普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在LISA操作中，洗 涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。 洗涤的方式除某些LISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种，过 程如下 (1)浸泡式a.吸干或甩干孔内反应液：b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）：℃. 浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短：.吸干孔内液体。 吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干：。，重复操作c 和d,洗涤3-4次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。 微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋 白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏 水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用， 使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓 度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。 (2)流水冲洗式流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤 时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗2分钟后，吸干液体，再用燕 馏水浸泡2分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为彻底，且 也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流 量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。 4.6显色和比色 4.6.1显色 显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间 仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。 适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准 确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照 孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判断， 0D底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增 高。OD底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。 OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。 TB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性， 宜在规定的适当时间阅读结果。TB经H即作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小 普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在 ELISA 操作中，洗 涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。 洗涤的方式除某些 ELISA 仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种，过 程如下： （1）浸泡式 a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c. 浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置 1-2 分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸干孔内液体。 吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作 c 和 d，洗涤 3-4 次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。 微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋 白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏 水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用， 使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温 20，其浓 度可在 0.05%-0.2%之间，高于 0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。 （2）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤 时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗 2 分钟后，吸干液体，再用蒸 馏水浸泡 2 分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为彻底，且 也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流 量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。 4.6 显色和比色 4.6.1 显色 显色是 ELISA 中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间 仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。 适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准 确。定性测定的显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照 孔的显色情况适当缩短或延长反应时间，及时判断。 OPD 底物显色一般在室外温或 37℃反应 20-30 分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增 高。OPD 底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。 OPD 产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。 TMB 受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性， 宜在规定的适当时间阅读结果。TMB 经 HRP 作用后，约 40 分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至 2 小