·534· 北京科技大学学报 第33卷 化亚铁的能力来表示：用扫描电镜观察浸渣表面形 100 貌以及诱变前后细菌形态的变化. ◆一0.0% 80 量—0.5% 2结果和讨论 ★一1.0% -4-2.0% 2.1盐酸羟胺对T.f,菌的诱变效果 柔 40 米一3.0% 盐酸羟胺(NH,OH·HCI)是具有特异诱变效应 20 的诱变剂，在质量分数为0.1%~5%时可对细菌产 三米米米 0 生诱变效应网.诱变剂量直接影响菌种的致死率. 020406080100120140160 时间h 诱变剂量大，致死率高(90%~99%)，在单位存活 图2不同盐酸羟胺质量分数下菌种的F2·氧化率 细胞中负突变菌株多，正突变菌株少，但在不多的正 Fig.2 Fe2oxidation rate at different mass fractions of hydroxyla- 突变株中可能筛选到产量提高幅度大的变株：小剂 mine hydrochloride 量进行处理，致死率为50%~80%，在单位存活细 基发生反应，使胞嘧啶结构发生变化，而羟化后的胞 胞中正突变株多，然而大幅度提高产量的菌株可能 嘧啶与腺嘌呤配对，引起了DNA结构变化、遗传物 较少 质变异.当盐酸羟胺浓度较高时，菌种DNA结构中 本实验以盐酸羟胺用量作为诱变剂量，以致死 胞嘧啶被羟化的数量增多，羟化作用增强，从而使遗 率和正突变率作为评价指标.将除杂纯化后的菌种 传变异幅度过大，导致菌种致死率较高 加入新鲜的含不同量盐酸羟胺的改进型4.5K培养 图2为不同诱变剂量对诱变菌氧化活性的影响 基中，4d后开始计数，反复重新接种培养三次后，测 程度.菌种氧化活性的改善关键在于提高亚铁氧化 不同诱变菌和原始菌（初始接种数量均为1.0× 酶的活性回，盐酸羟胺诱变菌种酶活性提高的机理 10个·mL-)在同样培养条件下的Fe2+氧化率.菌 为：改变了酶一级结构从而导致空间结构的变化，进 种诱变时盐酸羟胺用量和细菌致死率的关系如图1 而导致酶活性的提高.结果表明：当盐酸羟胺质量 所示，不同剂量对菌种的诱变效果见图2. 分数为0.5%、1%和2%时，诱变菌的氧化活性比原 100 始菌的有所提高，培养160h时Fe2+的氧化率分别 形 比原始菌Fe2+氧化率提高了约5%、15%和16%；当 60 盐酸羟胺质量分数为3.0%时，活性很弱.因此可以 40 推断：盐酸羟胺质量分数为3.0%时菌种亚铁氧化 20 酶结构变化幅度太大，导致致死率太高，单位存活细 0◆ 胞中负突变菌株过多，使其亚铁氧化活性大大降低： 0 0.51.01.52.02.53.0 盐酸羟胺质量分数/% 而盐酸羟胺质量分数为0.5%、1%和2%时对菌种 图1盐酸羟胺质量分数对菌致死率的影响 的诱变效果较好，它可以提高亚铁氧化酶活性，因此 Fig.I Effect of the mass fraction of hydroxylamine hydrochloride on 相对于原始菌具有更高亚铁氧化率. the lethality rate of bacteria 2.2诱变菌种的培养 由图1可以看出，随着盐酸羟胺质量分数的增 菌种诱变处理必然破坏了原有DNA结构的稳 加，菌种的致死率逐渐增大.当盐酸羟胺质量分数 定性，使突变位点可能处于亚稳定状态，增大了回复 为0.5%时，菌种死亡率为42%左右，说明在低剂量 突变或抑制基因突变的概率.为保证突变体的稳定 时对菌种已有较高的致死率：当盐酸羟胺浓度达到 性，在育种过程中做一段长期的培养和观测，反复传 3.0%时，菌种几乎100%死亡.盐酸羟胺对菌种的 代观测其性状稳定性.不同诱变菌接种传代培养四 诱变机理为羟胺专一地与胞嘧啶(C)发生反应，引 次后，选择其中具有较高氧化活性和生长繁殖能力 起G:C→A:T转换.同时，盐酸羟胺还能和细胞中 的菌种与原始菌，初始接种数量均为1.0×10°个· 的其他物质作用产生过氧化氢，也具有诱变作用. mL,在相同条件下进行培养，定时测定培养体系 在DNA的双螺旋结构中，胞嘧啶与鸟嘌呤配对，分 的pH值、氧化还原电位(E)、Fe2+氧化率以及菌种 子间形成三个氢键，这种碱基互补之间的氢键对 的生长曲线 DNA双螺旋结构的稳定性起着重要作用，在盐酸羟 在菌种培养过程中，pH值是非常重要的参数， 胺对菌种的化学诱变处理中，羟胺和胞嘧啶上的碱 pH值的变化会影响浸矿菌种的生长繁殖和亚铁的北 京 科 技 大 学 学 报 第 33 卷 化亚铁的能力来表示; 用扫描电镜观察浸渣表面形 貌以及诱变前后细菌形态的变化． 2 结果和讨论 2. 1 盐酸羟胺对 T． f6菌的诱变效果 盐酸羟胺( NH2OH·HCl) 是具有特异诱变效应 的诱变剂，在质量分数为 0. 1% ～ 5% 时可对细菌产 生诱变效应［8］． 诱变剂量直接影响菌种的致死率． 诱变剂量大，致死率高( 90% ～ 99% ) ，在单位存活 细胞中负突变菌株多，正突变菌株少，但在不多的正 突变株中可能筛选到产量提高幅度大的变株; 小剂 量进行处理，致死率为 50% ～ 80% ，在单位存活细 胞中正突变株多，然而大幅度提高产量的菌株可能 较少． 本实验以盐酸羟胺用量作为诱变剂量，以致死 率和正突变率作为评价指标． 将除杂纯化后的菌种 加入新鲜的含不同量盐酸羟胺的改进型 4. 5 K 培养 基中，4 d 后开始计数，反复重新接种培养三次后，测 不同诱 变 菌 和 原 始 菌 ( 初始接种数量均为1. 0 × 106 个·mL － 1 ) 在同样培养条件下的 Fe 2 + 氧化率． 菌 种诱变时盐酸羟胺用量和细菌致死率的关系如图 1 所示，不同剂量对菌种的诱变效果见图 2． 图 1 盐酸羟胺质量分数对菌致死率的影响 Fig． 1 Effect of the mass fraction of hydroxylamine hydrochloride on the lethality rate of bacteria 由图 1 可以看出，随着盐酸羟胺质量分数的增 加，菌种的致死率逐渐增大． 当盐酸羟胺质量分数 为 0. 5% 时，菌种死亡率为 42% 左右，说明在低剂量 时对菌种已有较高的致死率; 当盐酸羟胺浓度达到 3. 0% 时，菌种几乎 100% 死亡． 盐酸羟胺对菌种的 诱变机理为羟胺专一地与胞嘧啶( C) 发生反应，引 起 G∶ C→A∶ T 转换． 同时，盐酸羟胺还能和细胞中 的其他物质作用产生过氧化氢，也具有诱变作用． 在 DNA 的双螺旋结构中，胞嘧啶与鸟嘌呤配对，分 子间形成三个氢键，这种碱基互补之间的氢键对 DNA 双螺旋结构的稳定性起着重要作用，在盐酸羟 胺对菌种的化学诱变处理中，羟胺和胞嘧啶上的碱 图 2 不同盐酸羟胺质量分数下菌种的 Fe2 + 氧化率 Fig． 2 Fe2 + oxidation rate at different mass fractions of hydroxyla￾mine hydrochloride 基发生反应，使胞嘧啶结构发生变化，而羟化后的胞 嘧啶与腺嘌呤配对，引起了 DNA 结构变化、遗传物 质变异． 当盐酸羟胺浓度较高时，菌种 DNA 结构中 胞嘧啶被羟化的数量增多，羟化作用增强，从而使遗 传变异幅度过大，导致菌种致死率较高． 图 2 为不同诱变剂量对诱变菌氧化活性的影响 程度． 菌种氧化活性的改善关键在于提高亚铁氧化 酶的活性［9］，盐酸羟胺诱变菌种酶活性提高的机理 为: 改变了酶一级结构从而导致空间结构的变化，进 而导致酶活性的提高． 结果表明: 当盐酸羟胺质量 分数为 0. 5% 、1% 和 2% 时，诱变菌的氧化活性比原 始菌的有所提高，培养 160 h 时 Fe 2 + 的氧化率分别 比原始菌 Fe 2 + 氧化率提高了约5% 、15% 和16% ; 当 盐酸羟胺质量分数为 3. 0% 时，活性很弱． 因此可以 推断: 盐酸羟胺质量分数为 3. 0% 时菌种亚铁氧化 酶结构变化幅度太大，导致致死率太高，单位存活细 胞中负突变菌株过多，使其亚铁氧化活性大大降低; 而盐酸羟胺质量分数为 0. 5% 、1% 和 2% 时对菌种 的诱变效果较好，它可以提高亚铁氧化酶活性，因此 相对于原始菌具有更高亚铁氧化率． 2. 2 诱变菌种的培养 菌种诱变处理必然破坏了原有 DNA 结构的稳 定性，使突变位点可能处于亚稳定状态，增大了回复 突变或抑制基因突变的概率． 为保证突变体的稳定 性，在育种过程中做一段长期的培养和观测，反复传 代观测其性状稳定性． 不同诱变菌接种传代培养四 次后，选择其中具有较高氧化活性和生长繁殖能力 的菌种与原始菌，初始接种数量均为 1. 0 × 108 个· mL － 1 ，在相同条件下进行培养，定时测定培养体系 的 pH 值、氧化还原电位( Eh ) 、Fe 2 + 氧化率以及菌种 的生长曲线． 在菌种培养过程中，pH 值是非常重要的参数， pH 值的变化会影响浸矿菌种的生长繁殖和亚铁的 ·534·