应用耐冷菌株改善寒冷地区冬季人工湿地系统生物脱氮效果

D01:10.13374j.isml00103x.2007.s2.084 第29卷增刊2 北京科技大学学报 Vol.29 SuppL 2 2007年12月 Journal of University of Science and Technology Beijing Dec.2007 应用耐冷菌株改善寒冷地区冬季人工 湿地系统生物脱氮效果 邢奕”钱大益》 应高祥2) 1)北京科技大学土木与环境工程学院，北京1000832)佛罗里达州立大学环境工程与科学系.美国 摘要通过探索性实验，确定了三种耐冷菌培养基，分别用于培养耐冷细菌、耐冷放线菌和耐冷霉菌.培养出的耐冷菌株在 6℃条件下被分离纯化，然后通过一系列实验分别鉴定它们的生理特性并检验它们的脱氮能力，并测定pH值，温度对脱氮效 果的影响规律.实验结果显示pH值为7~8时，各菌株生长得最好：生物荧光层析光谱实验发现三种菌株都在15℃左右活性 最大，0℃以下仍有一定的活性，高于35℃时，基本失去正常的代谢能力.当实验菌液投加量为50%，实验温度为6℃，三种 耐冷菌对氨氮的去除率分别为57.7%、590%及587%，相同条件下，投加混合菌种可使氨氮的去除率提高到67.2%. 关键词污水回用：人工湿地：低温：脱氮：耐冷菌 分类号X7031 人工湿地技术是国际上近几十年发展起来的一 纪70年代就有了耐冷菌的分离研究.但到目前为 种废水处理新技术，其特点是投资少、效率高、运行 止，在人工湿地中的应用还尚属空白.本文针对人 费用低、维护方便.高效率不仅体现在对有机物有 工湿地系统在冬季脱氮效果差的问题，通过液态、固 较强的降解能力，而且对N、P的去除率也较高.国 态培养基交替培养纯化，培养，驯化出在低温条件下 内外的研究表明，在进水浓度较低的情况下，人工湿 仍能保持较强活性的耐冷菌株，使硝化过程在冬天 地对B0D5的去除率可达85%~95%，C0D的去除 较低温度条件下仍可正常进行，从而显著提高人工 率可达80%以上，对N的去除率可达60%以上，对 湿地在低温条件下的脱氮效果. P的去除率可达90%以上刂，其缺点是低温条件 1人工湿地微生物脱氮机理 下，由于植物根系微生物活性降低，致使系统脱氮效 果变差，进而影响此工艺的季节稳定性 人工湿地中微生物的作用是净化污水的最主要 潜流型人工湿地是近年来发展起来的一种湿地 因素，有机物的降解和含氮化合物的脱氮作用主要 工艺，在人工湿地的植物表面覆盖保温材料，可有效 是由湿地植物根区的微生物活动来完成的.植物根 提高湿地内温度，防止结冰并减缓了植物休眠：通过 系将氧气输送到根区，形成了根表面的氧化状态，废 控制湿地水力条件和运行方式，可提高湿地系统的 水中大部分的有机物质在这一区域被好氧微生物分 温度和溶解氧值，促进NH一N的正常硝化.潜流 解为CO2和水氨则被这一区域的硝化细菌硝化： 型人工湿地的特点是污水在处理过程中被表层土覆 离根表面较远的区域氧气浓度降低（属于兼性厌氧 盖，减小因蒸发和流动造成的能量损失，相对于其他 区)，硝化作用仍然存在，但主要依靠反硝化细菌将 湿地形式而言，在冬季或北方较寒冷地区使用更具 有机物降解，并使氮素物质以N2的形式释放到大 优势.但是，仅仅通过改进湿地工艺的形式，也很难 气中：在根区的还原状态区域则是经过厌氧细菌的 彻底解决冬季低温条件下脱氮效果差的问题.因此 发酵作用将有机物分解成CO2和CH4释放到大气 本文结合微生物硝化原理，提出了人工湿地系统中 中.由于人工湿地存在着这样一些氧化区、兼性区 应用硝化耐冷菌提高生物脱氮效果的设想. 和还原区，通过不同区域微生物的相互配合作用而 国内耐冷菌的应用研究起步较晚.直到20世纪 去除有机物以及含氯化合物等？， 在二级处理水中，氮以氨态氮、亚硝酸氮和硝酸 90年代，才有了比较系统的认识，并探讨了耐冷菌 氮等形式存在.自然界存在着氮循环的现象，采取 在低温条件下对污染物的生物降解作用，国外20世 适当的运行条件可将这一自然过程运用在去除生化 收稿日期：2007-10-12 污泥处理系统中的氮.微生物脱氮主要表现为两个 作者简介：邢奕(1976一)，男.讲师，博士 过程硝化与反硝化

应用耐冷菌株改善寒冷地区冬季人工 湿地系统生物脱氮效果 邢 奕 1) 钱大益 1) 应高祥 2) 1) 北京科技大学土木与环境工程学院, 北京 100083 2) 佛罗里达州立大学环境工程与科学系, 美国 摘 要 通过探索性实验, 确定了三种耐冷菌培养基, 分别用于培养耐冷细菌、耐冷放线菌和耐冷霉菌.培养出的耐冷菌株在 6 ℃条件下被分离纯化, 然后通过一系列实验分别鉴定它们的生理特性并检验它们的脱氮能力, 并测定 pH 值、温度对脱氮效 果的影响规律.实验结果显示 pH 值为 7～ 8 时, 各菌株生长得最好;生物荧光层析光谱实验发现三种菌株都在 15 ℃左右活性 最大, 0 ℃以下仍有一定的活性, 高于 35 ℃时, 基本失去正常的代谢能力.当实验菌液投加量为 5.0 %, 实验温度为 6 ℃, 三种 耐冷菌对氨氮的去除率分别为 57.7 %、59.0%及 58.7%, 相同条件下, 投加混合菌种可使氨氮的去除率提高到 67.2 %. 关键词 污水回用;人工湿地;低温;脱氮;耐冷菌 分类号 X703.1 收稿日期:2007-10-12 作者简介:邢 奕( 1976—) , 男, 讲师, 博士 人工湿地技术是国际上近几十年发展起来的一 种废水处理新技术, 其特点是投资少、效率高、运行 费用低 、维护方便 .高效率不仅体现在对有机物有 较强的降解能力, 而且对 N 、P 的去除率也较高 .国 内外的研究表明, 在进水浓度较低的情况下, 人工湿 地对 BOD5 的去除率可达 85 %～ 95 %, COD 的去除 率可达 80 %以上, 对 N 的去除率可达 60 %以上, 对 P 的去除率可达 90 %以上[ 1] .其缺点是低温条件 下, 由于植物根系微生物活性降低, 致使系统脱氮效 果变差, 进而影响此工艺的季节稳定性 . 潜流型人工湿地是近年来发展起来的一种湿地 工艺, 在人工湿地的植物表面覆盖保温材料, 可有效 提高湿地内温度, 防止结冰并减缓了植物休眠 ;通过 控制湿地水力条件和运行方式, 可提高湿地系统的 温度和溶解氧值, 促进 NH + 4 -N 的正常硝化 .潜流 型人工湿地的特点是污水在处理过程中被表层土覆 盖, 减小因蒸发和流动造成的能量损失, 相对于其他 湿地形式而言, 在冬季或北方较寒冷地区使用更具 优势.但是, 仅仅通过改进湿地工艺的形式, 也很难 彻底解决冬季低温条件下脱氮效果差的问题 .因此 本文结合微生物硝化原理, 提出了人工湿地系统中 应用硝化耐冷菌提高生物脱氮效果的设想. 国内耐冷菌的应用研究起步较晚, 直到 20 世纪 90 年代, 才有了比较系统的认识, 并探讨了耐冷菌 在低温条件下对污染物的生物降解作用, 国外 20 世 纪 70 年代就有了耐冷菌的分离研究, 但到目前为 止,在人工湿地中的应用还尚属空白.本文针对人 工湿地系统在冬季脱氮效果差的问题, 通过液态 、固 态培养基交替培养纯化, 培养、驯化出在低温条件下 仍能保持较强活性的耐冷菌株, 使硝化过程在冬天 较低温度条件下仍可正常进行, 从而显著提高人工 湿地在低温条件下的脱氮效果. 1 人工湿地微生物脱氮机理 人工湿地中微生物的作用是净化污水的最主要 因素, 有机物的降解和含氮化合物的脱氮作用主要 是由湿地植物根区的微生物活动来完成的 .植物根 系将氧气输送到根区, 形成了根表面的氧化状态, 废 水中大部分的有机物质在这一区域被好氧微生物分 解为 CO2 和水, 氨则被这一区域的硝化细菌硝化; 离根表面较远的区域氧气浓度降低( 属于兼性厌氧 区) , 硝化作用仍然存在, 但主要依靠反硝化细菌将 有机物降解, 并使氮素物质以 N2 的形式释放到大 气中;在根区的还原状态区域, 则是经过厌氧细菌的 发酵作用将有机物分解成 CO2 和 CH4 释放到大气 中 .由于人工湿地存在着这样一些氧化区、兼性区 和还原区, 通过不同区域微生物的相互配合作用而 去除有机物以及含氮化合物等 [ 2] . 在二级处理水中, 氮以氨态氮、亚硝酸氮和硝酸 氮等形式存在.自然界存在着氮循环的现象, 采取 适当的运行条件可将这一自然过程运用在去除生化 污泥处理系统中的氮.微生物脱氮主要表现为两个 过程, 硝化与反硝化[ 3] . 第 29 卷 增刊 2 2007 年 12 月 北 京 科 技 大 学 学 报 Journal of University of Science and Technology Beijing Vol.29 Suppl.2 Dec.2007 DOI :10.13374/j .issn1001 -053x.2007.s2.084

。54 北京科技大学学报 2007年增刊2 硝化过程主要由硝化菌来完成.亚硝酸菌和硝 在反应器内的停留时间(0)N必须大于自养型硝化 酸菌统称为硝化菌，硝化菌是化能自养菌，革兰氏染 菌最小的世代时间(0。)Nmim.一般对(0。)v的取值， 色阴性，不生芽孢的短杆状细菌，广泛存活于土壤 至少应为(0。)Nmim的2倍以上，即安全系数应大于 中，在自然界的氮循环中起着重要作用.这类细菌 2. 的生理活动不需要有机营养物质，由CO2获取碳 ⑤重金属及有害物质.除重金属外，对硝化反 源，从无机物的氧化中获取能量， 应产生抑制作用的物质还有高浓度的NH一N、高 在未经处理的新鲜废水中，含氮化合物存在的 浓度的NO:一N、有机底物以及络合阳离子等. 主要形式有：(a)有机氮，如蛋白质、氨基酸、尿素、胺 2.2影响反硝化反应的环境因素 类化合物、硝基化合物等：(b)氨态氮(NH3、NH). ①碳源.一般认为，当废水中BODs/T-N值 一般以前者为主. 3~5时，即认为碳源充足，无需外加碳源.当原废 含氮化合物在微生物的作用下，相继产生氨化 水中碳、氮比值过低，如BOD5/T一N值<3~5，则需 反应和硝化反应.通过氨化反应，有机氮化合物在 投加有机碳源，现多采用甲醇(CH3OH),因为它被 氨化菌的作用下，分解、转化为氨态氮.在硝化菌的 分解后的产物为C02和H20,不产生任何难于降解 作用下，氨态氮进一步分解氧化，分两个阶段进行， 的中间产物，而且反硝化速率高. 首先在亚硝化作用下，使氨(NH)转化为亚硝酸 ②pH值.pH值是反硝化反应的重要影响因 氮，然后，亚硝酸氮在硝酸菌的作用下，进一步转化 素，对反硝化菌最适宜的pH值是6.5~7.5，在这一 为硝酸氮.这个过程称为硝化反应. pH值条件下，反硝化速率最高，当pH值高于8或 反硝化反应是指硝化氮(NO3一N)和亚硝酸氮 低于6时，反硝化速率将大为下降. (NO2-N)在反硝化菌的作用下，被还原为气态氮 ③溶解氧.反硝化菌是异养兼性厌氧菌，只有 (N2)的过程. 在无分子氧而同时存在硝酸和亚硝酸离子的条件 反硝化菌属于异养型兼性厌氧型细菌.在厌氧 下，它们才能够利用这些离子中的氧进行呼吸，使硝 条件下，进行厌氧呼吸，易硝化氮(NO?-N)为电子 酸盐还原.反硝化菌以在厌氧、好氧交替的环境中 受体，以有机底物（有机碳）为电子供体.在这种条 生活为宜，溶解氧应控制在0.5mgL以下. 件下，不能释放出更多的ATP,合成的细胞物质也 ④温度.反硝化反应的适宜温度是20~40℃ 较少. 低于15○时，反硝化菌的增殖速率降低，代谢速率 在反硝化反应过程中，硝化氮通过反硝化菌的 也降低，从而降低了反硝化速率. 代谢活动，可能有两种转化途径，即：同化反硝化（合 3 成)，最终形成有机氮化合物，成为菌体的组成部分： 实验设计 另一为异化反硝化（分解），最终产物是气态氮. 3.1人工湿地系统耐冷菌的筛选培养 2微生物脱氨影响因素 采用传统的涂平板与液态培养基交替培养转换 2.1硝化反应正常进行的环境条件 法筛选耐冷菌。首先将处理后的菌种接种于液态培 应当注意，硝化菌对环境的变化很敏感，为了使 养基，然后涂平板，从中选出优势菌株进行脱氮比 硝化反应正常进行，就必须保持硝化菌所需要的环 较，从而确定最优菌株，再将该菌株接种于液态培养 境条件. 基中，依此循环，直至所选各株菌株颜色相同、硝化 ①溶解氧.氧是硝化反应过程中的电子受体， 能力相当，即得到纯菌种. 反应器内溶解氧高低，必将影响硝化反应的过程. 3.2耐冷菌的性质实验 实验结果证实，进行硝化反应的曝气池内溶解氧浓 将己接种菌体的试管置于摇床上，在不同温度 度应≥1mg/L. (5、15、20.25、30、35、40℃培养，转速200r/min条 ②温度.硝化反应的适宜温度是20~30℃， 件下，分别培养0、24、48、72、96、120、144、168h,然 15℃以下，硝化速度下降，50时完全停止. 后放于冰箱中贮存.将得到的所有样品一同比浊测 ③pH值.硝化菌对pH值的变化非常敏感，最 定浊度值（在680nm下测其吸光值）.根据公式 佳pH值是80~8.4.在最佳pH值条件下，硝化速 (1)、(2)、(3)计算各菌株在不同温度下的比生长速 度、硝化菌的比增殖速率均可达最大值. 率和时代时间. ④生物固体平均停留时间（污泥龄）.为了使 k=2.303gx2-gx业 硝化菌群能够在连续流反应器系统中存活，微生物 (1) t2一t1

硝化过程主要由硝化菌来完成 .亚硝酸菌和硝 酸菌统称为硝化菌, 硝化菌是化能自养菌, 革兰氏染 色阴性, 不生芽孢的短杆状细菌, 广泛存活于土壤 中, 在自然界的氮循环中起着重要作用.这类细菌 的生理活动不需要有机营养物质, 由 CO2 获取碳 源, 从无机物的氧化中获取能量. 在未经处理的新鲜废水中, 含氮化合物存在的 主要形式有:( a) 有机氮, 如蛋白质 、氨基酸 、尿素、胺 类化合物、硝基化合物等;( b) 氨态氮( NH3 、NH + 4 ) . 一般以前者为主 . 含氮化合物在微生物的作用下, 相继产生氨化 反应和硝化反应.通过氨化反应, 有机氮化合物在 氨化菌的作用下, 分解、转化为氨态氮 .在硝化菌的 作用下, 氨态氮进一步分解氧化, 分两个阶段进行, 首先在亚硝化作用下, 使氨( NH + 4 ) 转化为亚硝酸 氮, 然后, 亚硝酸氮在硝酸菌的作用下, 进一步转化 为硝酸氮 .这个过程称为硝化反应. 反硝化反应是指硝化氮( NO - 3 -N) 和亚硝酸氮 ( NO - 2 -N) 在反硝化菌的作用下, 被还原为气态氮 ( N2) 的过程. 反硝化菌属于异养型兼性厌氧型细菌 .在厌氧 条件下, 进行厌氧呼吸, 易硝化氮( NO - 3 -N) 为电子 受体, 以有机底物( 有机碳) 为电子供体.在这种条 件下, 不能释放出更多的 ATP, 合成的细胞物质也 较少 . 在反硝化反应过程中, 硝化氮通过反硝化菌的 代谢活动, 可能有两种转化途径, 即 :同化反硝化( 合 成) , 最终形成有机氮化合物, 成为菌体的组成部分 ; 另一为异化反硝化( 分解) , 最终产物是气态氮 . 2 微生物脱氮影响因素 2.1 硝化反应正常进行的环境条件 应当注意, 硝化菌对环境的变化很敏感, 为了使 硝化反应正常进行, 就必须保持硝化菌所需要的环 境条件. ①溶解氧 .氧是硝化反应过程中的电子受体, 反应器内溶解氧高低, 必将影响硝化反应的过程 . 实验结果证实, 进行硝化反应的曝气池内溶解氧浓 度应 ≥1 mg/L . ②温度 .硝化反应的适宜温度是 20 ～ 30 ℃, 15 ℃以下, 硝化速度下降, 5 ℃时完全停止. ③pH 值 .硝化菌对 pH 值的变化非常敏感, 最 佳 pH 值是 8.0 ～ 8.4 .在最佳 pH 值条件下, 硝化速 度、硝化菌的比增殖速率均可达最大值 . ④生物固体平均停留时间( 污泥龄) .为了使 硝化菌群能够在连续流反应器系统中存活, 微生物 在反应器内的停留时间( θc ) N 必须大于自养型硝化 菌最小的世代时间( θc) N min .一般对( θc) N 的取值, 至少应为( θc) N min的 2 倍以上, 即安全系数应大于 2 . ⑤重金属及有害物质 .除重金属外, 对硝化反 应产生抑制作用的物质还有高浓度的 NH + 4 -N 、高 浓度的 NO - x -N 、有机底物以及络合阳离子等 . 2.2 影响反硝化反应的环境因素 ①碳源.一般认为, 当废水中 BOD5/T-N 值> 3 ～ 5 时, 即认为碳源充足, 无需外加碳源 .当原废 水中碳 、氮比值过低, 如 BOD5/T-N 值 <3 ～ 5, 则需 投加有机碳源, 现多采用甲醇( CH3OH) , 因为它被 分解后的产物为 CO2 和H2O, 不产生任何难于降解 的中间产物, 而且反硝化速率高 . ②pH 值 .pH 值是反硝化反应的重要影响因 素, 对反硝化菌最适宜的 pH 值是 6.5 ～ 7.5, 在这一 pH 值条件下, 反硝化速率最高, 当 pH 值高于 8 或 低于 6 时, 反硝化速率将大为下降. ③溶解氧.反硝化菌是异养兼性厌氧菌, 只有 在无分子氧而同时存在硝酸和亚硝酸离子的条件 下, 它们才能够利用这些离子中的氧进行呼吸, 使硝 酸盐还原 .反硝化菌以在厌氧 、好氧交替的环境中 生活为宜, 溶解氧应控制在 0.5 mg/ L 以下. ④温度.反硝化反应的适宜温度是 20 ～ 40 ℃, 低于 15 ℃时, 反硝化菌的增殖速率降低, 代谢速率 也降低, 从而降低了反硝化速率 . 3 实验设计 3.1 人工湿地系统耐冷菌的筛选培养 采用传统的涂平板与液态培养基交替培养转换 法筛选耐冷菌.首先将处理后的菌种接种于液态培 养基, 然后涂平板, 从中选出优势菌株进行脱氮比 较, 从而确定最优菌株, 再将该菌株接种于液态培养 基中, 依此循环, 直至所选各株菌株颜色相同 、硝化 能力相当, 即得到纯菌种. 3.2 耐冷菌的性质实验 将已接种菌体的试管置于摇床上, 在不同温度 ( 5 、15 、20 、25 、30 、35 、40 ℃) 培养, 转速 200 r/min 条 件下, 分别培养 0 、24 、48 、72 、96 、120 、144 、168 h, 然 后放于冰箱中贮存 .将得到的所有样品一同比浊测 定浊度值( 在 680 nm 下测其吸光值) .根据公式 ( 1) 、( 2) 、( 3) 计算各菌株在不同温度下的比生长速 率和时代时间[ 4] . ki = 2.303( lg x 2 -lg x 1) t 2 -t 1 ( 1) · 54 · 北 京 科 技 大 学 学 报 2007 年 增刊 2

Vol.29 SuppL 2 邢奕等：应用耐冷菌株改善寒冷地区冬季人工湿地系统生物脱氨效果 55 K=1十k2十k3十十a 温度在15℃左右.当环境温度低于最适生长温度 (2) n 时，耐冷菌的比生长速率降低.当环境温度降至5℃ 8=0.678/k (3) 时，NL01、NL02、NL03的比生长速率分别为 式中，k:为比生长速率，h；x1为时间1对应的 0.059、0.046、0.051h1;世代时间分别为11.54、 0D8值；x2为时间t2对应的0D8o值；t1、t2为培 14.83、13.22h,三种耐冷菌在5℃仍具有相对较高 养时间，h;k为平均比生长速率，h'；n=8;g为 的比生长速率以及相对较短的世代时间，说明在低 世代时间，h. 温条件下，此三种耐冷菌的活性比较高，代谢相对活 通过电镜实验观察耐冷菌的形态，并对各耐冷 跃.当温度高于20℃时，比增长速率迅速降低，世 菌的生理生化特性进行鉴定. 代时间也随之增长.在40C时，NL01、NL02、NL03 3.3耐冷菌的硝化影响指标实验 及NL04(复合菌株)则停止生长.NL04的世代时间 pH值、温度是影响微生物硝化反应的重要指 基本比单独三种任何菌株要短，这是因为，复合菌株 标.pH值的影响可以通过Q.1M的H2SO4/NaOH 具有协同效应，可以在恶劣环境中互相促进，从而激 分别调节培养基的pH值为5、6、7、8、9、10，保持其 发了其活性. 他条件不变连续监测10d,在680nm处分别测得最 大浊度值并测定培养液的氨氮的降解率，以确定三 50 100 株耐冷菌株生长的最佳pH值.温度的影响可利用 量一氨氮浓度（空白） 40 ◆一氨氮浓度NL01) 生物荧光层析光谱仪，通过测定菌株在不同温度下 ★一 氨氯浓度NL02) 60 氨氮浓度QNL03) (一2、5、15、25、35℃的荧光强度来反应耐冷菌的 …量…去除率（空白） 40 …◆·去除率NL01) 生物活性强度. ▲·去除率CNL02) ·=·去除率NL03) 3.4耐冷菌的工程性实验研究 在石家庄机械化步兵学院生态园建设6个 0 1234567 0.5m×05m的湿地生态床，命名为A、B、C、D、E、 时间d F.A、B种植芦苇，C、D种植香蒲，E、F种植睡莲. 图1第四轮菌液去除氨氨效果对比 分别把不同菌株投加到湿地A、C、E中，设定停留时 间为10d,其他湿地作为空白，追踪测定氨氮变化情 0.20 况. ■一NL01 0.15 ◆一NL02 4结果与讨论 ▲一NL03 一NL04 41人工湿地系统耐冷菌的筛选培养 0.10 经四轮培养、分离、纯化，得到了三种优势菌株 0.05 I-X5、IF1、I-M3.分别命名为NL01、NL02、 NL03.与其他菌株相比，它们更加适应低温环境， 40 生物量明显提高，NL01在第4天进入稳定期，NL03 1520253035 温度/℃ 在第5天进入稳定期，而NL02则需要6天.其中， NLO2去除氨氮效果最明显，氨氮去除率比对照床 图2不同菌种不同温度下的比增长速率 提高了52.46%，NL01、NL03分别提高了4618% 扫描电镜结果显示，NLO1主要是球状菌，包含 和50.85%：随着纯化阶段的深入，三种耐冷菌株氨 部分短杆菌；NL02是丝状菌，菌株个体相对较大， 氮去除率稳步提高，分别由第一轮的62.06%、 相互依附：NL03是杆状菌：NL04为混合菌.包含球 6284%及63.91%提高到第四轮的68.32%、 状菌和杆状菌.NL02菌体可以分泌大量的黏液，致 7460%及72.99%.第一轮培养时，菌液由混杂菌 使其菌体周围有许多突出的触角与基质相连，黏液 构成，包含了大量的中温菌或常温菌，在低温条件 会增强细菌菌体自身的免疫性能，保护其免受环境 下，这些菌株活性降低，直接影响了脱氮效果，氨氮 因素突变和带来的损伤，这些黏液是膜流动和相结 去除率的提高说明菌液逐步得到了纯化.图1对第 构的外观反映，它保证了膜中镶嵌的蛋白质发挥正 四轮菌液去除氨氮效果进行了对比 常的功能，如离子和营养的吸收、电子转移等习，因 42耐冷菌的性质实验 由图2和图3可知，这三种耐冷菌的最适生长 此NL02菌体的黏液分布有很重要的意义，可以很

k = k 1 +k 2 +k 3 +…+kn n ( 2) g =0.678/ k ( 3) 式中, k i 为比生长速率, h -1 ;x 1 为时间 t 1 对应的 OD680值 ;x 2 为时间 t 2 对应的 OD680值;t 1 、t 2 为培 养时间, h ;k 为平均比生长速率, h -1 ;n =8 ;g 为 世代时间, h . 通过电镜实验观察耐冷菌的形态, 并对各耐冷 菌的生理生化特性进行鉴定. 3.3 耐冷菌的硝化影响指标实验 pH 值、温度是影响微生物硝化反应的重要指 标.pH 值的影响可以通过 0.1 M 的 H2SO4/NaOH 分别调节培养基的 pH 值为 5 、6 、7 、8 、9 、10, 保持其 他条件不变连续监测 10 d, 在 680 nm 处分别测得最 大浊度值并测定培养液的氨氮的降解率, 以确定三 株耐冷菌株生长的最佳 pH 值 .温度的影响可利用 生物荧光层析光谱仪, 通过测定菌株在不同温度下 ( -2 、5 、15 、25 、35 ℃) 的荧光强度来反应耐冷菌的 生物活性强度. 3.4 耐冷菌的工程性实验研究 在石家庄机械化步兵学院生态园建设 6 个 0.5 m ×0.5 m 的湿地生态床, 命名为 A 、B 、C 、D 、E 、 F .A 、B 种植芦苇, C 、D 种植香蒲, E 、F 种植睡莲 . 分别把不同菌株投加到湿地 A 、C 、E 中, 设定停留时 间为 10 d, 其他湿地作为空白, 追踪测定氨氮变化情 况. 4 结果与讨论 4.1 人工湿地系统耐冷菌的筛选培养 经四轮培养 、分离 、纯化, 得到了三种优势菌株 Ⅳ-X5 、Ⅳ-F1 、Ⅳ-M 3, 分别命名为 N L01 、NL02 、 N L03 .与其他菌株相比, 它们更加适应低温环境, 生物量明显提高, NL01 在第 4 天进入稳定期, N L03 在第 5 天进入稳定期, 而 NL02 则需要 6 天 .其中, N L02 去除氨氮效果最明显, 氨氮去除率比对照床 提高了 52.46 %, N L01 、NL03 分别提高了 46.18 % 和 50.85 %;随着纯化阶段的深入, 三种耐冷菌株氨 氮去除率稳步提高, 分别由第一轮的 62.06 %、 62.84 %及 63.91 %提高 到 第 四 轮 的 68.32 %、 74.60 %及 72.99 %.第一轮培养时, 菌液由混杂菌 构成, 包含了大量的中温菌或常温菌, 在低温条件 下, 这些菌株活性降低, 直接影响了脱氮效果, 氨氮 去除率的提高说明菌液逐步得到了纯化.图 1 对第 四轮菌液去除氨氮效果进行了对比 . 4.2 耐冷菌的性质实验 由图 2 和图 3 可知, 这三种耐冷菌的最适生长 温度在 15 ℃左右 .当环境温度低于最适生长温度 时, 耐冷菌的比生长速率降低.当环境温度降至5 ℃ 时, N L01 、 NL02 、N L03 的 比 生 长 速 率 分 别 为 0.059 、0.046 、0.051 h -1 ;世代时间分别为 11.54 、 14.83 、13.22 h, 三种耐冷菌在 5 ℃仍具有相对较高 的比生长速率以及相对较短的世代时间, 说明在低 温条件下, 此三种耐冷菌的活性比较高, 代谢相对活 跃 .当温度高于 20 ℃时, 比增长速率迅速降低, 世 代时间也随之增长 .在 40 ℃时, NL01 、N L02 、NL03 及 NL04( 复合菌株) 则停止生长.NL04 的世代时间 基本比单独三种任何菌株要短, 这是因为, 复合菌株 具有协同效应, 可以在恶劣环境中互相促进, 从而激 发了其活性 . 图 1 第四轮菌液去除氨氮效果对比 图 2 不同菌种不同温度下的比增长速率 扫描电镜结果显示, NL01 主要是球状菌, 包含 部分短杆菌 ;NL02 是丝状菌, 菌株个体相对较大, 相互依附 ;NL03 是杆状菌 ;N L04 为混合菌, 包含球 状菌和杆状菌.NL02 菌体可以分泌大量的黏液, 致 使其菌体周围有许多突出的触角与基质相连, 黏液 会增强细菌菌体自身的免疫性能, 保护其免受环境 因素突变和带来的损伤, 这些黏液是膜流动和相结 构的外观反映, 它保证了膜中镶嵌的蛋白质发挥正 常的功能, 如离子和营养的吸收 、电子转移等[ 5] , 因 此 NL02 菌体的黏液分布有很重要的意义, 可以很 Vol.29 Suppl.2 邢奕等:应用耐冷菌株改善寒冷地区冬季人工湿地系统生物脱氮效果 · 55 ·

。56 北京科技大学学报 2007年增刊2 20 蒲床为例，研究菌液投加量对去除氨氮的影响，如图 NL01 6~9所示.随着投加量的增加，氨氮去除率也随之 16 -NL02 -NL03 变大.当投加量由1.25%增至5.00%，氨氮去除效 NL04 12 果增幅明显，但是从5.00%至1000%时，氨氮处理 效果并无明显区别.当菌液投加量为10.00%时，虽 然氨氮去除效果最好，但投入过大，从运行成本方面 考虑宜选用5.00%为最佳菌液投加量 当实验菌液投加量为5.0%，温度为6℃的条件 20 25 30 35 下，NL01、NL02、NL03三种耐冷菌对氨氮的去除率 温度/℃ 分别为57.7%、59.0%和58.7%：相同条件下， 图3不同菌种不同温度下的世代时间 NL04可使氨氮的去除率提高到67.2%. 12000 好地帮助其适应不同的环境，在不同的环境下都有 10000 …NL01 较强的代谢功能：NL03有部分菌体有一个囊状物 800/ ---NL02 6000 -NL03 将其包围，这种囊状物同样也可以提高菌体对环境 4000 的适应能力：NL04有少量细胞处于分裂状态，说明 2000 NL04的代谢能力较强. 0 43耐冷菌的硝化影响指标实验 2000 111621263】 36 由图4可知，pH值为7~8时，各菌株生长得最 温度/℃ 好.NL02表现为嗜弱酸性，NL01和NL03则嗜弱 图5不同菌种不同温度下的荧光强度 碱性，菌株在pH值在7左右时，氨氮降解率高达 70%左右，当pH值低于5和高于9时，活性明显降 35 低，氨氮去除率也随之骤降，从而得出，菌株在偏酸 30 和偏碱性环境中仍保持了一定的代谢能力，但活性 25 较中性明显降低 20 100 15 ◆—1.25% 80 10 ■一2.50% ★一5.00% 60 5 兴一10.00% 40 ◆一NL01 345678910 ■一NL02 时间/d h一NL03 67891011 图6氨氢随不同ND1投加量变化曲线 pH 35 图4不同菌种的氨氨降解率受pH值影响的规律 30 233 图5给出了不同菌种在不同温度下的荧光强 20 度.在周围环境温度低于0℃C时，NL03活性最差， 15 1.25% ■-2.50% 三种耐冷菌株都保持一定活性：当温度到16℃时 5.00% 米一10.00% 活性达到最高值；在10℃与20℃之间，NL03活性 0 3 超过了NL02,其他温度范围NL02基本保持活性最 45678910 时间/d 强，而NL01最弱；当温度高于35℃时，三种耐冷菌 株基本失去了活性，不能维持正常的新陈代谢 图7氨氨随不同N02投加量变化曲线 44耐冷菌的工程性实验研究 向芦苇床、香蒲床和睡莲床中分别投加不同菌 结论 液，停留时间为I0d,连续监测氨氮处理效果.从实 验数据可知，香蒲床处理效果相对较好，我们特以香 (1)确定了三种合理的培养基，并且逐步纯化

图 3 不同菌种不同温度下的世代时间 好地帮助其适应不同的环境, 在不同的环境下都有 较强的代谢功能 ;NL03 有部分菌体有一个囊状物 将其包围, 这种囊状物同样也可以提高菌体对环境 的适应能力;NL04 有少量细胞处于分裂状态, 说明 NL04 的代谢能力较强 . 4.3 耐冷菌的硝化影响指标实验 由图 4 可知, pH 值为 7 ～ 8 时, 各菌株生长得最 好.NL02 表现为嗜弱酸性, NL01 和 NL03 则嗜弱 碱性, 菌株在 pH 值在 7 左右时, 氨氮降解率高达 70 %左右, 当 pH 值低于 5 和高于 9 时, 活性明显降 低, 氨氮去除率也随之骤降, 从而得出, 菌株在偏酸 和偏碱性环境中仍保持了一定的代谢能力, 但活性 较中性明显降低 . 图 4 不同菌种的氨氮降解率受 pH值影响的规律 图 5 给出了不同菌种在不同温度下的荧光强 度.在周围环境温度低于 0 ℃时, N L03 活性最差, 三种耐冷菌株都保持一定活性;当温度到 16 ℃时, 活性达到最高值 ;在 10 ℃与 20 ℃之间, NL03 活性 超过了 NL02, 其他温度范围 N L02 基本保持活性最 强, 而 N L01 最弱 ;当温度高于 35 ℃时, 三种耐冷菌 株基本失去了活性, 不能维持正常的新陈代谢 . 4.4 耐冷菌的工程性实验研究 向芦苇床、香蒲床和睡莲床中分别投加不同菌 液, 停留时间为 10 d, 连续监测氨氮处理效果 .从实 验数据可知, 香蒲床处理效果相对较好, 我们特以香 蒲床为例, 研究菌液投加量对去除氨氮的影响, 如图 6 ～ 9 所示.随着投加量的增加, 氨氮去除率也随之 变大 .当投加量由 1.25 %增至 5.00 %, 氨氮去除效 果增幅明显, 但是从 5.00 %至 10.00 %时, 氨氮处理 效果并无明显区别.当菌液投加量为 10.00 %时, 虽 然氨氮去除效果最好, 但投入过大, 从运行成本方面 考虑宜选用 5.00 %为最佳菌液投加量. 当实验菌液投加量为5.0 %, 温度为6 ℃的条件 下, NL01 、NL02 、NL03 三种耐冷菌对氨氮的去除率 分别为 57.7 %、59.0 %和 58.7 %;相同条 件下, NL04 可使氨氮的去除率提高到 67.2 %. 图 5 不同菌种不同温度下的荧光强度 图6 氨氮随不同 NL01 投加量变化曲线 图7 氨氮随不同 NL02 投加量变化曲线 5 结论 ( 1) 确定了三种合理的培养基, 并且逐步纯化 · 56 · 北 京 科 技 大 学 学 报 2007 年 增刊 2

Vol.29 Suppl 2 邢奕等：应用耐冷菌株改善寒冷地区冬季人工湿地系统生物脱氨效果 57。 35 定期.而NL02则需要6天. 301 (2)在pH值为7一8时，各菌株生长得最好 25 放线菌表现为嗜弱酸性，细菌和霉菌则嗜弱碱性. 20 生物荧光层析光谱实验发现三种菌株都在15℃左 1,25% 右活性最大，0℃以下仍有一定的活性，高于35℃ ·2.50% 时，基本失去正常的代谢能力 -5.00% -10.00% (3)当实验菌液投加量为5.0%，温度为6℃ 00 时，三种耐冷菌对氨氮的去除率分别为57.7%、 2345678910 时间d 59.0%及58.7%.相同条件下，投加混合菌种可使 氨氯的去除率提高到67.2%. 图8氨氨随不同N03投加量变化曲线 随着耐冷机制的进一步研究以及耐冷菌在人工 湿地系统中投加实验的深入，必将推动解决冬季低 温条件下人工湿地脱氮效果差等问题的进程，进而 为人工湿地工艺在我国北方地区的推广扫清障碍. 25 参考文献 15 -1.25% 【刂王孝纲.日本下水污泥的资源化现状与发展方向衣业环境 10 -2.50% 一5.00% 与发展，1998,15(2)：42 5 ←一10.00% 【习成水平，吴振斌，况琪军.人工湿地植物研究湖泊科学， 2002,142):179 0 4567 89 时间d [3 Meutia A A.Treatment of laboratory wastew aterin aconstructed wetland comparing surface and subsurface flow.Water Sci Tech- 图9氨氨随不同NL04投加量变化曲线 ndl,2001,4411-12):499 【4张希衡。废水厌氧生物处理工程.北京：中国环境科学出版 培养出三种菌株，生物荧光层析光谱实验，证实所培 社.1996 养的三种菌株属于耐冷菌属，环境温度为6℃时， [习韩晓云，姜安玺，何丽蓉.低温菌及其在环境工程中的应用 NL01在第4天进入稳定期，NL03在第5天进入稳 东北林业大学学报2003.31(2)：33 Application of psychrotrophses in improving bio-treatment efficiency of nitrogen in constructed wetland in cold area during winter XING Yi,QIAN Dayi,YING Gaoxiang 1)Civil Environment Engineering School.University of Science and Techmology Beijing Beijing 100083,Chima 2)Environmental Engineering Sciences,University of Florida,Gainesville,FL32611.USA ABSTRACT Based on probing experiments,three psy chrotrophses culture mediums were discovered and uti- lized to culture bacilli,actinomyces,and mildew,respectively.Cultured pschrotrophses were separated and pu- rified at 6 C.The physio-characteristics of psychrotrophses were identified and their nitration abilities were in- spected by considering effects of pH and temperature.A best grow th of psychrotrophses was detected when the pH value was in the range of 7 to 8.Biology fluorescence chromatography spectrum test indicates that all psy- chrotrophses present the maximal activity at 15C,still have definite activity at 0C and lose natural metaboliz- ing ability at above 35 C.Under the conditions of 6Cand psychrotrophses dosage of 5.0%,the ammonia-ni- trogen removal efficiencies of the three psychrotrophses are 57.7%,59.0%,and 58.7%respectively.If a mix- ture of psychrotrophses is applied under the same condition,the ammonia-nitrogen removal efficiency increases to67.2%. KEY WORDS sew age reuse;constructed wetland;low temperature;nitrogen removal;psychrotrophses

图 8 氨氮随不同 NL03 投加量变化曲线 图 9 氨氮随不同 NL04 投加量变化曲线 培养出三种菌株, 生物荧光层析光谱实验, 证实所培 养的三种菌株属于耐冷菌属, 环境温度为 6 ℃时, N L01 在第 4 天进入稳定期, NL03 在第 5 天进入稳 定期, 而 N L02 则需要 6 天. ( 2) 在 pH 值为 7 ～ 8 时, 各菌株生长得最好. 放线菌表现为嗜弱酸性, 细菌和霉菌则嗜弱碱性. 生物荧光层析光谱实验发现三种菌株都在 15 ℃左 右活性最大, 0 ℃以下仍有一定的活性, 高于 35 ℃ 时, 基本失去正常的代谢能力. ( 3) 当实验菌液投加量为 5.0 %, 温度为 6 ℃ 时,三种耐冷菌对氨氮的去除率分别为 57.7 %、 59.0 %及 58.7 %.相同条件下, 投加混合菌种可使 氨氮的去除率提高到 67.2 %. 随着耐冷机制的进一步研究以及耐冷菌在人工 湿地系统中投加实验的深入, 必将推动解决冬季低 温条件下人工湿地脱氮效果差等问题的进程, 进而 为人工湿地工艺在我国北方地区的推广扫清障碍. 参 考 文 献 [ 1] 王孝纲.日本下水污泥的资源化现状与发展方向.农业环境 与发展, 1998, 15(2) :42 [ 2] 成水平, 吴振斌, 况琪军.人工湿地植物研究.湖泊科学, 2002, 14( 2) :179 [ 3] Meutia A A .T reatment of laborat ory w astew ater in a constructed wetland comparing surf ace and subsurf ace flow .Water Sci Tech￾nol, 2001, 44( 11 ～ 12) :499 [ 4] 张希衡.废水厌氧生物处理工程.北京:中国环境科学出版 社, 1996 [ 5] 韩晓云, 姜安玺, 何丽蓉.低温菌及其在环境工程中的应用. 东北林业大学学报, 2003, 31( 2) :33 Application of psychrotrophses in improving bio-treatment efficiency of nitrogen in constructed wetland in cold area during winter X ING Yi 1) , QIAN Dayi 1) , YING Gaox iang 2) 1) Civil &Environment Engineering S chool, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, C hina 2) Environmental Engineering S ciences, University of Florida, Gainesville, FL 32611, USA ABSTRACT Based on probing experiments, three psy chro trophses culture mediums were discovered and uti￾lized to culture bacilli, actinomyces, and mildew , respectively .Cultured pschro trophses were separated and pu￾rified at 6 ℃.The physio-characteristics of psychrotrophses w ere identified and their nitration abilities were in￾spected by considering effects of pH and temperature.A best g row th of psychro trophses w as detected when the pH value w as in the range of 7 to 8 .Biology fluorescence chromatog raphy spectrum test indicates that all psy￾chrotrophses present the maximal activity at 15 ℃, still have definite activity at 0 ℃, and lose natural metaboliz￾ing ability at above 35 ℃.Under the conditions of 6 ℃and psychro trophses dosage of 5.0 %, the ammonia-ni￾trogen removal efficiencies of the three psychrotrophses are 57.7 %, 59.0 %, and 58.7 %respectively .If a mix￾ture of psychro trophses is applied under the same condition, the ammonia-nitrogen removal efficiency increases to 67.2 %. KEY WORDS sew age reuse;constructed w etland ;low temperature ;nitrogen removal ;psychro trophses Vol.29 Suppl.2 邢奕等:应用耐冷菌株改善寒冷地区冬季人工湿地系统生物脱氮效果 · 57 ·