实验十一亲和层析纯化胰蛋白酶 引言 前面我们所学的凝胶过滤法、离子交换法以及电泳等一系列分离纯化生物大分子的 手段,比起早期采用的盐析法,有机溶剂及等电点沉淀法等,分离效果要好得多。但是, 这些方法中,或是利用生物大分子在一定条件下不同的溶解度、电荷分布、总电荷的不 同,或是依据其分子的大小和形状的不同。一句话,多是利用生物分子间物理和化学性 质的差异来进行分离纯化的。由于这些方法的特异性比较低,加之待分离物质之间的物 化性质差异较小,常常要综合不同的分离方法。经过许多步骤才能使生物分子达到一定 的纯度。这样既费时间,又费试剂,有时最后产品还不能令人满意 另外,有些生物大分子,往往在生物组织或发酵液中的含量很低,相对地说杂质很 多,特别是一些具有生物活性的分子,往往由于分离纯化的步骤很多,时间过长,造成 破坏以致失活,产率很低。这就促使人们去寻求新的方法来解决存在的问题。 亲和层析法是近十多年来迅速地发展并广泛被采用来分离纯化生物大分子的一种十 分有效的方法。它具有分离快速,纯化效率高。特别是对于那些含量少,杂质多,采用 常规方法难于分离的生物活性分子,显示了独特的优越性。有时一次被分离物质的纯度 可提高几倍,十几倍甚至几百倍。因此,亲和层析技术已成为纯化生物分子,特别是纯 化生物活性物质最重要的方法之 二、实验目的与要求 1.理解亲和层析法的基本原理,并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作 方法; 2.理解和掌握亲和层析实验操作技术 学会一种测定蛋白水解酶活力及比活的方法 三、基本原理 简言之,亲的层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有 定的亲和力而使生物分子得以分离。这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方 法 许多生物分子都有一种独特的生物学功能。即它们都具有能和某些相对应的专一分 子可逆地结合的特性(分子间通过某些次级键结合,如范德华力,疏水力,氢键等,在 一定条件下又可解离)。如:酶和底物(包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似 物)的结合。特异性的抗体一抗原(包括病毒、细胞)、激素与其受体、载体蛋白,基 因与其互补DNA、mRNA及阻遏蛋白的结合,植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多 糖的结合等。均属于专一性而可逆的结合。这种分子之间的结合能力叫做亲和力。亲和 层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物 专一吸附技术”或“功能层析技术”。 在实际工作中,只要把被识别的分子,称为配基( Ligand),在不损害其生物学功 能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上(Mtx,如 Sepharose4B)制成亲和吸附
247 实验十一 亲和层析纯化胰蛋白酶 一、引言 前面我们所学的凝胶过滤法、离子交换法以及电泳等一系列分离纯化生物大分子的 手段，比起早期采用的盐析法，有机溶剂及等电点沉淀法等，分离效果要好得多。但是， 这些方法中，或是利用生物大分子在一定条件下不同的溶解度、电荷分布、总电荷的不 同，或是依据其分子的大小和形状的不同。一句话，多是利用生物分子间物理和化学性 质的差异来进行分离纯化的。由于这些方法的特异性比较低，加之待分离物质之间的物 化性质差异较小，常常要综合不同的分离方法。经过许多步骤才能使生物分子达到一定 的纯度。这样既费时间，又费试剂，有时最后产品还不能令人满意。 另外 ，有些生物大分子，往往在生物组织或发酵液中的含量很低，相对地说杂质很 多，特别是一些具有生物活性的分子，往往由于分离纯化的步骤很多，时间过长，造成 破坏以致失活，产率很低。这就促使人们去寻求新的方法来解决存在的问题。 亲和层析法是近十多年来迅速地发展并广泛被采用来分离纯化生物大分子的一种十 分有效的方法。它具有分离快速，纯化效率高。特别是对于那些含量少，杂质多，采用 常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。有时一次被分离物质的纯度 可提高几倍，十几倍甚至几百倍。因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯 化生物活性物质最重要的方法之一。 二、实验目的与要求 1. 理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作 方法； 2. 理解和掌握亲和层析实验操作技术； 3. 学会一种测定蛋白水解酶活力及比活的方法。 三、基本原理 简言之，亲的层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一 定的亲和力而使生物分子得以分离。这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方 法。 许多生物分子都有一种独特的生物学功能。即它们都具有能和某些相对应的专一分 子可逆地结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在 一定条件下又可解离）。如：酶 和底物（包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似 物）的结合。特异性的抗体一抗 原（包括病毒、细胞）、激素与其受体、载体蛋白，基 因与其互补 DNA、mRNA 及阻遏蛋白的结合，植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多 糖的结合等。均属于专一性而可逆的结合。这种分子之间的结合能力叫做亲和力。亲和 层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物 专一吸附技术”或“功能层析技术”。 在实际工作中，只要把被识别的分子，称为配基（ Ligand ），在不损害其生物学功 能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上（Matrix, 如 Sepharose 4B）制成亲和吸附
剂,然后装柱。再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子,这时绝大部分对配 基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留,只有与配基互补的化合物被吸附 留在柱内。当所有的杂质从柱上流走后,再改变洗脱条件,使结合在配基上的物质解离 下来。这样,原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。其过程 可用简图表示如下 亲和层析原理示意图 本实验为了纯化胰蛋白酶,采用胰蛋白酶的天然抑制剂一鸡卵粘蛋白作为配基制成 亲和吸附剂,从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶。鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑 制剂,对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用,但不抑制糜蛋白酶。在pH=7-8的缓 冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合,而在pH=2~3时,又能被解离下来 因此,采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提液中通过一次亲和层析直 接获得活力大于10,000BAEE单位/毫克蛋白胰蛋白酶制品,比用经典分离纯化方法简 便得多。纯化效率可达到10~20倍以上。 四、试剂与器材 主要试剂:丙酮三氯乙酸HC1 Naoh NaCI NaHCO3NaCO3氯代环氧丙 烷乙腈甲酸 Tris CaCI2 KCI DEAE-纤维素 Sepharose-4B.新鲜猪胰脏 鸡蛋清乙酸二氧六环二甲基亚砜 主要贮存溶液: 1.鸡卵粘蛋白层析液(1升)002 mol/LpH=7.3 Tris-HCI Buffer 2.DEAE-纤维素处理液:05 mol/L HCI300ml和0.5 mol/L NaOH-0.5mo/ L NaCl 0.3升。 3.卵粘蛋白洗脱液:0.02mol/LpH=7.3 Tris-HCI Buffer含0.3 mo/L NaCl,150ml 4.标准胰蛋白酶溶液:结晶胰蛋白酶以0.001NHC配制成50μug/ml。 5.亲和层析柱平衡液:0.1 mol/L pH=8.0 Tris -HCl Buffer,含0.5mol/KCl
248 剂，然后装柱。再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子，这时绝大部分对配 基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留，只有与配基互补的化合物被吸附 留在柱内。当所有的杂质从柱上流走后，再改变洗脱条件，使结合在配基上的物质解离 下来。这样，原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。其过程 可用简图表示如下： 亲和层析原理示意图 本实验为了纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵粘蛋白作为配基制成 亲和吸附剂，从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶。鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑 制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。在 pH = 7~8 的缓 冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在 pH =2~3 时，又能被解离下来。 因此，采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提液中通过一次亲和层析直 接获得活力大于 10,000 BAEE 单位/ 毫克蛋白 胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简 便得多。纯化效率可达到 10 ~ 20 倍以上。 四、试剂与器材 主要试剂：丙酮 三氯乙酸 HCl NaOH NaCl NaHCO3 Na2CO3 氯代环氧丙 烷 乙腈 甲酸 Tris CaCl2 KCl DEAE-纤维素 Sepharose-4B. 新鲜猪胰脏 鸡蛋清 乙酸 二氧六环 二甲基亚砜 主要贮存溶液： 1. 鸡卵粘蛋白层析液（1 升）0.02mol/L pH = 7.3 Tris -HCl Buffer。 2. DEAE-纤维素处理液：0.5 mol/L HCl 300ml 和 0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 0.3 升。 3. 卵粘蛋白洗脱液：0.02mol/L pH = 7.3 Tris -HCl Buffer 含 0.3mol/L NaCl, 150ml. 4. 标准胰蛋白酶溶液：结晶胰蛋白酶以 0.001N HCl 配制成 50g/ml。 5. 亲和层析柱平衡液：0.1mol/L pH = 8.0 Tris -HCl Buffer ,含 0.5mol/LKCl
0.05mol/L CaCl2, 500mlo (AC 1000ml: 12 1g Tris, 37 5g KCI, 5.6g Cacl2) 6.005 mol/L pH=80 Tris-HCI Buffer含02%Cacl2(全斑公用,配100ml:605g ris水溶后,先用4 mol/L HCI调pH为8.0,然后方可加2 g Caclz) 7.亲和柱解吸液:0. I mol/ L甲酸-0.5 mol/L KCI pH=2.5,500ml。(配1000ml:375g KCl,4.35m甲酸)。 8. Sepharose4B胶清洗液:0.5 mol/L NaCl和0. I mol/L NahCO3缓冲液,pH=9.5,各 500ml 9BAEE底物缓冲液:34 mg Baee溶于50ml005mol/LpH=80 Tris-HCl buffer 中,临用前配制,冰箱内可保存3天 主要器材: 恒温水浴,温度计,G2玻璃漏斗,抽滤瓶,布氏漏斗,离心杯(50m),透析袋 层析柱(2×30cm,26×30cm),秒表,移液管,贮液瓶(1升),电磁搅拌器,pl计,紫 外分光光度计,纱布,匀浆器,pH试纸。 五、实验操作步骤 (一)鸡卵粘蛋白的分高及纯化 1.鸡卵粘蛋白( Ovomucoid)的一些性质 Ovomucoid是一种糖蛋白,在中性及偏酸性溶液中对热及高浓度脲、有机溶剂, 均有较高的耐受性。但在较酸、碱条件下,易引起变性。 Ovomucoid带有四种糖基,因 此有较强的吸水性。在50%丙酮或5%三氯乙酸盐的水溶液中,仍有较好的溶解度。所以, 选择合适的pH,丙酮浓度和三氯乙酸盐的浓度,可以从蛋清中除去大量的非卵粘蛋白 由于 Ovomucoid所带的糖基不同,电泳行为呈现出不均一性,等电点在39~45 之间并呈现出四条电泳条带,但它们在生物学功能上差异不大,在氨基酸组成上几乎无 差异,分子量约为28,000。每1摩尔的卵粘蛋白分子能抑制1摩尔的胰蛋白酶。所以每 毫克高纯度的卵粘蛋白能抑制约0.84毫克的胰蛋白酶。 Ovomucoid在280m处的百分 消光系数A%1cm280=4.13.,即蛋白酶浓度为lmg/ml时,溶液的吸光度A280=0.413,据 此可以测定其溶液中蛋白质的含量 2. Ovomucoid的分离及粗品制备: 取2只鸡蛋,得蛋清约50ml,将其温热至25℃左右,加入等体积10%plH=10的 三氯乙酸溶液(配制三氯乙酸:称取10克三氯乙酸,用70ml蒸馏水溶解,再用5molL NaOH调pl=1.0左右,最后加蒸馏水至10ml。),这时出现大量白色沉淀,充分搅匀 后,测定溶液的pH值,此时溶液的pH值应当是3.5±02,若偏离此值,用 5N HCI或5moL NaOH溶液调pH=35±0,2,注意在调pH值时,要严防局部过酸或过碱。接着25℃放 置4小时或过夜。次日用4000~6000转/分离心20分钟,收集清液,再用三层纱布过滤 并检査滤液的pH值是否仍为3.5±0.2,若不是,则要调回到此范围内。然后将清液放冰 浴冷却至o℃,缓缓加入3倍体积预先冷却的丙酮,用玻璃棒搅拌均匀并用塑料薄膜盖好 防止丙酮挥发,放冰箱或冰浴中3~4小时后,离心(3000转/分,15~20分钟)收集 沉淀(清液留待回收丙酮)。将沉淀抽真空去净丙酮,得到粗的卵粘蛋白。将其用20ml 左右蒸馏水溶解。若溶解后的溶液浑浊,可用滤纸过滤或离心去掉不溶物。取上清装透
249 0.05mol/L CaCl2, 500ml。（配 1000ml：12.1g Tris，37.5g KCl，5.6g Cacl2）。 6. 0.05 mol/L pH = 8.0 Tris-HCl Buffer 含 0.2% Cacl2（全斑公用，配 1000ml：6.05g Tris 水溶后，先用 4mol/L HCl 调 pH 为 8.0，然后方可加 2g Cacl2 ）。 7. 亲和柱解吸液：0.1mol/L 甲酸—0.5 mol/L KCl pH = 2.5 , 500ml。（配 1000ml：37.5g KCl，4.35ml 甲酸）。 8. Sepharose 4B 胶清洗液：0.5mol/L NaCl 和 0.1mol/L NaHCO3 缓冲液，pH = 9.5, 各 500ml. 9. BAEE 底物缓冲液：34mg BAEE 溶于 50ml 0.05 mol/L pH = 8.0 Tris -HCl buffer 中，临用前配制，冰箱内可保存 3 天。 主要器材： 恒温水浴，温度计，G2 玻璃漏斗，抽滤瓶，布氏漏斗，离心杯（50ml），透析袋， 层析柱（2×30cm,26×30cm），秒表，移液管，贮液瓶（1 升），电磁搅拌器，pH 计，紫 外分光光度计，纱布，匀浆器，pH 试纸。 五、实验操作步骤 （一）鸡卵粘蛋白的分离及纯化 1. 鸡卵粘蛋白（Ovomucoid）的一些性质: Ovomucoid 是一种糖蛋白，在中性及偏酸性溶液中对热及高浓度脲、有机溶剂， 均有较高的耐受性。但在较酸、碱条件下，易引起变性。 Ovomucoid 带有四种糖基，因 此有较强的吸水性。在 50%丙酮或 5%三氯乙酸盐的水溶液中，仍有较好的溶解度。所以， 选择合适的 pH，丙酮浓度和三氯乙酸盐的浓度，可以从蛋清中除去大量的非卵粘蛋白。 由于 Ovomucoid 所带的糖基不同，电泳行为呈现出不均一性，等电点在 3.9 ~ 4.5 之间并呈现出四条电泳条带，但它们在生物学功能上差异不大，在氨基酸组成上几乎无 差异，分子量约为 28,000。每 1 摩尔的卵粘蛋白分子能抑制 1 摩尔的胰蛋白酶。所以每 毫克高纯度的卵粘蛋白能抑制约 0.84 毫克的胰蛋白酶。Ovomucoid 在 280nm 处的百分 消光系数 A1%1cm.280 = 4.13. ， 即蛋白酶浓度为 1mg/ml 时,溶液的吸光度 A280 = 0.413 ，据 此可以测定其溶液中蛋白质的含量。 2. Ovomucoid 的分离及粗品制备： 取 2 只鸡蛋，得蛋清约 50 ml ，将其温热至 25℃左右，加入等体积 10 % pH = 1.0 的 三氯乙酸溶液（配制三氯乙酸：称取 10 克三氯乙酸，用 70 ml 蒸馏水溶解，再用 5mol/L NaOH 调 pH = 1.0 左右，最后加蒸馏水至 100ml。），这时出现大量白色沉淀，充分搅匀 后，测定溶液的 pH 值，此时溶液的 pH 值应当是 3.5±0.2 ,若偏离此值，用 5N HCl 或 5mol/L NaOH 溶液调 pH = 3.5±0.2 ，注意在调 pH 值时，要严防局部过酸或过碱。接着 25℃放 置 4 小时或过夜。次日用 4000~6000 转/分 离心 20 分钟，收集清液，再用三层纱布过滤 并检查滤液的 pH 值是否仍为 3.5±0.2，若不是，则要调回到此范围内。然后将清液放冰 浴冷却至 0℃，缓缓加入 3 倍体积预先冷却的丙酮，用玻璃棒搅拌均匀并用塑料薄膜盖好 防止丙酮挥发，放冰箱或冰浴中 3 ~ 4 小时后，离心（ 3000 转/ 分，15 ~ 20 分钟）收集 沉淀（清液留待回收丙酮）。将沉淀抽真空去净丙酮，得到粗的卵粘蛋白。将其用 20 ml 左右蒸馏水溶解。若溶解后的溶液浑浊，可用滤纸过滤或离心去掉不溶物。取上清装透
析袋,并对蒸馏水透析去除三氯乙酸(或用 Sephadex G-25凝胶层析柱脱盐去除三氯乙 酸)。测定其抑制胰蛋白酶的比活力。若比活力大于7000BAEE/mg,可直接用作亲和 配基制备亲和吸附剂,否则应进一步纯化。 3 Ovomucoid的纯化 DEAE-纤维素的处理:称取10克DEAE- Cellulose粉(DE-32),先用约150ml 0.5 mol/L Nacl—0.5 mol/L Naoh溶液溶胀30分钟,用G2漏斗抽干并用去离子水冲洗至 中性,转入烧杯中再用约150ml0.5 molL HCl浸泡20分钟,再在G2漏斗中用蒸馏水洗 至中性,最后用约150ml0.02 mol/L pH=7.3 Tris-HCI缓冲液浸泡,抽真空去气泡后装柱 (2cm×20cm柱),并用同一缓冲液平衡一个床体积即可使用 将粗的 Ovomucoid制品加入等体积的002 mo/L pH=7.3 Tris-HCI绥冲液后上柱吸附 并用同一缓冲液洗杂蛋白至A280005为止。最后用含03 mol/L NaCl的上述Tris-Hq缓 冲液洗脱。收集具有胰蛋白酶抑制活性的蛋白峰。测定合并液的蛋白含量及卵粘蛋白的 比活性及总活力 最后将其对蒸馏水透析(或用 Sephadexσ-25)脱盐,精确调溶液pH=4-0~4.5,加 入3倍体积予冷的丙酮沉淀,放冰箱或冰浴3~4小时,然后离心(3000转/分,15~20 分钟)收集沉淀(清液回收丙酮),真空下抽去丙酮即得卵粘蛋白干粉。如将透析后溶液 吹风浓缩,冰冻干燥则得海绵状松软白色干粉的卵粘蛋白 鸡卵粘蛋白粗提物在DEAE- Cellulose柱上的层析图 平衡缓冲液:0.02 mol pH=73 Tris-HCI缓冲液 冲洗缓冲液:同上 洗脱液:0.02 mol/L pH=73Tris-HCl缓冲液并含0.3 mol/L NaCl (二)亲和吸附剂的合成 目前有多种方法活化载体和偶联配基制备亲和吸附剂。本实验采用氯代环氧丙烷活 化载体与偶联配基(在附录中注明了溴化氰活化载体与偶联配基的方法)。 1.载体 Sepharose4B的活化-氯代环氧丙烷活化可用下面两种溶剂 (1)二氧六环
250 析袋，并对蒸馏水透析去除三氯乙酸（或用 Sephadex G - 25 凝胶层析柱脱盐去除三氯乙 酸）。测定其抑制胰蛋白酶的比活力。若比活力大于 7000 BAEE / mg ，可直接用作亲和 配基制备亲和吸附剂，否则应进一步纯化。 3. Ovomucoid 的纯化 DEAE-纤维素的处理：称取 10 克 DEAE - Cellulose 粉（DE - 32），先用约 150 ml 0.5mol/L NaCl ⎯ 0.5mol/L NaOH 溶液溶胀 30 分钟，用 G2 漏斗抽干并用去离子水冲洗至 中性，转入烧杯中再用约 150ml 0.5mol/L HCl 浸泡 20 分钟，再在 G2 漏斗中用蒸馏水洗 至中性，最后用约 150 ml 0.02mol/L pH=7.3 Tris-HCl 缓冲液浸泡，抽真空去气泡后装柱 （2cm×20cm 柱），并用同一缓冲液平衡一个床体积即可使用。 将粗的 Ovomucoid 制品加入等体积的 0.02mol/L pH=7.3 Tris-HCl 绥冲液后上柱吸附， 并用同一缓冲液洗杂蛋白至 A280<0.05 为止。最后用含 0.3mol/L NaCl 的上述 Tris - HCl 缓 冲液洗脱。收集具有胰蛋白酶抑制活性的蛋白峰。测定合并液的蛋白含量及卵粘蛋白的 比活性及总活力。 最后将其对蒸馏水透析（或用 Sephadex G-25）脱盐，精确调溶液 pH = 4.0 ~ 4.5，加 入 3 倍体积予冷的丙酮沉淀，放冰箱或冰浴 3 ~ 4 小时，然后离心（3000 转/ 分，15 ~ 20 分钟）收集沉淀（清液回收丙酮），真空下抽去丙酮即得卵粘蛋白干粉。如将透析后溶液 吹风浓缩，冰冻干燥则得海绵状松软白色干粉的卵粘蛋白。 鸡卵粘蛋白粗提物在 DEAE-Cellulose 柱上的层析图 平衡缓冲液：0.02mol/L pH =7.3 Tris-HCl 缓冲液 冲洗缓冲液：同上 洗脱液：0.02mol/L pH = 7.3 Tris- HCl 缓冲液并含 0.3mol/L NaCl （二）亲和吸附剂的合成 目前有多种方法活化载体和偶联配基制备亲和吸附剂。本实验采用氯代环氧丙烷活 化载体与偶联配基（在附录中注明了溴化氰活化载体与偶联配基的方法）。 1. 载体 Sepharose 4B 的活化 - 氯代环氧丙烷活化. 可用下面两种溶剂。 (1) 二氧六环
取loml沉淀体积的 Sepharose4B于G2玻璃烧结漏斗中,抽滤成半干,先用约 l00ml.0.5 mol/L NaCl溶液淋洗,再用100-150ml蒸馏水洗涤,以除去其中的保护剂和防 腐剂。抽干约得6克半干滤并,置于50ml三角瓶中,加入6.5ml2mol/ L NaOh,2m氯 代环氧丙烷及l5m56%二氧六环,并置于40℃温和搅拌2小时,然后将胶转移到G玻 璃漏斗中以蒸馏水淋洗除去多余的试剂,最后再用约100m0.2moJ/ L Na2CO3 ph=9.5 缓冲液洗涤。接着尽快进行偶联实验。 (2)二甲基亚砜 同(1)法将6克半干滤并置于50m三角瓶中,加入6.5ml2mol/ L NaOh,2ml 氯代环氧丙烷及15ml56%二甲基亚砜,充分混匀,在40℃振荡2小时,然后同(1)法 洗涤凝胶后尽快进行偶联。 2.鸡卵粘蛋白与活化的载体 Sepharose-4B偶联 将已活化好的 Sepharose-4B转移到三角瓶中。用10m0.2mol/ L Naco3,p=9.5 缓冲液将上述制备好的卵粘蛋白溶解(或0.1 mol/L NaoH1oml溶解),取出0.lm溶液稀 释20~30倍,用紫外分光光度计测定卵粘蛋白的含量。剩余的溶液全部转移到三角瓶中 与活化好的 Sepharose4B偶联。在40℃恒温摇床振荡24小时左右。偶联终止后,将凝胶 倒入G2漏斗中抽干并用100n0.5 mol/L Nacl溶液洗去未偶联上的蛋白(收集滤液,测 蛋白含量及总活力,以计算偶联率),再用100ml蒸馏水淋洗。接着用亲和洗脱液 (0. Imol/L甲酸—0.5moⅦ KCI pH=2.5)5ml洗一次。最后用蒸馏水洗至中性,浸 泡于亲和柱平衡液005 mol/L cacl20.lmo/LpH=80Tris-HCl缓冲液中,放冰箱待用 环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基的偶联反应式如下: (三)亲和层析分离纯化胰蛋白酶 1.粗胰蛋白藤的制备 取100g新鲜冰冻猪胰脏,剥去脂肪及结缔组织后在匀浆机器中搅碎,加入约200ml 预冷的乙酸酸化水(pH=40),8-10℃条件下,搅拌提取45小时,然后四层纱布挤滤 (残渣再用约l00m乙酸酸化水搅拌提取1小时,四层纱布挤滤),收集合并两次滤液 用2.5mo/LHSO调pH=2.5.~3.0,放置1~2小时(静置期间要检査一下pH值,应始终 保持pH=2.5~30),最后用滤纸过滤,收集滤液待激活
251 取 10ml 沉淀体积的 Sepharose 4B 于 G2 玻璃烧结漏斗中，抽滤成半干，先用约 100 ml. 0.5mol/L NaCl 溶液淋洗，再用 100~150ml 蒸馏水洗涤，以除去其中的保护剂和防 腐剂。抽干约得 6 克半干滤并，置于 50ml 三角瓶中，加入 6.5 ml 2mol/L NaOH，2ml 氯 代环氧丙烷及 15ml 56%二氧六环，并置于 40℃温和搅拌 2 小时，然后将胶转移到 G2 玻 璃漏斗中以蒸馏水淋洗除去多余的试剂，最后再用约 100ml 0.2mol/L Na2CO3 pH = 9.5 缓冲液洗涤。接着尽快进行偶联实验。 （2）二甲基亚砜 同（1）法将 6 克半干滤并置于 50ml 三角瓶中，加入 6.5 ml 2mol/L NaOH，2 ml 氯代环氧丙烷及 15ml 56%二甲基亚砜，充分混匀，在 40℃ 振荡 2 小时，然后同（1）法 洗涤凝胶后尽快进行偶联。 2. 鸡卵粘蛋白与活化的载体 Sepharose-4B 偶联 将已活化好的 Sepharose-4B 转移到三角瓶中。用 10ml 0.2mol/L Na2CO3, pH = 9.5 缓冲液将上述制备好的卵粘蛋白溶解（或 0.1mol/L NaOH 10ml 溶解），取出 0.1ml 溶液稀 释 20 ~ 30 倍，用紫外分光光度计测定卵粘蛋白的含量。剩余的溶液全部转移到三角瓶中 与活化好的 Sepharose 4B 偶联。在 40℃恒温摇床振荡 24 小时左右。偶联终止后，将凝胶 倒入 G2 漏斗中抽干并用 100ml 0.5mol/L NaCl 溶液洗去未偶联上的蛋白（收集滤液，测 蛋白含量及总活力，以计算偶联率）, 再用 100ml 蒸馏水淋洗。接着用亲和洗脱液 （ 0.1mol/L 甲酸—0.5mol/L KCl pH = 2.5）50ml 洗一次。最后用蒸馏水洗至中性，浸 泡于亲和柱平衡液 0.05 mol/L CaCl2 0.1mol/L pH = 8.0 Tris -HCl 缓冲液中，放冰箱待用。 环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基的偶联反应式如下： （三）亲和层析分离纯化胰蛋白酶 1. 粗胰蛋白酶的制备 取 100g 新鲜冰冻猪胰脏，剥去脂肪及结缔组织后在匀浆机器中搅碎，加入约 200ml, 预冷的乙酸酸化水（pH = 4.0）, 8~10℃条件下, 搅拌提取 4~5 小时 ，然后四层纱布挤滤 （残渣再用约 100ml 乙酸酸化水搅拌提取 1 小时，四层纱布挤滤），收集合并两次滤液， 用 2.5mol/L H2SO4调 pH = 2.5.~3.0，放置 1~2 小时（静置期间要检查一下 pH 值，应始终 保持 pH = 2.5~3.0）,最后用滤纸过滤，收集滤液待激活
2.胰蛋白酶原的激活: 将滤液用5 mol/L NaOH调pH=8.0,加固体CaCh2,使溶液中Ca2的终浓度达到 0.1mo/L。(注意先取2ml胰蛋白酶粗提液测定激活前的蛋白含量及酶活性。)然后加入2 5mg结晶胰蛋白酶进行激活,于5℃冰箱放置18-20小时进行激活(或在室温下,20 25℃左右激活2~4小时)即可完成。激活期间,分别在16、18小时取样测酶的活性, 待酶的比活达到800~1000BAEE单位/mg时停止激活。用25 mol/L H2SO4调至pH=2 3.0,滤去CaSO4沉淀物,滤液放冰箱内备用。 3.亲和层析纯化胰蛋白醇 (1)装柱:取一支层析柱,先装入14体积的亲和柱平衡液(0.1mo/LpH=8.0 含0.05 mol/L CaCI2的Tris-HCl溶液)。然后将亲和吸附剂轻轻搅匀,缓缓加入柱内,待 其自然沉降,调好流速3ml/ 10 min左右用亲和柱平衡液平衡,检测流出液A8值小于 0.02 (2)上样:将胰蛋白酶粗提液用5 mol/L NaoH调至p=80,(若有沉淀,过滤去 除之)。取一定体积上述澄清溶液上柱吸附。上样体积可大致计算如下: W×0.84×1.3×104 胰蛋白酶上样体积(ml) ×1.5 式中:W:是卵粘蛋白偶联的总mg数; 0.84:是1mg卵粘蛋白能抑制约084mg胰蛋白酶 3×104:是纯化后胰蛋白酶比活的近似值 C:是胰蛋白酶粗提液的浓度(mg/ml): A:是胰蛋白酶粗提液的比活( bAEE/mg) 1.5:是上样量过量50% 吸附毕,先用平衡液洗涤,至流出液A280<0.02。换洗脱液洗脱 (3)洗脱及收集胰蛋白酶:用0lmoL甲酸—05 mol/L KCl pH=25洗脱液进行 洗脱。洗脱速度约2~4ml/l0min然后收集蛋白峰并测定收集液的蛋白含量、酶的比活 力及总活力 亲和层析柱用平衡缓冲液平衡后可再次作亲和层析。若柱内加入防腐剂0.01%叠氮 化钠NaN3在冰箱中保存,至少一年内活性不丧失 最后可用两种方法将纯化的胰蛋白酶制成固体保存: (1)将比活力最高部分用固体(NH2SO4以0.8饱和度盐析,放置4小时以上,抽滤 收集硫酸铵沉淀(要抽干)。滤并先用少量蒸馏水溶解,再加入14体积0.8 mol/L pH=90 的硼酸溶液,冰箱中放置,数日后即可获得棒状结晶。(注:只有胰蛋白酶的量较多时, 才能得到结晶品) (2)将亲和层析获得的胰蛋白酶溶液放入透析袋內,在4℃对蒸馏水透析,然后冷冻 干燥成干粉
252 2. 胰蛋白酶原的激活： 将滤液用 5mol/L NaOH 调 pH = 8.0，加固体 CaCl2 ，使溶液中 Ca² +的终浓度达到 0.1mol/L。( 注意先取 2ml 胰蛋白酶粗提液测定激活前的蛋白含量及酶活性。)然后加入 2 ~5mg 结晶胰蛋白酶进行激活 ，于 5℃冰箱放置 18~20 小时进行激活（或在室温下，20 ~ 25℃左右激活 2 ~ 4 小时）即可完成。激活期间，分别在 16、18 小时取样测酶的活性， 待酶的比活达到 800 ~ 1000 BAEE 单位/ mg 时停止激活。用 2.5mol/L H2SO4 调至 pH = 2.5 ~ 3.0, 滤去 CaSO4 沉淀物，滤液放冰箱内备用。 3. 亲和层析纯化胰蛋白酶： （1） 装柱：取一支层析柱，先装入 1/4 体积的亲和柱平衡液（0.1mol/L pH = 8.0, 含 0.05mol/L CaCl2 的 Tris - HCl 溶液）。然后将亲和吸附剂轻轻搅匀，缓缓加入柱内，待 其自然沉降，调好流速 3ml / 10 min 左右,用亲和柱平衡液平衡，检测流出液 A280 值小于 0.02 . （2）上样：将胰蛋白酶粗提液用 5mol/L NaOH 调至 pH = 8.0,（若有沉淀，过滤去 除之）。取一定体积上述澄清溶液上柱吸附。上样体积可大致计算如下： 胰蛋白酶上样体积（ml）= 1.5 0.84 1.3 104 C A W 式中： W：是卵粘蛋白偶联的总 mg 数； 0.84：是 1mg 卵粘蛋白能抑制约 0.84mg 胰蛋白酶； 3×104 ：是纯化后胰蛋白酶比活的近似值； C：是胰蛋白酶粗提液的浓度（mg/ml）； A：是胰蛋白酶粗提液的比活（BAEE/mg）； 1.5：是上样量过量 50% 。 吸附毕，先用平衡液洗涤，至流出液 A280<0.02。换洗脱液洗脱。 （3）洗脱及收集胰蛋白酶：用 0.1mol/L 甲酸—0.5mol/L KCl pH = 2.5 洗脱液进行 洗脱。洗脱速度约 2 ~ 4ml / 10min. 然后收集蛋白峰并测定收集液的蛋白含量、酶的比活 力及总活力。 亲和层析柱用平衡缓冲液平衡后可再次作亲和层析。若柱内加入防腐剂 0.01% 叠氮 化钠 NaN3 在冰箱中保存，至少一年内活性不丧失。 最后可用两种方法将纯化的胰蛋白酶制成固体保存： （1）将比活力最高部分用固体(NH4)2SO4 以 0.8 饱和度盐析，放置 4 小时以上，抽滤 收集硫酸铵沉淀（要抽干）。滤并先用少量蒸馏水溶解，再加入 1/4 体积 0.8mol/L pH = 9.0 的硼酸溶液，冰箱中放置, 数日后即可获得棒状结晶。（注：只有胰蛋白酶的量较多时， 才能得到结晶品）。 （2）将亲和层析获得的胰蛋白酶溶液放入透析袋內，在 4℃对蒸馏水透析，然后冷冻 干燥成干粉
胰蛋白酶在亲和柱上的分离曲线 六、实验结果处理 绘制亲和柱层析洗脱曲线。 2.计算鸡卵粘蛋白的比活力 3.计算鸡卵蛋白的偶联量 4.绘制酶促反应动力学曲线(求初速度) 5.计算亲和层析纯化胰蛋白酶的比活力及纯化效率。 最后将亲和层析过程中的各项数据详细列入下表中。 亲和层析实验数据 亲和柱床体积(ml) 洗脱的胰蛋白酶溶液体积(ml) 洗脱的胰蛋白酶溶液吸光值A280 洗脱的胰蛋白酶溶液蛋白浓度(mg/ml) 匚亲和柱吸附率(mg/m凝胶 亲和柱洗脱酶液活力(u/ml) 亲和柱洗脱酶液比活力(u/mg) 上柱前样品比活力(u/mg) 亲和柱纯化效率(倍数) 附录一:用溴化氯活化载体及偶联配基方法 载体 Sepharose4B的活化:取15m沉淀体积的 Sepharose4B,抽滤成半干物,用约 10倍体积0.5mo/ L Nacl洗,再用10~15倍蒸馏水洗去其中的保护剂和防腐剂。抽干约得
253 胰蛋白酶在亲和柱上的分离曲线 六、实验结果处理 1. 绘制亲和柱层析洗脱曲线。 2. 计算鸡卵粘蛋白的比活力。 3. 计算鸡卵蛋白的偶联量。 4. 绘制酶促反应动力学曲线（求初速度）。 5. 计算亲和层析纯化胰蛋白酶的比活力及纯化效率。 最后将亲和层析过程中的各项数据详细列入下表中。 亲和层析实验数据 参数 数据 亲和柱床体积（ml） 洗脱的胰蛋白酶溶液体积 ( ml ) 洗脱的胰蛋白酶溶液吸光值 A280 洗脱的胰蛋白酶溶液蛋白浓度 ( mg / ml ) 亲和柱吸附率 ( mg / ml 凝胶) 亲和柱洗脱酶液活力 ( u / ml ) 亲和柱洗脱酶液比活力 ( u / mg ) 上柱前样品比活力 ( u / mg ) 亲和柱纯化效率（倍数） 附录一 ： 用溴化氰活化载体及偶联配基方法 1. 载体 Sepharose4B 的活化：取 15ml 沉淀体积的 Sepharose4B,抽滤成半干物，用约 10 倍体积 0.5mol/L NaCl 洗，再用 10~15 倍蒸馏水洗去其中的保护剂和防腐剂。抽干约得
8克半干滤并,放一小烧杯中,加入等体积的2mol/Lpl=10.5 NaHco3缓冲溶液,外置 冰浴,在通风厨内于电磁搅拌器上轻轻地进行搅拌,然后再缓慢加CNBr一乙腈溶液3m (含CNBr1g/ml乙腈),边测pH,通过逐滴加入2mo/ L NaOh,始终维持pH在10.5 左右,待CNBr一乙腈溶液加完并且pH不再明显变化时,即可终止反应(一般在30-3 分钟内完成)。立即投入少许冰块,取出并迅速转移至G2玻璃烧结漏斗中抽滤,用大量 冰水洗,最后用冷的0. mol/L pH=95 NaHco3缓冲溶液洗,其用量约为凝胶体积的10~15 倍。接着抽干待用。 2.鸡卵粘蛋白的偶联:将30ml(约0.5g蛋白质)对0.1 mol/L pH=9.5 NaHco3透 析平衡过的鸡卵粘蛋白立即加入上述活化好的凝胶中,室温缓慢搅拌反应6小时,这 步动作要快,从载体活化后到加入配基的时间最好不超过2分钟,因活化好的载体极不 稳定,易变成无活性的产物 反应6小时后取出抽滤,先用大量去离子水洗,然后用20ml1molL乙醇胺(pH 9~9.5)封闭残存的活性基团,室温搅拌反应2小时,抽滤。再用凝胶体积2-3倍的02moL 甲酸和0. Imol/L pH=8.3Tis-HCl缓冲液交替洗涤,直到流出液中A280-0.05为止。抽 干后用005mol/Lp=83 Tris-HCl Buffer浸泡然后置冰箱中待用 溴化氰活化载体与蛋白质配基偶联反应式如下: 附录二:酶活力的测定 1.胰蛋白酶活力的测定:本实验以苯甲酰L一精氨酸乙酯(英文缩写为BAEE)为 底物,用紫外吸收法进行测定。方法如下: 取2个光程为1厘米的带盖石英比色杯,先在一只杯中加入25℃予热过的20m缓 冲液(005 mol/L pH=80 Tris-HCI Buffer含0.2%CaCl2)。0.2m10001mo/LHCl,然后再 加08 mI BAEE-005 mol/L pH=80 Tris-HCI Buffer(含02%CaCl和1 mmol/L BAEE)作 为空白,校正仪器的253nm处光吸收零点。再在另一比色杯中加入0.2ml待测酶液(用 量一般为10微克结晶的胰蛋白酶),立即混匀并记时(杯内已有20ml缓冲液和08ml BAEE溶液)。每半分钟读数一次,共读3~4分钟。若ΔA2s/min>0400,则酶液应当稀释 或减量,控制AA25/min在0.05~0.100左右为宜
254 8 克半干滤并，放一小烧杯中，加入等体积的 2mol/L pH = 10.5 NaHCO3 缓冲溶液，外置 一冰浴，在通风厨内于电磁搅拌器上轻轻地进行搅拌，然后再缓慢加 CNBr—乙腈溶液 3ml （含 CNBr 1g / ml 乙腈），边测 pH，通过逐滴加入 2mol/L NaOH，始终维持 pH 在 10.5 左右，待 CNBr—乙腈溶液加完并且 pH 不再明显变化时，即可终止反应（一般在 30~35 分钟内完成）。立即投入少许冰块，取出并迅速转移至 G2 玻璃烧结漏斗中抽滤，用大量 冰水洗，最后用冷的0.1mol/L pH = 9.5 NaHCO3 缓冲溶液洗，其用量约为凝胶体积的10~15 倍。接着抽干待用。 2. 鸡卵粘蛋白的偶联：将 30ml（约 0.5g 蛋白质）对 0.1mol/L pH = 9.5 NaHCO3 透 析平衡过的鸡卵粘蛋白立即加入上述活化好的凝胶中，室温缓慢搅拌反应 6 小时，这一 步动作要快，从载体活化后到加入配基的时间最好不超过 2 分钟，因活化好的载体极不 稳定，易变成无活性的产物。 反应 6 小时后取出抽滤，先用大量去离子水洗，然后用 20ml 1mol/L 乙醇胺（pH = 9~9.5）封闭残存的活性基团，室温搅拌反应 2 小时，抽滤。再用凝胶体积 2~3 倍的 0.2mol/L 甲酸和 0.1mol/L pH = 8.3 Tris—HCl 缓冲液交替洗涤，直到流出液中 A2800.400，则酶液应当稀释 或减量，控制A253/min 在 0.05 ~ 0.100 左右为宜
绘制酶促反应动力学曲线,从曲线上求出反应起始点吸光度随时间的变化率(即初速 度)△A25/mind 胰蛋白酶活力单位的定义规定为:以BAEE为底物反应液pH8.0,25℃,反应体积 30ml,光径1厘米的条件下,测定ΔA33,每分钟使ΔA253增加0001,反应液中所加入的 酶量为一BAEE单位。 所以: 胰蛋白酶溶液的活力单位(BAEE单位/ml)= △423(mn) 0001×酶液加入体积×稀释倍数 胰蛋白酶比活力(BAEE单位/mg)= 酶液活力 胰酶浓度(mg/m1)×酶液加入体积 2.卵粘蛋白抑制活性的测定 胰蛋白酶抑制活力单位的定义:抑制一个胰蛋白酶活力单位(BAEE单位)所需卵粘 蛋白的量,定为抑制剂的一个活力单位(英文缩写为 bAee Tlu) 具体测定方法如下:首先以底物(不加酶)于253nm处校正仪器光吸收零点(操作 如上述);再测定标准酶的活力单位(操作如上述);测定加入抑制剂后剩余酶活力单位 在比色杯中加入0.2m上述标准酶液再加入适量的抑制剂(一般不能超过标准酶含量,以 1:2左右为宜,具体视抑制剂的纯度而定),再加入1.8m005 mol/L pH=8.0 Tris-HCl 缓冲液,摇匀后于25℃放置2分钟以上,让酶与抑制剂充分结合。最后加入0.8m底物 (BAEE溶液),摇匀立即记时,测定A2s3的变化。计算剩余酶活力单位 按下面方式计算出抑制剂的抑制活力和抑制比活力 抑制剂溶液的抑制活力Iu=AA-△Ai、Mi (BAEE抑制单位m) 0.001 抑制比活力 lu BAEE TIu/mg 加入抑制剂蛋白浓度(mg/ml) 式中: ΔAo:未加抑制剂时,酶每分钟ΔA253增加值 △Ai.:加入抑制剂后,酶每分钟△A23的增加值 Ni:抑制剂溶液的稀释倍数 Vi:测定时加入抑制剂的体积
255 绘制酶促反应动力学曲线，从曲线上求出反应起始点吸光度随时间的变化率（即初速 度）A253/min。 胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以 BAEE 为底物反应液 pH8.0，25℃，反应体积 3.0ml，光径 1 厘米的条件下，测定A253，每分钟使A253 增加 0.001，反应液中所加入的 酶量为一 BAEE 单位。 所以： 胰蛋白酶溶液的活力单位（BAEE 单位 / ml）＝ 稀释倍数 酶液加入体积 0.001 (min) A253 胰蛋白酶比活力（BAEE 单位 / mg ）＝ 胰酶浓度 ／ 酶液加入体积 酶液活力 (mg ml) 2. 卵粘蛋白抑制活性的测定 胰蛋白酶抑制活力单位的定义：抑制一个胰蛋白酶活力单位（BAEE 单位）所需卵粘 蛋白的量，定为抑制剂的一个活力单位（英文缩写为 BAEE TIu）。 具体测定方法如下：首先以底物（不加酶）于 253nm 处校正仪器光吸收零点 （操作 如上述）；再测定标准酶的活力单位（操作如上述）；测定加入抑制剂后剩余酶活力单位； 在比色杯中加入 0.2ml 上述标准酶液再加入适量的抑制剂（一般不能超过标准酶含量，以 1：2 左右为宜，具体视抑制剂的纯度而定），再加入 1.8 ml 0.05mol/L pH = 8.0 Tris-HCl 缓冲液，摇匀后于 25℃放置 2 分钟以上，让酶与抑制剂充分结合。最后加入 0.8ml 底物 （BAEE 溶液），摇匀立即记时，测定 A253 的变化。计算剩余酶活力单位。 按下面方式计算出抑制剂的抑制活力和抑制比活力： 抑制剂溶液的抑制活力 Iu＝ Vi A Ai Ni 0.001 0－ （BAEE 抑制单位/ml） 抑制比活力 ＝ (mg ml) Iu 加入抑制剂蛋白浓度 ／ （ BAEE T Iu / mg ） 式中： A0：未加抑制剂时，酶每分钟A253 增加值 Ai.：加入抑制剂后，酶每分钟A253 的增加值 N i：抑制剂溶液的稀释倍数 V i：测定时加入抑制剂的体积
附录三:猪胰蛋白和卵粘蛋白浓度的计算 1.猪胰蛋白酶浓度(mgml)=A280×(1/1.35)×稀释倍数 2.鸡卵粘蛋白浓度(mg/ml)=A28×(1/0413)×稀释倍数 附录四 活性测定加样顺序参照表 试剂空白杯胰酶活力抑制剂活力」 0.05mol/L pH =8.0 Tris-HCl Buffer 2.0 2.0 1.9~1.8 胰蛋白酶溶液(m) 0.2 0.2 「鸡卵粘蛋白溶液(ml) 0.001mol/L HCI( ml 1mmol/L底物(BAEE)(m1) 0.8 0.8 0.8 总体积(ml) 3.0 3.0 注:测定胰酶活性时,酶的用量约5~10μg。测鸡卵粘蛋白抑制活性时,用标准 胰蛋白酶。前几种溶液先反应2min后再加BAEE。 参考文献 Robinson, N.C.Tye, R. W, Neurath H. And walsh K A. Isolation of trypsin by Affinity Chromatography Biochemistry, (1971), 102743 2. Frederig E and H F. Deutsch; Studies on Ovomucoid, J Biol. Chem(1949) 3. Kassell B. Proteinase inhibitors from egg white. Methods in Enzymology (1970)xlx,890. Sandberg L And J porath, Preparation of adsorbents for bio-specific Affinity Chromatography. J Chromatography (1974)90.87. 5. pedro Cuatrecasas, Protein purification by Affinity Chromatography J Biol Chem(1970)245(12)3059 6. T G. Cooper: The tools of Biochemistry Chromatography. 7.袁中一等:《固相酶与亲和层析》科学出版社1975年。 8.王重庆等,《高级生物化学实验教程》北京大学出版社1994年
256 附录三：猪胰蛋白和卵粘蛋白浓度的计算 1. 猪胰蛋白酶浓度（mg/ml）= A280 ×( 1 / 1.35 ) × 稀释倍数 2. 鸡卵粘蛋白浓度（mg/ml）= A280 × ( 1 / 0.413 ) × 稀释倍数 附录四： 活性测定加样顺序参照表 试 剂 空白杯 胰酶活力 抑制剂活力 0.05mol/L pH = 8.0 Tris-HCl Buffer ( ml ) 2.0 2.0 1.9 ~ 1.8 胰蛋白酶溶液 ( ml ) ⎯ 0.2 0.2 鸡卵粘蛋白溶液 ( ml ) ⎯ ⎯ 0.1 ~ 0.2 0.001mol/L HCl ( ml ) 0.2 ⎯ ⎯ 1 mmol/L 底物 ( BAEE ) ( ml ) 0.8 0.8 0.8 总体积 ( ml ) 3.0 3.0 3.0 注：测定胰酶活性时，酶的用量约 5 ~ 10 g 。 测鸡卵粘蛋白抑制活性时，用标准 胰蛋白酶。前几种溶液先反应 2min 后再加 BAEE。 参考文献 1. Robinson ,N.C.Tye,R. W; Neurath H. And walsh K.A. Isolation of trypsin by Affinity Chromatography .Biochemistry, (1971),10 2743. 2. Frederig E and H. F. Deutsch; Studies on Ovomucoid, J. Biol .Chem(1949),181,499. 3. KasselI.B. Proteinase inhibitors from egg white . Methods in Enzymology (1970)xIx,890.. 4. Sandberg L.And J.porath ， Preparation of adsorbents for bio-specific Affinity Chromatography. J. Chromatography (1974)90.87. 5. pedro Cuatrecasas, Protein purification by Affinity Chromatography J.Biol. Chem(1970)245 (12)3059. 6. T. G. Cooper: The tools of Biochemistry Chromatography. 7. 袁中一等：《固相酶与亲和层析》 科学出版社 1975 年。 8. 王重庆等，《高级生物化学实验教程》 北京大学出版社 1994 年