和用途。 2. 掌握测量熔解温度的方法。 二、实验原理 当 DNA 暴露在变性环境（加热，有机溶液等）中时，其紫外吸收曲线就会显著改 变。如下图所示，从 25℃加热至 80℃，光吸收变化很小，但是当温度继续上升时，紫外 吸收急剧增加，然后趋向一个恒定的 A260 值，这条曲线叫做 DNA 的熔解曲线，曲线中 吸收增加的中点所对应的温度，定义为熔解温度（Tm）。大多数 DNA 的熔解温度都在 80 ~ 90℃之间，光吸收通常增加 40%。DNA 分子中 GC 碱基对的含量越高，其双螺旋结 构就越稳定，Tm 也就越高；DNA 样品中的杂质越多，光吸收的增加也就越小。每种 DNA 分子都有其特有的 Tm，可以用于 DNA 的鉴定与特征分析。 DNA 的熔解曲线
本实验将采用热变性的方法测量小牛胸腺DNA的熔解温度,有两种方法可供选择。 方法一:需要一台带有超级恒温水浴和恒温样品池架的分光光度计,其温度在 25~100℃之间可调,要使用高沸点溶剂(如乙二醇)作为循环液体。把装有DNA标准 溶液的石英比色杯放入分光光度计的恒温样品池架中,按不同的温度间隔升高温度,平 衡后,测量其260nm处的紫外吸收(A260)。要考虑到,在加热过程中,水体积增加会使 DNA浓度降低。 另一种方法是,取一支装有DNA溶液的试管,测量其25℃时的A26。然后将几管 装有同样DNA溶液的试管在不同温度的恒温水浴中加热。15分钟后迅速将试管放在冰 浴中冷却,然后迅速测量其A260。这种方法的主要缺点是变性DNA冷却后引起DNA双 链的部分再结合,所以A260的增加一般只有10~20%。 三、番材与试剂 1.紫外分光光度计 2.超级恒温水浴 3.普通恒温水浴 4.石英比色杯(带盖) 5.冰浴桶 6.水浴锅 7.试管 8.缓冲液:0.015mo柠檬酸钠—0.15mol/L氯化钠溶液 9DNA溶液:用实验五所得小牛胸腺DNA和缓冲液,配制A260=0.4左右的DNA 标准溶液。溶解此DNA需较长时间的搅拌 四、操作步骤 方法一:用超级恒温水浴测量Tm 打开分光光度计,予热20分钟,将超级恒温水浴的温度设为25℃,以测量起始的 光吸收,将装有柠檬酸钠缓冲液的参照比色杯和装有标准DNA溶液的样品比色杯放入 分光光度计的样品池架中的相应位置。放置3分钟,使比色杯内外的温度达到平衡,将 此时的参照杯A260调为零,记下此时的DNA的样品的A260,这个测量要十分小心,因 为所有测量值都要与25℃的这个值进行比较。然后,将温度升至50℃,取出比色杯,轻 叩杯壁以去除内壁上的气泡。将比色杯放回样品池架,测量后继续加热至80℃,平衡5 分钟后,记下其A260,再升高2℃,平衡5分钟后记下其A260,重复此操作步骤至A26 达到恒定值。可以注意到在一个5~10℃的温度范围内,A260有一个较大幅度的增加。根 据不同温度下水的体积变化对不同温度下的A260(即A260)进行补偿后,以
207 本实验将采用热变性的方法测量小牛胸腺 DNA 的熔解温度，有两种方法可供选择。 方法一：需要一台带有超级恒温水浴和恒温样品池架的分光光度计，其温度在 25～100℃之间可调，要使用高沸点溶剂（如乙二醇）作为循环液体。把装有 DNA 标准 溶液的石英比色杯放入分光光度计的恒温样品池架中，按不同的温度间隔升高温度，平 衡后，测量其 260nm 处的紫外吸收（A260）。要考虑到，在加热过程中，水体积增加会使 DNA 浓度降低。 另一种方法是，取一支装有 DNA 溶液的试管，测量其 2 5℃时的 A260。然后将几管 装有同样 DNA 溶液的试管在不同温度的恒温水浴中加热。15 分钟后迅速将试管放在冰 浴中冷却，然后迅速测量其 A260。这种方法的主要缺点是变性 DNA 冷却后引起 DNA 双 链的部分再结合，所以 A260 的增加一般只有 10～20%。 三、器材与试剂 1. 紫外分光光度计 2. 超级恒温水浴 3. 普通恒温水浴 4. 石英比色杯（带盖） 5. 冰浴桶 6. 水浴锅 7. 试管 8. 缓冲液：0.015mol/L 柠檬酸钠—0.15mol/L 氯化钠溶液 9. DNA 溶液：用实验五所得小牛胸腺 DNA 和缓冲液，配制 A260= 0.4 左右的 DNA 标准溶液。溶解此 DNA 需较长时间的搅拌。 四、操作步骤 方法一：用超级恒温水浴测量 Tm 打开分光光度计，予热 20 分钟，将超级恒温水浴的温度设为 25℃，以测量起始的 光吸收，将装有柠檬酸钠缓冲液的参照比色杯和装有标准 DNA 溶液的样品比色杯放入 分光光度计的样品池架中的相应位置。放置 3 分钟，使比色杯内外的温度达到平衡，将 此时的参照杯 A260 调为零，记下此时的 DNA 的样品的 A260，这个测量要十分小心，因 为所有测量值都要与 25℃的这个值进行比较。然后，将温度升至 50℃，取出比色杯，轻 叩杯壁以去除内壁上的气泡。将比色杯放回样品池架，测量后继续加热至 80℃，平衡 5 分钟后，记下其 A260，再升高 2℃，平衡 5 分钟后记下其 A260，重复此操作步骤至 A260 达到恒定值。可以注意到在一个 5~10℃的温度范围内，A260 有一个较大幅度的增加。根 据不同温度下水的体积变化对不同温度下的 A260（即 A260,T）进行补偿后，以
A260/A2602s作纵轴,T作横轴,画出小牛胸腺DNA的熔解曲线,并求出Tm。 方法二:用普通恒温水浴的方法测量Tm 将恒温水浴的温度分别设为50℃、70℃、80℃、82℃、84℃、86℃、88℃、90℃、 92℃、94℃、96℃、98℃和100℃,往15支试管中各加入标准DNA溶液3ml,盖上橡 皮塞或包上塑料薄膜。100℃水浴锅中放两支,其余12个恒温浴中各放一支。剩下一支 室温放置,并测量其A260,即为基准值A2025。将100℃水浴锅中的一支试管,连同水 浴锅一起在室温下缓慢冷却至室温,放置1小时后再测其A260。其余试管均温浴15分钟 后,取出迅速放入冰水中,冷却10分钟以上,由冰水中取出就立即测量A260,即为各 A260 紫外分光光度计要提前打开,调好零点,做好准备。用溶解DNA的缓冲液作参比 测完后,以A260A6025τ为纵轴,T为横轴作图(去除100℃加热,室温下缓慢冷 却的点),求出小牛胸腺DNA的Tm。(取曲线上直线部分延长线的交点之间的中点求出 Tm。) 五、思考问题 1、DNA变性后,为什么会产生增色效应? 2、予测并解释下列条件对天然DNA的Tm的影响。 (1)pH=12的缓冲液 (2)蒸馏水 (3)50%的甲醇 (4)1%SDS-0.15 mol/L NaCl-0.015mol/L柠檬酸钠(pH70) 3、根据%GC=24(Tm-69.3),计算小牛胸腺DNA的GC碱基对的含量,并解释为 什么GC碱基对的含量与Tm呈正比关系。 4、100℃温浴15分钟后,迅速冷却与缓慢冷却的DNA溶液的Ax6o有什么不同?为 什么?
208 A260,T / A260,25℃作纵轴，T 作横轴，画出小牛胸腺 DNA 的熔解曲线，并求出 Tm。 方法二：用普通恒温水浴的方法测量 Tm。 将恒温水浴的温度分别设为 50℃、70℃、80℃、82℃、84℃、86℃、88℃、90℃、 92℃、94℃、96℃、98℃和 100℃，往 15 支试管中各加入标准 DNA 溶液 3ml，盖上橡 皮塞或包上塑料薄膜。100℃水浴锅中放两支，其余 12 个恒温浴中各放一支。剩下一支 室温放置，并测量其 A260，即为基准值 A260,25℃。将 100℃水浴锅中的一支试管，连同水 浴锅一起在室温下缓慢冷却至室温，放置 1 小时后再测其 A260。其余试管均温浴 15 分钟 后，取出迅速放入冰水中，冷却 10 分钟以上，由冰水中取出就立即测量 A260，即为各 A260,T。 紫外分光光度计要提前打开，调好零点，做好准备。用溶解 DNA 的缓冲液作参比。 测完后，以 A260,T/ A260,25℃为纵轴，T 为横轴作图（去除 100℃加热，室温下缓慢冷 却的点），求出小牛胸腺 DNA 的 Tm。（取曲线上直线部分延长线的交点之间的中点求出 Tm。） 五、思考问题 1、DNA 变性后，为什么会产生增色效应？ 2、予测并解释下列条件对天然 DNA 的 Tm 的影响。 （1）pH=12 的缓冲液 （2）蒸馏水 （3）50% 的甲醇 （4）1% SDS－0.15mol/L NaCll－0.015mol/L 柠檬酸钠（pH7.0） 3、根据%GC=2.4（Tm－69.3）,计算小牛胸腺 DNA 的 GC 碱基对的含量，并解释为 什么 GC 碱基对的含量与 Tm 呈正比关系。 4、100℃温浴 15 分钟后，迅速冷却与缓慢冷却的 DNA 溶液的 A260 有什么不同？为 什么？