第5期 董颖博等：细菌化学诱变对低品位铜尾矿微生物浸出的影响 ·533· 浸出，但对微生物浸出尾矿研究还较少0.尾矿是 酸羟胺对出发菌进行化学诱变，使微生物体内遗传 亟待开发和利用的宝贵二次资源，与原生矿相比，矿 物质DNA的化学结构发生改变，以提高突变频率和 物性质发生了一定变化，因此研究适合尾矿特性高 扩大遗传变异幅度.研究中主要考察了不同诱变剂 效浸矿菌株显得尤为重要.在浸矿菌种育种方面， 量对菌种生长繁殖、氧化活性以及诱变菌种对尾矿 国内外都做了大量研究，主要选育方法包括菌种的 中铜浸出效率的影响，同时采用扫描电镜对浸出前 驯化、诱变和基因工程囚.由于驯化育种和基因工 后尾矿和诱变前后菌种进行了测试分析. 程育种还存在一定的劣势园，因此诱变育种便成为 目前对浸矿菌种进行性能改良的首选方法.化学诱 1实验 变育种技术具有易操作、剂量易控制、对基因组损伤 1.1实验矿样 小以及突变率高等特点，成为近年来运用最为广泛 实验矿样取自湖北大治某废弃铜尾矿，平均 的诱变技术可 铜品位为0.2%，其主要矿物成分为黄铜矿、微量 本文以湖北大治某废弃铜尾矿作为研究对象， 铜蓝、黄铁矿、白云石、方解石、透辉石、石英、方柱 以本实验室已开发出的优良浸出铜尾矿嗜酸氧化亚 石和绿泥石等.矿样化学多元素分析结果如表1 铁硫杆菌T.「优势菌株作为原始菌，采用诱变剂盐 所示 表1尾矿多元素分析结果（质量分数） Table 1 Result of multi-element analysis of the copper tailing % Cu Fe Si02 A203 Mgo Zn K20 Na,0 Ca0 Mn P Mo 0.20 6.585.3245.398.98 6.460.02 3.43 1.14 10.380.280.220.110.03 1.2菌种及培养条件 序列测定，该菌株属于嗜酸氧化亚铁硫杆菌，同源度 实验所用菌种为T.。,采自湖北大治某铜矿酸 100%,其16 sr DNA gene基因库登录序列号为 性矿坑水中(pH值约为4.5)，经过筛选、分离、耐铜 FN811931.1.T.f。菌株最佳培养条件为：初始 驯化培养以及适应尾矿环境驯化培养所得，委托北 pH2.0,摇床温度30℃，转速160rmin-1.采用改 京三博远志生物技术有限责任公司完成菌种鉴定和 进型4.5K培养基，其组成见表2. 表2改进型4.5K培养基组分及质量浓度 Table 2 Components and mass concentration of the improved 4.5 K medium 组分 (NH),S04 KCI K2 HPO Mgs04"7H20 FeSO.7H20 质量浓度/(gL) 2.0 0.1 0.25 0.25 22.1 1.3菌种诱变实验 入90mL己灭菌pH值为2的稀硫酸溶液，接入 菌种恒温培养至对数生长期，将菌液在5000r· 10mL对数生长期原始菌或诱变菌液（细菌数量均为 min-1下离心20min,去上清液得到沉淀，用pH值为 1.0×10个mL-),矿浆质量浓度为50gL-1,置于 2.0预先灭过菌的硫酸溶液对沉淀进行洗涤，然后 30℃、160r·min-1的空气浴恒温摇床内振荡培养，定 再离心去上清液，如此反复操作三次，以达到去除菌 期测定浸出液中活菌数目、H值、氧化还原电位和 液中F3+的目的，得到无铁细胞悬浊液，在生物显 Cu2+浓度.蒸发掉的水分用蒸馏水补足，取样消耗 微镜下进行计数，调整细菌浓度. 的液量用相应的溶液补充，使锥形瓶内溶液至 菌种诱变培养实验均采用250mL锥形瓶，分别 100mL刻度线 装入90mL含不同质量分数(0.5%，1.0%，2.0%， 1.5测试分析方法 3.0%)盐酸羟胺的改进型4.5K培养基，然后分别 亚铁离子的浓度采用重铬酸钾滴定法测定；pH 接入10mL菌液，细菌数量为1.0×108个·mL-1.诱 变处理在生长过程中进行，4d后开始计数，得到所 值采用PHS-2F型pH计测定：用铂-甘汞复合电极 用诱变剂量和菌种致死率的关系.不同剂量下诱变 在PHS-2F型pH计的电位挡测定氧化还原电位： 菌三次转代培养后，对其活性和浸铜效率进行考察. Cu2+浓度采用原子吸收光谱法测定；在ZBM-300E 1.4尾矿浸出实验 无穷远生物显微镜下采用血球计数板测定培养液和 尾矿浸出实验均在250mL锥形瓶中进行，内装 浸出液中活细菌的数量：菌种的氧化活性用细菌氧第 5 期 董颖博等: 细菌化学诱变对低品位铜尾矿微生物浸出的影响 浸出，但对微生物浸出尾矿研究还较少［4］． 尾矿是 亟待开发和利用的宝贵二次资源，与原生矿相比，矿 物性质发生了一定变化，因此研究适合尾矿特性高 效浸矿菌株显得尤为重要． 在浸矿菌种育种方面， 国内外都做了大量研究，主要选育方法包括菌种的 驯化、诱变和基因工程［5］． 由于驯化育种和基因工 程育种还存在一定的劣势［6］，因此诱变育种便成为 目前对浸矿菌种进行性能改良的首选方法． 化学诱 变育种技术具有易操作、剂量易控制、对基因组损伤 小以及突变率高等特点，成为近年来运用最为广泛 的诱变技术［7］． 本文以湖北大冶某废弃铜尾矿作为研究对象， 以本实验室已开发出的优良浸出铜尾矿嗜酸氧化亚 铁硫杆菌 T． f6优势菌株作为原始菌，采用诱变剂盐 酸羟胺对出发菌进行化学诱变，使微生物体内遗传 物质 DNA 的化学结构发生改变，以提高突变频率和 扩大遗传变异幅度． 研究中主要考察了不同诱变剂 量对菌种生长繁殖、氧化活性以及诱变菌种对尾矿 中铜浸出效率的影响，同时采用扫描电镜对浸出前 后尾矿和诱变前后菌种进行了测试分析． 1 实验 1. 1 实验矿样 实验矿样取自湖北大冶某废弃铜尾矿，平均 铜品位为 0. 2% ，其主要矿物成分为黄铜矿、微量 铜蓝、黄铁矿、白云石、方解石、透辉石、石英、方柱 石和绿泥石等． 矿样化学多元素分析结果如表 1 所示． 表 1 尾矿多元素分析结果( 质量分数) Table 1 Result of multi-element analysis of the copper tailing % Cu Fe S SiO2 Al2O3 MgO Zn K2O Na2O CaO TiO2 Mn P Mo 0. 20 6. 58 5. 32 45. 39 8. 98 6. 46 0. 02 3. 43 1. 14 10. 38 0. 28 0. 22 0. 11 0. 03 1. 2 菌种及培养条件 实验所用菌种为 T． f6，采自湖北大冶某铜矿酸 性矿坑水中( pH 值约为 4. 5) ，经过筛选、分离、耐铜 驯化培养以及适应尾矿环境驯化培养所得，委托北 京三博远志生物技术有限责任公司完成菌种鉴定和 序列测定，该菌株属于嗜酸氧化亚铁硫杆菌，同源度 100% ，其 16sr DNA gene 基因库登录序列号为 FN811931． 1． T． f6 菌 株 最 佳 培 养 条 件 为: 初 始 pH 2. 0，摇床温度 30 ℃，转速 160 r·min － 1 ． 采用改 进型 4. 5 K 培养基，其组成见表 2． 表 2 改进型 4. 5 K 培养基组分及质量浓度 Table 2 Components and mass concentration of the improved 4. 5 K medium 组分 ( NH4 ) 2 SO4 KCl K2HPO4 MgSO4 ·7H2O FeSO4 ·7H2O 质量浓度/( g·L － 1 ) 2. 0 0. 1 0. 25 0. 25 22. 1 1. 3 菌种诱变实验 菌种恒温培养至对数生长期，将菌液在 5 000 r· min － 1 下离心 20 min，去上清液得到沉淀，用 pH 值为 2. 0 预先灭过菌的硫酸溶液对沉淀进行洗涤，然后 再离心去上清液，如此反复操作三次，以达到去除菌 液中 Fe 3 + 的目的，得到无铁细胞悬浊液，在生物显 微镜下进行计数，调整细菌浓度． 菌种诱变培养实验均采用 250 mL 锥形瓶，分别 装入 90 mL 含不同质量分数( 0. 5% ，1. 0% ，2. 0% ， 3. 0% ) 盐酸羟胺的改进型 4. 5 K 培养基，然后分别 接入 10 mL 菌液，细菌数量为 1. 0 × 108 个·mL － 1 ． 诱 变处理在生长过程中进行，4 d 后开始计数，得到所 用诱变剂量和菌种致死率的关系． 不同剂量下诱变 菌三次转代培养后，对其活性和浸铜效率进行考察． 1. 4 尾矿浸出实验 尾矿浸出实验均在 250 mL 锥形瓶中进行，内装 入 90 mL 已 灭 菌 pH 值 为 2 的 稀 硫 酸 溶 液，接 入 10 mL对数生长期原始菌或诱变菌液( 细菌数量均为 1. 0 × 108 个·mL － 1 ) ，矿浆质量浓度为 50 g·L － 1 ，置于 30 ℃、160 r·min － 1 的空气浴恒温摇床内振荡培养，定 期测定浸出液中活菌数目、pH 值、氧化还原电位和 Cu2 + 浓度． 蒸发掉的水分用蒸馏水补足，取样消耗 的液量用相应的溶液补充，使锥形瓶内溶液至 100 mL刻度线． 1. 5 测试分析方法 亚铁离子的浓度采用重铬酸钾滴定法测定; pH 值采用 PHS--2F 型 pH 计测定; 用铂--甘汞复合电极 在 PHS--2F 型 pH 计的电位挡测定氧化还原电位; Cu2 + 浓度采用原子吸收光谱法测定; 在 ZBM--300E 无穷远生物显微镜下采用血球计数板测定培养液和 浸出液中活细菌的数量; 菌种的氧化活性用细菌氧 ·533·