胡凯建等：一株碱性产氨浸铜细菌改良试验研究 *1411 性状定向而稳定的改变，当外界环境调节适当，这种变 长，并通过紫外诱变和筛选，获得高浸出率的浸矿 异多为正向变异.诱变则是通过物理、化学等人为手 菌株 段改变微生物遗传物质，达到改变微生物性状的目的， 1 当剂量选择和筛选流程得当时，也会得到部分正突变 试验材料及方法 菌株.Wu等通过紫外诱变和筛选获得高耐银氧化 1.1试验材料 亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)菌株，并研究了 试验采用碱性产氨细菌JAT-1,经I6SRNA鉴定 其抗性机理.熊英等切以高含量的硫化物金精矿为驯 为Providencia sp..（普罗威登斯菌属).该菌株革兰氏 化介质，用紫外线和微波作为诱变剂诱变氧化亚铁硫 阴性，碳源为柠檬酸钠，氮源为尿素，兼性厌氧 杆菌，使其氧化活性提高40多倍。本文试验研究所涉 矿样为云南某矿氧化铜矿石，使用X射线衍射法 及的碱性细菌是从土壤中分离的，微生物并不能很好 对矿石进行铜物相分析，结果如表1.可以看出，该矿 适应浸矿环境，在浸出时存在明显的生长迟滞现象：同 石脉石矿物主要以硅酸盐为主，次有氧化物类，该铜矿 时，菌种活性低，浸出率低，这也限制了其应用范围. 石含泥量较高，为典型的难处理高碱性氧化铜矿石网 因此，本文以铜矿浆为驯化介质，使之在矿浆中稳定生 浸矿时全部采用加工至200目以下的矿样. 表1矿石化学成分（质量分数） Table 1 Chemical composition of the copper ore Cu Fe203 Mgo Ca0 Si02 Al203 Zn As W03 1.013 27.26 1.35 10.68 47.78 7.62 0.198 0.46 0.135 0.16 1.2试验方法 化质量浓度的培养基中（培养基初始pH值为7左右， 本试验采用室内摇瓶试验，在温度可调节的恒温 接种后pH值为8.25左右)，置于恒温培养箱中振荡 气浴振荡器中进行.采用透气封口膜封口，瓶内气体 培养，培养箱温度设为30℃，转速120r·min',每隔 与外界大气可交换，细菌则不能通过.试验过程中，细 8h取样观测并记录数据.采用驯化菌株与未驯化菌 菌数量采用血小板计数器计数.浸出率则通过取少量 株在相同条件下进行浸出试验，记录细菌生长和浸出 试样中的浸出液，检测其铜离子浓度后而获得的.为 率随时间变化情况.分离并保留驯化菌株作为紫外诱 了保证试验精度，取样后补充相同体积的新鲜培养基， 变的出发菌株. 以减少误差 2.3紫外诱变试验 2试验原理及方案 取培养液50mL,置于离心机中以3000r·min的 速度离心20min,弃上清液，以无菌生理盐水洗涤，将 2.1碱性细菌浸矿原理 菌悬液倾入带玻璃珠的三角瓶内振荡至菌体分散，过 Groudeva等曾使用尿素分解细菌进行过碳酸盐 滤，用血球计数板进行细菌计数.以生理盐水调整细 型铜矿浸出试验.研究显示网，碱性产氨菌株通过分 菌浓度至10°mL-备用.打开并预热255m紫外灯， 解尿素产氨，溶液中存在细菌对脉石的侵蚀作用，氨与 取5mL菌液放入9cm培养皿中，距离紫外灯30cm, 铜的各类矿石的络合作用，碱性细菌的氧化还原作用， 设定紫外照射时间为30、60、90、120、150和180s(以 以及某些大分子蛋白质和胞外多聚物(EPS)的络合 上步骤均为无光操作，紫外照射时间为0s的试验组为 作用00 对照组)，诱变完毕后分别取0.1mL涂抹至固体培养 矿浆质量中主要发生的反应有 基平板.待平板菌落形成后，记录试验组菌落数，并与 (NH),C0+H,0脲酶2NH,+C0, (1) 对照组菌落数对比计算致死率.致死率按照下列公式 NH3+H,0一→NH,OH, (2) 进行计算： CuO+2NH,OH+(NH),CO. L=- (5) Cu(NH).C03+3H,0, (3) Cu2S+6NH,0H+(NH),S04+5/202—→ 式中：L为致死率，N为对照组菌落数，N为诱变组菌 2Cu(NH).S04+7H,0. (4) 落数. 2.2菌种驯化试验 2.4响应曲面试验 采用3%的驯化梯度，以矿浆中固相质量浓度 为找到改良菌株的最佳浸矿环境，现对经驯化和 0.05gmL为初始梯度，0.2g"mL为最终梯度.每 诱变的改良菌株的浸出条件进行三因素三水平Bx一 一梯度经过多次转代再驯化，使浸矿细菌完全适应每 Behnken试验，考察矿浆中固相质量浓度、温度和接种 个梯度.取驯化前后菌株以20%的接种量加入最终驯 量三种因素对浸出结果的影响.对试验结果进行拟胡凯建等: 一株碱性产氨浸铜细菌改良试验研究 性状定向而稳定的改变，当外界环境调节适当，这种变 异多为正向变异． 诱变则是通过物理、化学等人为手 段改变微生物遗传物质，达到改变微生物性状的目的， 当剂量选择和筛选流程得当时，也会得到部分正突变 菌株． Wu 等［6］通过紫外诱变和筛选获得高耐银氧化 亚铁硫杆菌( Thiobacillus ferrooxidans) 菌株，并研究了 其抗性机理． 熊英等［7］以高含量的硫化物金精矿为驯 化介质，用紫外线和微波作为诱变剂诱变氧化亚铁硫 杆菌，使其氧化活性提高 40 多倍． 本文试验研究所涉 及的碱性细菌是从土壤中分离的，微生物并不能很好 适应浸矿环境，在浸出时存在明显的生长迟滞现象; 同 时，菌种活性低，浸出率低，这也限制了其应用范围． 因此，本文以铜矿浆为驯化介质，使之在矿浆中稳定生 长，并通 过 紫 外 诱 变 和 筛 选，获 得 高 浸 出 率 的 浸 矿 菌株． 1 试验材料及方法 1. 1 试验材料 试验采用碱性产氨细菌 JAT--1，经 16SＲNA 鉴定 为 Providencia sp． ( 普罗威登斯菌属) ． 该菌株革兰氏 阴性，碳源为柠檬酸钠，氮源为尿素，兼性厌氧． 矿样为云南某矿氧化铜矿石，使用 X 射线衍射法 对矿石进行铜物相分析，结果如表 1． 可以看出，该矿 石脉石矿物主要以硅酸盐为主，次有氧化物类，该铜矿 石含泥量较高，为典型的难处理高碱性氧化铜矿石［8］． 浸矿时全部采用加工至 200 目以下的矿样． 表 1 矿石化学成分 ( 质量分数) Table 1 Chemical composition of the copper ore % Cu Fe2O3 MgO CaO SiO2 Al2O3 Zn S As WO3 1. 013 27. 26 1. 35 10. 68 47. 78 7. 62 0. 198 0. 46 0. 135 0. 16 1. 2 试验方法 本试验采用室内摇瓶试验，在温度可调节的恒温 气浴振荡器中进行． 采用透气封口膜封口，瓶内气体 与外界大气可交换，细菌则不能通过． 试验过程中，细 菌数量采用血小板计数器计数． 浸出率则通过取少量 试样中的浸出液，检测其铜离子浓度后而获得的． 为 了保证试验精度，取样后补充相同体积的新鲜培养基， 以减少误差． 2 试验原理及方案 2. 1 碱性细菌浸矿原理 Groudeva 等［9］曾使用尿素分解细菌进行过碳酸盐 型铜矿浸出试验． 研究显示［10］，碱性产氨菌株通过分 解尿素产氨，溶液中存在细菌对脉石的侵蚀作用，氨与 铜的各类矿石的络合作用，碱性细菌的氧化还原作用， 以及某些大分子蛋白质和胞外多聚物( EPS) 的络合 作用［11］． 矿浆质量中主要发生的反应有 ( NH2 ) 2CO + H2O →脲酶2NH3 + CO2， ( 1) NH3 + H2O NH → 4OH， ( 2) CuO + 2NH4OH + ( NH4 ) 2CO3 → Cu( NH3 ) 4CO3 + 3H2O， ( 3) Cu2 S + 6NH4OH + ( NH4 ) 2 SO4 + 5 /2O2 → 2Cu( NH3 ) 4 SO4 + 7H2O． ( 4) 2. 2 菌种驯化试验 采用 3% 的 驯 化 梯 度，以矿浆中固相质量浓度 0. 05 g·mL － 1为初始梯度，0. 2 g·mL － 1为最终梯度． 每 一梯度经过多次转代再驯化，使浸矿细菌完全适应每 个梯度． 取驯化前后菌株以 20% 的接种量加入最终驯 化质量浓度的培养基中( 培养基初始 pH 值为 7 左右， 接种后 pH 值为 8. 25 左右) ，置于恒温培养箱中振荡 培养，培养箱温度设为 30 ℃，转速 120 r·min － 1，每隔 8 h取样观测并记录数据． 采用驯化菌株与未驯化菌 株在相同条件下进行浸出试验，记录细菌生长和浸出 率随时间变化情况． 分离并保留驯化菌株作为紫外诱 变的出发菌株． 2. 3 紫外诱变试验 取培养液 50 mL，置于离心机中以 3000 r·min － 1的 速度离心 20 min，弃上清液，以无菌生理盐水洗涤，将 菌悬液倾入带玻璃珠的三角瓶内振荡至菌体分散，过 滤，用血球计数板进行细菌计数． 以生理盐水调整细 菌浓度至 108 mL － 1备用． 打开并预热 255 nm 紫外灯， 取 5 mL 菌液放入 9 cm 培养皿中，距离紫外灯 30 cm， 设定紫外照射时间为 30、60、90、120、150 和 180 s( 以 上步骤均为无光操作，紫外照射时间为0 s 的试验组为 对照组) ，诱变完毕后分别取 0. 1 mL 涂抹至固体培养 基平板． 待平板菌落形成后，记录试验组菌落数，并与 对照组菌落数对比计算致死率． 致死率按照下列公式 进行计算: L = Nc － Nm Nc ． ( 5) 式中: L 为致死率，Nc为对照组菌落数，Nm为诱变组菌 落数． 2. 4 响应曲面试验 为找到改良菌株的最佳浸矿环境，现对经驯化和 诱变的改良菌株的浸出条件进行三因素三水平 Box-- Behnken 试验，考察矿浆中固相质量浓度、温度和接种 量三种因素对浸出结果的影响． 对试验结果进行拟 · 1141 ·