加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染， 也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法LISA)需用稀释的血清，可在试管中按规 定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器 上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅 速完成。 4.4保温 在LISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定 的温度和时间，这一保温过程称为温有(incubation)),有人称之为孵有，在ELISA中似不怡当。 ELIS属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入 板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中 的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加 入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么LISA反应总是需要一定时间的温有。 温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度， 也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立LISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗 原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些 试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反 应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在LISA中一般不予采用。 保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中， ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜 覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，LISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热 性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELIS板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱 中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温有，反应板均不 宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范 围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温有。室温温有时，LISA 板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人 操作时，一次不宜多于两块板同时测定。 4.5洗涤 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分 离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物 质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染， 也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法 ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规 定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器 上震荡 1 分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅 速完成。 4.4 保温 在 ELISA 中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定 的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在 ELISA 中似不恰当。 ELISA 属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入 板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中 的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加 入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么 ELISA 反应总是需要一定时间的温育。 温育常采用的温度有 43℃、37℃、室温和 4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度， 也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立 ELISA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗 原抗体反应一般在 37℃经 1-2 小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些 试验在 43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应 4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反 应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在 ELISA 中一般不予采用。 保温的方式除有的 ELISA 仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将 ELISA 板置于水浴箱中， ELISA 板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜 覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA 板应放在湿盒内，湿盒要选用传热 性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将 ELISA 板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱 中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不 宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范 围内，标准室温温度是指 20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA 板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人 操作时，一次不宜多于两块板同时测定。 4.5 洗涤 洗涤在 ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分 离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物 质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是