实验二凝胶层析法测定蛋白质分子量 、实验目的 1.了解凝胶层析的原理及其应用。 2.通过测定蛋白质分子量的训练,初步掌握凝胶层析技术。 、实验原理 凝胶层析又称排阻层析,凝胶过滤,渗透层析或分子筛层析等。它广泛地应用于 分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等,而测定蛋白质的分子量也是它的重 要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来 分离物质,主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子(近于球形)具有不同的排 阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。分离原理参见 理论部分的3.2凝胶层析一·节”。对于某种型号的凝胶,一些大分子不能进入凝胶 颗粒内部而完全被排阻在外,只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外;而一些小分子不被排 阻,可自由扩散,渗透进入凝胶内部的筛孔,尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小, 进入凝胶内部越深,所走的路程越多,故小分子最后流出柱外,而大分子先从柱中流 出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间,只能进入一部分凝胶较大的孔隙 亦即部分排阻,因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经 过凝胶层析后,分子便按照从大到小的顺序依次流出,达到分离的目的。 凝胶层析分离原理示意图参见64页的“图3-5” 对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间,其 被排阻的程度可以用有效分配系数Kav(分离化合物在内水和外水体积中的比例关系) 表示,Kav值的大小和凝胶柱床的总体积(vt)、外水体积(V)以及分离物本身的洗 脱体积(Ve)有关 Kav =(Ve-Vo)/(Vt-vo) (1) 在限定的层析条件下,Vt和V都是恒定值,而Ve是随着分离物分子量的变化而改 变。分子量大,ve值小,Kav值也小。反之,分子量小Ve值大,Kav值大。 65页的“图3-6”画出了凝胶层析柱中凝胶自身(基质)体积(Vg)、外水体积 (V)、内水体积(Vi)及柱床总体积(Vt)的示意图 65页的“图3-7”示出了凝胶层析柱中的几种层析峰 有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要参数,同时也是测定蛋白质分子量的 个依据。在相同层析条件下,被分离物质Kav值差异越大,分离效果越好。反之,分 离效果差或根本不能分开。在实际的实验中,我们可以实测出Vt、V及Ve的值,从而 计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶,在一定的分子量范围内,Kav与 logO(Mw 表示物质的分子量)成线性关系 C 其中b,C为常数 18
181 实验二 凝胶层析法测定蛋白质分子量 一、实验目的 1. 了解凝胶层析的原理及其应用。 2. 通过测定蛋白质分子量的训练，初步掌握凝胶层析技术。 二、实验原理 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。它广泛地应用于 分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质的分子量也是它的重 要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来 分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排 阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。分离原理参见 “理论部分的3.2 凝胶层析一节”。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶 颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排 阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小， 进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流 出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙， 亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经 过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 凝胶层析分离原理示意图参见64页的“图 3－5”。 对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0～100%之间，其 被排阻的程度可以用有效分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系） 表示，Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以及分离物本身的洗 脱体积（Ve）有关： Kav = (Ve－V0)/(Vt－V0) ----------- (1) 在限定的层析条件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是随着分离物分子量的变化而改 变。分子量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小Ve值大，Kav值大。 65页的“图 3－6”画出了凝胶层析柱中凝胶自身（基质）体积（Vg）、外水体积 （V0）、内水体积（Vi）及柱床总体积（Vt）的示意图。 65页的“图 3－7”示出了凝胶层析柱中的几种层析峰。 有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子量的 一个依据。在相同层析条件下，被分离物质Kav值差异越大，分离效果越好。反之，分 离效果差或根本不能分开。在实际的实验中，我们可以实测出Vt、V0及Ve的值，从而 计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶，在一定的分子量范围内，Kav与logMw (Mw 表示物质的分子量) 成线性关系： Kav ＝－b logMw + C --------- (2) 其中 b,C为常数
同样可以得到: Ve=-b’ logMw+C 其中b’,C为常数。即ve与 logIn也成线性关系。我们可以通过在一凝胶柱 上分离多种已知分子量的蛋白质后,并根据上述的线性关系绘出标准曲线,然后用同 凝胶柱测出其它未知蛋白的分子量 、器材与试剂 (一)器材 1.玻璃层析柱((20mm×60cm) 2.恒流泵(或下口恒压贮液瓶) 3.自动部分收集器 4.紫外分光光度计 5.100m1试剂瓶 6.1000m1量筒 7.250ml烧杯 8.50ml、100ml烧杯 9.10m1(或5m1)刻度试管 (二)试剂 标准蛋白 (1)牛血清白蛋白:Mw=67,000(上海生化所) (2)鸡卵清清蛋白:Mw=45,0(美国 SIGMA公司) (3)胰凝乳蛋白酶原A:Mw=24,000(美国 SIGMA公司) (4)溶菌酶:Mw=14,300 2.未知蛋白质样品:由实验室准备 3.0.025MKCl-0. IM HAC(乙酸)(洗脱液1000m1) 4.蓝色葡聚糖一2000 四、实验操作 (一)凝胶的溶胀 称取7 g Sephadex G-75于250ml烧杯中加入洗脱液100ml,置室温溶胀2~3天, 反复倾泻去掉细颗粒,然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气,沸水浴中煮沸2~3小时 (可去除颗粒内部的空气及灭菌)。 (二)装柱 取洁净的的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上 2.凝胶柱总体积(Vt)的测定 在距柱上端约5cm处作一记号,关闭柱出水口,加入去离子水,打开出水口,液 面降至柱记号处即关闭出水口,然后用量筒接收柱中去离子水(水面降至层析柱玻璃 筛板),读出的体积即为柱床总体积Vt。也可以最后走完未知蛋白后再测定Vt
182 同样可以得到： Ve ＝－b'logMw + C' --------- (3) 其中 b', C'为常数。即 Ve 与 logMw 也成线性关系。我们可以通过在一凝胶柱 上分离多种已知分子量的蛋白质后，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后用同 一凝胶柱测出其它未知蛋白的分子量。 三、器材与试剂 （一）器材 1. 玻璃层析柱（(20mm×60cm） 2. 恒流泵（或下口恒压贮液瓶） 3. 自动部分收集器 4. 紫外分光光度计 5. 100ml试剂瓶 6. 1000ml量筒 7. 250ml烧杯 8. 50ml、100ml烧杯 9. 10ml（或5ml）刻度试管 （二）试剂 1. 标准蛋白 （1）牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所） （2）鸡卵清清蛋白：Mw=45,000（美国SIGMA公司） （3）胰凝乳蛋白酶原A：Mw=24,000（美国SIGMA公司） （4）溶菌酶：Mw =14,300 2. 未知蛋白质样品：由实验室准备 3. 0.025M KCl－0.1M HAC(乙酸)（洗脱液1000ml） 4. 蓝色葡聚糖－2000 四、实验操作 （一）凝胶的溶胀 称取7g Sephadex G-75 于 250ml 烧杯中加入洗脱液100ml，置室温溶胀2～3天， 反复倾泻去掉细颗粒，然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气，沸水浴中煮沸2～3小时 （可去除颗粒内部的空气及灭菌）。 （二）装柱 1. 取洁净的的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。 2. 凝胶柱总体积（Vt）的测定： 在距柱上端约 5cm 处作一记号，关闭柱出水口，加入去离子水，打开出水口，液 面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接收柱中去离子水（水面降至层析柱玻璃 筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt。也可以最后走完未知蛋白后再测定Vt
3.在柱中注入洗脱液(约1/3柱床高度),将凝胶浓浆液缓慢倾入柱中,待凝胶沉 积约1cm~2cm高度后打开出水口,流速一般用3m1~6m1/10min。胶面上升到柱 记号处则装柱完毕,注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口,静置片刻,等 凝胶完全沉降,则接上恒流泵,用1~2倍床体积的洗脱液平衡柱子,使柱床稳定。 (三)V的测定 吸去柱上端的洗脱液(切不要搅乱胶面,可复盖一张滤纸或尼龙网)。打开出水 口,使残余液体降至与胶面相切(但不要干胶),关闭出水口。用细滴管吸取0.5ml (2mg/m1)蓝色葡聚糖一2000,小心地绕柱壁一圈(距胶面2mm)缓慢加入,然后迅速 移至柱中央慢慢加入柱中,打开出水口(开始收集!),等溶液滲入胶床后,关闭出 水口,用少许洗脱液加入柱中,渗入胶床后,柱上端再用洗脱液充满后用3m1/10分钟 的的速度开始洗脱。最后作出洗脱曲线。收集并量出从加样开始至洗脱液中蓝色葡聚 糖浓度最高点的洗脱液体积即为V。注意:蓝色葡聚糖洗下来之后,还要用洗脱液(1 2倍床体积)继续平衡一段时间,以备下步实验使用 (四)标准曲线的制作 1.用洗脱液配制标准蛋白溶液全班共用,溶液中四种蛋白的浓度各为:牛血清淸蛋 白(2.5mg/m1)、鸡卵清清蛋白(6.0mg/m1)、胰凝乳蛋白酶原A(2.5ng/m1)和溶菌 酶(2.5mg/m1)。 2.按(三)的操作方法加入上述标准蛋白溶液(0.5m1~1m1),以1.5ml/管/5分 钟的速度洗脱并收集洗脱液 3.用紫外分光光度计逐管测定A3,并确定各种蛋白的洗脱峰最高点,然后量出各 种蛋白的洗脱体积ve。由于每管只收集了1.5ml洗脱液,量比较少,因此比色时要加 入一定量的洗脱液进行测定。(一般的比色杯可以盛装3ml溶液)。当然,也可以用微 量比色杯进行测定 4.以A30为纵座标,Ve为横座标画出标准蛋白的洗脱曲线。 5.以Kav为纵座标, logO为横座标作图画出一条标准曲线。 6.以Ve为纵座标, logMw为横座标作图画出一条标准曲线。 (五)未知蛋白分子量的测定 测定方法同标准曲线制作的1.、2.、3.步相同,然后在标准曲线上查得1ogMw,其反对 数便是待测蛋白质的分子量 注意:实验完毕后,将凝胶全部回收处理,以备下次实验使用,严禁将凝胶丢弃 或倒入水池中。 参考文献 1.李建武等,《生物化学实验原理和方法》1994年 2.赵永芳《生物化学技术原理及其应用》1994年 3. ROBERTL drYer GENEF LATA <EXPERIMENTAL BIOCHEMISTRY 1989 18
183 3. 在柱中注入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆液缓慢倾入柱中，待凝胶沉 积约1cm ～ 2cm 高度后打开出水口，流速一般用3ml～6ml / 10 min。胶面上升到柱 记号处则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口，静置片刻，等 凝胶完全沉降，则接上恒流泵，用1～2倍床体积的洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。 （三）V0的测定 吸去柱上端的洗脱液（切不要搅乱胶面，可复盖一张滤纸或尼龙网）。打开出水 口，使残余液体降至 与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用细滴管吸取０.5 ml （2mg/ml）蓝色葡聚糖—2000，小心地绕柱壁一圈（距胶面2mm）缓慢加入,然后迅速 移至柱中央慢慢加入柱中，打开出水口（开始收集！），等溶液渗入胶床后，关闭出 水口，用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗 脱液充满后用3ml/10分钟 的的速度开始洗脱。最后作出洗脱曲线。收集并量出从加样开始至洗脱液中蓝色葡聚 糖浓度最高点的洗脱液体积即为V0。注意：蓝色葡聚糖洗下来之后，还要用洗脱液（１～ ２倍床体积）继续平衡一段时间，以备下步实验使用。 （四）标准曲线的制作 1. 用洗脱液配制标准蛋白溶液全班共用，溶液中四种蛋白的浓度各为：牛血清清蛋 白（2.5mg/ml）、鸡卵清清蛋白（6.0mg/ml）、胰凝乳蛋白酶原A（2.5mg/ml）和溶菌 酶（2.5mg/ml）。 2. 按（三）的操作方法加入上述标准蛋白溶液（0.5ml～1 ml），以1.5ml/管/5分 钟的速度洗脱并收集洗脱液。 3. 用紫外分光光度计逐管测定 A280，并确定各种蛋白的洗脱峰最高点，然后量出各 种蛋白的洗脱体积 Ve。由于每管只收集了1.5ml洗脱液，量比较少，因此比色时要加 入一定量的洗脱液进行测定。（一般的比色杯可以盛装3ml溶液）。当然，也可以用微 量比色杯进行测定。 4. 以 A280 为纵座标，Ve 为横座标画出标准蛋白的洗脱曲线。 5. 以 Kav 为纵座标，logMw 为横座标作图画出一条标准曲线。 6. 以 Ve 为纵座标，logMw 为横座标作图画出一条标准曲线。 （五）未知蛋白分子量的测定 测定方法同标准曲线制作的1.、2.、3. 步相同，然后在标准曲线上查得logMw,其反对 数便是待测蛋白质的分子量。 注意： 实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，严禁将凝胶丢弃 或倒入水池中。 参考文献 1. 李建武等，《生物化学实验原理和方法》1994年 2. 赵永芳《生物化学技术原理及其应用》1994年 3. ROBERTL.DRYER & GENEF.LATA 《EXPERIMENTAL BIOCHEMISTRY》1989