Vol.29 SuppL 2 邢奕等：应用耐冷菌株改善寒冷地区冬季人工湿地系统生物脱氨效果 55 K=1十k2十k3十十a 温度在15℃左右.当环境温度低于最适生长温度 (2) n 时，耐冷菌的比生长速率降低.当环境温度降至5℃ 8=0.678/k (3) 时，NL01、NL02、NL03的比生长速率分别为 式中，k:为比生长速率，h；x1为时间1对应的 0.059、0.046、0.051h1;世代时间分别为11.54、 0D8值；x2为时间t2对应的0D8o值；t1、t2为培 14.83、13.22h,三种耐冷菌在5℃仍具有相对较高 养时间，h;k为平均比生长速率，h'；n=8;g为 的比生长速率以及相对较短的世代时间，说明在低 世代时间，h. 温条件下，此三种耐冷菌的活性比较高，代谢相对活 通过电镜实验观察耐冷菌的形态，并对各耐冷 跃.当温度高于20℃时，比增长速率迅速降低，世 菌的生理生化特性进行鉴定. 代时间也随之增长.在40C时，NL01、NL02、NL03 3.3耐冷菌的硝化影响指标实验 及NL04(复合菌株)则停止生长.NL04的世代时间 pH值、温度是影响微生物硝化反应的重要指 基本比单独三种任何菌株要短，这是因为，复合菌株 标.pH值的影响可以通过Q.1M的H2SO4/NaOH 具有协同效应，可以在恶劣环境中互相促进，从而激 分别调节培养基的pH值为5、6、7、8、9、10，保持其 发了其活性. 他条件不变连续监测10d,在680nm处分别测得最 大浊度值并测定培养液的氨氮的降解率，以确定三 50 100 株耐冷菌株生长的最佳pH值.温度的影响可利用 量一氨氮浓度（空白） 40 ◆一氨氮浓度NL01) 生物荧光层析光谱仪，通过测定菌株在不同温度下 ★一 氨氯浓度NL02) 60 氨氮浓度QNL03) (一2、5、15、25、35℃的荧光强度来反应耐冷菌的 …量…去除率（空白） 40 …◆·去除率NL01) 生物活性强度. ▲·去除率CNL02) ·=·去除率NL03) 3.4耐冷菌的工程性实验研究 在石家庄机械化步兵学院生态园建设6个 0 1234567 0.5m×05m的湿地生态床，命名为A、B、C、D、E、 时间d F.A、B种植芦苇，C、D种植香蒲，E、F种植睡莲. 图1第四轮菌液去除氨氨效果对比 分别把不同菌株投加到湿地A、C、E中，设定停留时 间为10d,其他湿地作为空白，追踪测定氨氮变化情 0.20 况. ■一NL01 0.15 ◆一NL02 4结果与讨论 ▲一NL03 一NL04 41人工湿地系统耐冷菌的筛选培养 0.10 经四轮培养、分离、纯化，得到了三种优势菌株 0.05 I-X5、IF1、I-M3.分别命名为NL01、NL02、 NL03.与其他菌株相比，它们更加适应低温环境， 40 生物量明显提高，NL01在第4天进入稳定期，NL03 1520253035 温度/℃ 在第5天进入稳定期，而NL02则需要6天.其中， NLO2去除氨氮效果最明显，氨氮去除率比对照床 图2不同菌种不同温度下的比增长速率 提高了52.46%，NL01、NL03分别提高了4618% 扫描电镜结果显示，NLO1主要是球状菌，包含 和50.85%：随着纯化阶段的深入，三种耐冷菌株氨 部分短杆菌；NL02是丝状菌，菌株个体相对较大， 氮去除率稳步提高，分别由第一轮的62.06%、 相互依附：NL03是杆状菌：NL04为混合菌.包含球 6284%及63.91%提高到第四轮的68.32%、 状菌和杆状菌.NL02菌体可以分泌大量的黏液，致 7460%及72.99%.第一轮培养时，菌液由混杂菌 使其菌体周围有许多突出的触角与基质相连，黏液 构成，包含了大量的中温菌或常温菌，在低温条件 会增强细菌菌体自身的免疫性能，保护其免受环境 下，这些菌株活性降低，直接影响了脱氮效果，氨氮 因素突变和带来的损伤，这些黏液是膜流动和相结 去除率的提高说明菌液逐步得到了纯化.图1对第 构的外观反映，它保证了膜中镶嵌的蛋白质发挥正 四轮菌液去除氨氮效果进行了对比 常的功能，如离子和营养的吸收、电子转移等习，因 42耐冷菌的性质实验 由图2和图3可知，这三种耐冷菌的最适生长 此NL02菌体的黏液分布有很重要的意义，可以很k = k 1 +k 2 +k 3 +…+kn n ( 2) g =0.678/ k ( 3) 式中, k i 为比生长速率, h -1 ;x 1 为时间 t 1 对应的 OD680值 ;x 2 为时间 t 2 对应的 OD680值;t 1 、t 2 为培 养时间, h ;k 为平均比生长速率, h -1 ;n =8 ;g 为 世代时间, h . 通过电镜实验观察耐冷菌的形态, 并对各耐冷 菌的生理生化特性进行鉴定. 3.3 耐冷菌的硝化影响指标实验 pH 值、温度是影响微生物硝化反应的重要指 标.pH 值的影响可以通过 0.1 M 的 H2SO4/NaOH 分别调节培养基的 pH 值为 5 、6 、7 、8 、9 、10, 保持其 他条件不变连续监测 10 d, 在 680 nm 处分别测得最 大浊度值并测定培养液的氨氮的降解率, 以确定三 株耐冷菌株生长的最佳 pH 值 .温度的影响可利用 生物荧光层析光谱仪, 通过测定菌株在不同温度下 ( -2 、5 、15 、25 、35 ℃) 的荧光强度来反应耐冷菌的 生物活性强度. 3.4 耐冷菌的工程性实验研究 在石家庄机械化步兵学院生态园建设 6 个 0.5 m ×0.5 m 的湿地生态床, 命名为 A 、B 、C 、D 、E 、 F .A 、B 种植芦苇, C 、D 种植香蒲, E 、F 种植睡莲 . 分别把不同菌株投加到湿地 A 、C 、E 中, 设定停留时 间为 10 d, 其他湿地作为空白, 追踪测定氨氮变化情 况. 4 结果与讨论 4.1 人工湿地系统耐冷菌的筛选培养 经四轮培养 、分离 、纯化, 得到了三种优势菌株 Ⅳ-X5 、Ⅳ-F1 、Ⅳ-M 3, 分别命名为 N L01 、NL02 、 N L03 .与其他菌株相比, 它们更加适应低温环境, 生物量明显提高, NL01 在第 4 天进入稳定期, N L03 在第 5 天进入稳定期, 而 NL02 则需要 6 天 .其中, N L02 去除氨氮效果最明显, 氨氮去除率比对照床 提高了 52.46 %, N L01 、NL03 分别提高了 46.18 % 和 50.85 %;随着纯化阶段的深入, 三种耐冷菌株氨 氮去除率稳步提高, 分别由第一轮的 62.06 %、 62.84 %及 63.91 %提高 到 第 四 轮 的 68.32 %、 74.60 %及 72.99 %.第一轮培养时, 菌液由混杂菌 构成, 包含了大量的中温菌或常温菌, 在低温条件 下, 这些菌株活性降低, 直接影响了脱氮效果, 氨氮 去除率的提高说明菌液逐步得到了纯化.图 1 对第 四轮菌液去除氨氮效果进行了对比 . 4.2 耐冷菌的性质实验 由图 2 和图 3 可知, 这三种耐冷菌的最适生长 温度在 15 ℃左右 .当环境温度低于最适生长温度 时, 耐冷菌的比生长速率降低.当环境温度降至5 ℃ 时, N L01 、 NL02 、N L03 的 比 生 长 速 率 分 别 为 0.059 、0.046 、0.051 h -1 ;世代时间分别为 11.54 、 14.83 、13.22 h, 三种耐冷菌在 5 ℃仍具有相对较高 的比生长速率以及相对较短的世代时间, 说明在低 温条件下, 此三种耐冷菌的活性比较高, 代谢相对活 跃 .当温度高于 20 ℃时, 比增长速率迅速降低, 世 代时间也随之增长 .在 40 ℃时, NL01 、N L02 、NL03 及 NL04( 复合菌株) 则停止生长.NL04 的世代时间 基本比单独三种任何菌株要短, 这是因为, 复合菌株 具有协同效应, 可以在恶劣环境中互相促进, 从而激 发了其活性 . 图 1 第四轮菌液去除氨氮效果对比 图 2 不同菌种不同温度下的比增长速率 扫描电镜结果显示, NL01 主要是球状菌, 包含 部分短杆菌 ;NL02 是丝状菌, 菌株个体相对较大, 相互依附 ;NL03 是杆状菌 ;N L04 为混合菌, 包含球 状菌和杆状菌.NL02 菌体可以分泌大量的黏液, 致 使其菌体周围有许多突出的触角与基质相连, 黏液 会增强细菌菌体自身的免疫性能, 保护其免受环境 因素突变和带来的损伤, 这些黏液是膜流动和相结 构的外观反映, 它保证了膜中镶嵌的蛋白质发挥正 常的功能, 如离子和营养的吸收 、电子转移等[ 5] , 因 此 NL02 菌体的黏液分布有很重要的意义, 可以很 Vol.29 Suppl.2 邢奕等:应用耐冷菌株改善寒冷地区冬季人工湿地系统生物脱氮效果 · 55 ·