一株碱性产氨浸铜细菌改良试验研究

工程科学学报，第37卷，第11期：1410-1414,2015年11月 Chinese Journal of Engineering,Vol.37,No.11:1410-1414,November 2015 D0l:10.13374/j.issn2095-9389.2015.11.003;http://journals..ustb.edu.cn 一株碱性产氨浸铜细菌改良试验研究 胡凯建，王洪江四，李广泽，吴爱祥，黄明清 北京科技大学土木与环境工程学院，北京100083 ☒通信作者，E-mail:wanghj1988@126.com 摘要碱性浸矿细菌是处理碱性脉石矿物的新型高效菌株.为提高碱性浸矿细菌(Providencia sp.)的浸矿适应性和浸出 率，首次对其进行铜矿浆驯化和紫外诱变改良.使用Design Expert-8软件对改良菌株进行三因素三水平Box一Behnken试验设 计与结果分析，考察矿浆中固相质量浓度、接种量和温度三个因素与浸出率之间的关系，利用Design Expert8软件对试验条 件进行优化，确定改良菌株最佳浸出条件，并得到浸出率预测模型.在最佳浸出条件下对改良菌株与原始菌株别进行浸出试 验，比较二者在改良前后生长及浸出率的变化情况.结果显示：改良菌株能更好适应矿浆环境，细菌浓度最高时可达6.5× 10mL左右，浸出率达到了50.57%：而改良前细菌浓度最高只有3×10mL,浸出率也只有29.03%. 关键词铜矿处理：微生物浸矿：细菌：驯化：诱变：菌种改良 分类号TF803.2*1 Improvement experiment study of alkaline copper leaching bacteria HU Kai-jian,WANG Hong-jiang,LI Guang-ze,WU Ai-xiang,HUANG Ming-qing School of Civil and Environmental Engineering,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083,China Corresponding author,E-mail:wanghj1988@126.com ABSTRACT Alkaline leaching bacteria are new efficient strains for processing alkaline minerals.Slurry gradient domestication and ultraviolet mutagenesis were introduced to improve the adaptive capacity to environment and leaching rate of the strains.With the help of Design Expert-8 software,a three-factor threeevel Box-Behnken experiment was conducted to investigate the influence of pulp density,initial bacteria inoculation and temperature on the leaching rate.The optimal experimental condition was determined by Design Expert-8 software and a prediction model was proposed in this paper.Comparative experiment was conducted to investigate the differences before and after this improvement experiment under the optimal conditions.The results show that the improved strain can adapt to the pulp condition better.The population of the improved strain can up to 6.5x10 mLand the leaching rate reaches to 50.57%,while the population of the original strain can up to 3x10mLand the leaching rate reaches only to 29.03%. KEY WORDS copper ore treatment:microbial leaching:bacteria:domestication:mutagenesis;strain improvement 微生物浸矿成本低，浸矿环境温和，绿色环保四， 要潜在的应用价值， 适合处理低品位矿石.但传统微生物浸矿菌种主要聚 在微生物浸矿技术中，选育高效的浸矿菌种具有 焦在嗜酸氧化菌株的研究上网，它难以适应高碱性脉非常重要回的意义，而驯化与诱变则是目前运用最广 石矿物的浸出，因为碱性脉石耗酸量大而导致H值 泛的育种手段.微生物结构简单，遗传物质容易发生 波动大，微生物生长环境难以保证.碱性微生物浸 突变，当外界环境发生改变的时候，容易激活基因中某 出B可以有效解决以上问题，其研究对于降低浸矿 一段与环境相关联的基因，从而引起菌株性状的改变， 成本、实现绿色矿山以及丰富微生物浸矿菌种具有重 这是微生物驯化的基本原理.微生物驯化会使微生物 收稿日期：2014-06-26 基金项目：国家自然科学基金资助项目(50934002,51304011)：博士学科点专项科研基金资助项目(20110006130003)

工程科学学报，第 37 卷，第 11 期: 1410--1414，2015 年 11 月 Chinese Journal of Engineering，Vol． 37，No． 11: 1410--1414，November 2015 DOI: 10． 13374 /j． issn2095--9389． 2015． 11． 003; http: / /journals． ustb． edu． cn 一株碱性产氨浸铜细菌改良试验研究 胡凯建，王洪江，李广泽，吴爱祥，黄明清 北京科技大学土木与环境工程学院，北京 100083  通信作者，E-mail: wanghj1988@ 126． com 摘 要 碱性浸矿细菌是处理碱性脉石矿物的新型高效菌株． 为提高碱性浸矿细菌( Providencia sp． ) 的浸矿适应性和浸出 率，首次对其进行铜矿浆驯化和紫外诱变改良． 使用 Design Expert-8 软件对改良菌株进行三因素三水平 Box--Behnken 试验设 计与结果分析，考察矿浆中固相质量浓度、接种量和温度三个因素与浸出率之间的关系，利用 Design Expert-8 软件对试验条 件进行优化，确定改良菌株最佳浸出条件，并得到浸出率预测模型． 在最佳浸出条件下对改良菌株与原始菌株别进行浸出试 验，比较二者在改良前后生长及浸出率的变化情况． 结果显示: 改良菌株能更好适应矿浆环境，细菌浓度最高时可达 6. 5 × 108 mL － 1左右，浸出率达到了 50. 57% ; 而改良前细菌浓度最高只有 3 × 108 mL － 1，浸出率也只有 29. 03% ． 关键词 铜矿处理; 微生物浸矿; 细菌; 驯化; 诱变; 菌种改良 分类号 TF803. 2 + 1 Improvement experiment study of alkaline copper leaching bacteria HU Kai-jian，WANG Hong-jiang ，LI Guang-ze，WU Ai-xiang，HUANG Ming-qing School of Civil and Environmental Engineering，University of Science and Technology Beijing，Beijing 100083，China  Corresponding author，E-mail: wanghj1988@ 126． com ABSTＲACT Alkaline leaching bacteria are new efficient strains for processing alkaline minerals． Slurry gradient domestication and ultraviolet mutagenesis were introduced to improve the adaptive capacity to environment and leaching rate of the strains． With the help of Design Expert-8 software，a three-factor three-level Box-Behnken experiment was conducted to investigate the influence of pulp density，initial bacteria inoculation and temperature on the leaching rate． The optimal experimental condition was determined by Design Expert-8 software and a prediction model was proposed in this paper． Comparative experiment was conducted to investigate the differences before and after this improvement experiment under the optimal conditions． The results show that the improved strain can adapt to the pulp condition better． The population of the improved strain can up to 6. 5 × 108 mL － 1 and the leaching rate reaches to 50. 57% ，while the population of the original strain can up to 3 × 108 mL － 1 and the leaching rate reaches only to 29. 03% ． KEY WOＲDS copper ore treatment; microbial leaching; bacteria; domestication; mutagenesis; strain improvement 收稿日期: 2014--06--26 基金项目: 国家自然科学基金资助项目( 50934002，51304011) ; 博士学科点专项科研基金资助项目( 20110006130003) 微生物浸矿成本低，浸矿环境温和，绿色环保［1］， 适合处理低品位矿石． 但传统微生物浸矿菌种主要聚 焦在嗜酸氧化菌株的研究上［2］，它难以适应高碱性脉 石矿物的浸出，因为碱性脉石耗酸量大而导致 pH 值 波动大，微生物生长环境难以保证． 碱性微生 物 浸 出［3--4］可以有效解决以上问题，其研究对于降低浸矿 成本、实现绿色矿山以及丰富微生物浸矿菌种具有重 要潜在的应用价值． 在微生物浸矿技术中，选育高效的浸矿菌种具有 非常重要［5］的意义，而驯化与诱变则是目前运用最广 泛的育种手段． 微生物结构简单，遗传物质容易发生 突变，当外界环境发生改变的时候，容易激活基因中某 一段与环境相关联的基因，从而引起菌株性状的改变， 这是微生物驯化的基本原理． 微生物驯化会使微生物

胡凯建等：一株碱性产氨浸铜细菌改良试验研究 *1411 性状定向而稳定的改变，当外界环境调节适当，这种变 长，并通过紫外诱变和筛选，获得高浸出率的浸矿 异多为正向变异.诱变则是通过物理、化学等人为手 菌株 段改变微生物遗传物质，达到改变微生物性状的目的， 1 当剂量选择和筛选流程得当时，也会得到部分正突变 试验材料及方法 菌株.Wu等通过紫外诱变和筛选获得高耐银氧化 1.1试验材料 亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)菌株，并研究了 试验采用碱性产氨细菌JAT-1,经I6SRNA鉴定 其抗性机理.熊英等切以高含量的硫化物金精矿为驯 为Providencia sp..（普罗威登斯菌属).该菌株革兰氏 化介质，用紫外线和微波作为诱变剂诱变氧化亚铁硫 阴性，碳源为柠檬酸钠，氮源为尿素，兼性厌氧 杆菌，使其氧化活性提高40多倍。本文试验研究所涉 矿样为云南某矿氧化铜矿石，使用X射线衍射法 及的碱性细菌是从土壤中分离的，微生物并不能很好 对矿石进行铜物相分析，结果如表1.可以看出，该矿 适应浸矿环境，在浸出时存在明显的生长迟滞现象：同 石脉石矿物主要以硅酸盐为主，次有氧化物类，该铜矿 时，菌种活性低，浸出率低，这也限制了其应用范围. 石含泥量较高，为典型的难处理高碱性氧化铜矿石网 因此，本文以铜矿浆为驯化介质，使之在矿浆中稳定生 浸矿时全部采用加工至200目以下的矿样. 表1矿石化学成分（质量分数） Table 1 Chemical composition of the copper ore Cu Fe203 Mgo Ca0 Si02 Al203 Zn As W03 1.013 27.26 1.35 10.68 47.78 7.62 0.198 0.46 0.135 0.16 1.2试验方法 化质量浓度的培养基中（培养基初始pH值为7左右， 本试验采用室内摇瓶试验，在温度可调节的恒温 接种后pH值为8.25左右)，置于恒温培养箱中振荡 气浴振荡器中进行.采用透气封口膜封口，瓶内气体 培养，培养箱温度设为30℃，转速120r·min',每隔 与外界大气可交换，细菌则不能通过.试验过程中，细 8h取样观测并记录数据.采用驯化菌株与未驯化菌 菌数量采用血小板计数器计数.浸出率则通过取少量 株在相同条件下进行浸出试验，记录细菌生长和浸出 试样中的浸出液，检测其铜离子浓度后而获得的.为 率随时间变化情况.分离并保留驯化菌株作为紫外诱 了保证试验精度，取样后补充相同体积的新鲜培养基， 变的出发菌株. 以减少误差 2.3紫外诱变试验 2试验原理及方案 取培养液50mL,置于离心机中以3000r·min的 速度离心20min,弃上清液，以无菌生理盐水洗涤，将 2.1碱性细菌浸矿原理 菌悬液倾入带玻璃珠的三角瓶内振荡至菌体分散，过 Groudeva等曾使用尿素分解细菌进行过碳酸盐 滤，用血球计数板进行细菌计数.以生理盐水调整细 型铜矿浸出试验.研究显示网，碱性产氨菌株通过分 菌浓度至10°mL-备用.打开并预热255m紫外灯， 解尿素产氨，溶液中存在细菌对脉石的侵蚀作用，氨与 取5mL菌液放入9cm培养皿中，距离紫外灯30cm, 铜的各类矿石的络合作用，碱性细菌的氧化还原作用， 设定紫外照射时间为30、60、90、120、150和180s(以 以及某些大分子蛋白质和胞外多聚物(EPS)的络合 上步骤均为无光操作，紫外照射时间为0s的试验组为 作用00 对照组)，诱变完毕后分别取0.1mL涂抹至固体培养 矿浆质量中主要发生的反应有 基平板.待平板菌落形成后，记录试验组菌落数，并与 (NH),C0+H,0脲酶2NH,+C0, (1) 对照组菌落数对比计算致死率.致死率按照下列公式 NH3+H,0一→NH,OH, (2) 进行计算： CuO+2NH,OH+(NH),CO. L=- (5) Cu(NH).C03+3H,0, (3) Cu2S+6NH,0H+(NH),S04+5/202—→ 式中：L为致死率，N为对照组菌落数，N为诱变组菌 2Cu(NH).S04+7H,0. (4) 落数. 2.2菌种驯化试验 2.4响应曲面试验 采用3%的驯化梯度，以矿浆中固相质量浓度 为找到改良菌株的最佳浸矿环境，现对经驯化和 0.05gmL为初始梯度，0.2g"mL为最终梯度.每 诱变的改良菌株的浸出条件进行三因素三水平Bx一 一梯度经过多次转代再驯化，使浸矿细菌完全适应每 Behnken试验，考察矿浆中固相质量浓度、温度和接种 个梯度.取驯化前后菌株以20%的接种量加入最终驯 量三种因素对浸出结果的影响.对试验结果进行拟

胡凯建等: 一株碱性产氨浸铜细菌改良试验研究 性状定向而稳定的改变，当外界环境调节适当，这种变 异多为正向变异． 诱变则是通过物理、化学等人为手 段改变微生物遗传物质，达到改变微生物性状的目的， 当剂量选择和筛选流程得当时，也会得到部分正突变 菌株． Wu 等［6］通过紫外诱变和筛选获得高耐银氧化 亚铁硫杆菌( Thiobacillus ferrooxidans) 菌株，并研究了 其抗性机理． 熊英等［7］以高含量的硫化物金精矿为驯 化介质，用紫外线和微波作为诱变剂诱变氧化亚铁硫 杆菌，使其氧化活性提高 40 多倍． 本文试验研究所涉 及的碱性细菌是从土壤中分离的，微生物并不能很好 适应浸矿环境，在浸出时存在明显的生长迟滞现象; 同 时，菌种活性低，浸出率低，这也限制了其应用范围． 因此，本文以铜矿浆为驯化介质，使之在矿浆中稳定生 长，并通 过 紫 外 诱 变 和 筛 选，获 得 高 浸 出 率 的 浸 矿 菌株． 1 试验材料及方法 1. 1 试验材料 试验采用碱性产氨细菌 JAT--1，经 16SＲNA 鉴定 为 Providencia sp． ( 普罗威登斯菌属) ． 该菌株革兰氏 阴性，碳源为柠檬酸钠，氮源为尿素，兼性厌氧． 矿样为云南某矿氧化铜矿石，使用 X 射线衍射法 对矿石进行铜物相分析，结果如表 1． 可以看出，该矿 石脉石矿物主要以硅酸盐为主，次有氧化物类，该铜矿 石含泥量较高，为典型的难处理高碱性氧化铜矿石［8］． 浸矿时全部采用加工至 200 目以下的矿样． 表 1 矿石化学成分 ( 质量分数) Table 1 Chemical composition of the copper ore % Cu Fe2O3 MgO CaO SiO2 Al2O3 Zn S As WO3 1. 013 27. 26 1. 35 10. 68 47. 78 7. 62 0. 198 0. 46 0. 135 0. 16 1. 2 试验方法 本试验采用室内摇瓶试验，在温度可调节的恒温 气浴振荡器中进行． 采用透气封口膜封口，瓶内气体 与外界大气可交换，细菌则不能通过． 试验过程中，细 菌数量采用血小板计数器计数． 浸出率则通过取少量 试样中的浸出液，检测其铜离子浓度后而获得的． 为 了保证试验精度，取样后补充相同体积的新鲜培养基， 以减少误差． 2 试验原理及方案 2. 1 碱性细菌浸矿原理 Groudeva 等［9］曾使用尿素分解细菌进行过碳酸盐 型铜矿浸出试验． 研究显示［10］，碱性产氨菌株通过分 解尿素产氨，溶液中存在细菌对脉石的侵蚀作用，氨与 铜的各类矿石的络合作用，碱性细菌的氧化还原作用， 以及某些大分子蛋白质和胞外多聚物( EPS) 的络合 作用［11］． 矿浆质量中主要发生的反应有 ( NH2 ) 2CO + H2O →脲酶2NH3 + CO2， ( 1) NH3 + H2O NH → 4OH， ( 2) CuO + 2NH4OH + ( NH4 ) 2CO3 → Cu( NH3 ) 4CO3 + 3H2O， ( 3) Cu2 S + 6NH4OH + ( NH4 ) 2 SO4 + 5 /2O2 → 2Cu( NH3 ) 4 SO4 + 7H2O． ( 4) 2. 2 菌种驯化试验 采用 3% 的 驯 化 梯 度，以矿浆中固相质量浓度 0. 05 g·mL － 1为初始梯度，0. 2 g·mL － 1为最终梯度． 每 一梯度经过多次转代再驯化，使浸矿细菌完全适应每 个梯度． 取驯化前后菌株以 20% 的接种量加入最终驯 化质量浓度的培养基中( 培养基初始 pH 值为 7 左右， 接种后 pH 值为 8. 25 左右) ，置于恒温培养箱中振荡 培养，培养箱温度设为 30 ℃，转速 120 r·min － 1，每隔 8 h取样观测并记录数据． 采用驯化菌株与未驯化菌 株在相同条件下进行浸出试验，记录细菌生长和浸出 率随时间变化情况． 分离并保留驯化菌株作为紫外诱 变的出发菌株． 2. 3 紫外诱变试验 取培养液 50 mL，置于离心机中以 3000 r·min － 1的 速度离心 20 min，弃上清液，以无菌生理盐水洗涤，将 菌悬液倾入带玻璃珠的三角瓶内振荡至菌体分散，过 滤，用血球计数板进行细菌计数． 以生理盐水调整细 菌浓度至 108 mL － 1备用． 打开并预热 255 nm 紫外灯， 取 5 mL 菌液放入 9 cm 培养皿中，距离紫外灯 30 cm， 设定紫外照射时间为 30、60、90、120、150 和 180 s( 以 上步骤均为无光操作，紫外照射时间为0 s 的试验组为 对照组) ，诱变完毕后分别取 0. 1 mL 涂抹至固体培养 基平板． 待平板菌落形成后，记录试验组菌落数，并与 对照组菌落数对比计算致死率． 致死率按照下列公式 进行计算: L = Nc － Nm Nc ． ( 5) 式中: L 为致死率，Nc为对照组菌落数，Nm为诱变组菌 落数． 2. 4 响应曲面试验 为找到改良菌株的最佳浸矿环境，现对经驯化和 诱变的改良菌株的浸出条件进行三因素三水平 Box-- Behnken 试验，考察矿浆中固相质量浓度、温度和接种 量三种因素对浸出结果的影响． 对试验结果进行拟 · 1141 ·

·1412 工程科学学报，第37卷，第11期 合，获得浸出率预测模型，通过分析模型找到改良菌株 34.23%.经驯化，细菌生长周期变短，进入对数期时间 最佳浸出条件.试验因素及水平设置如表2所示： 缩短约20h,说明其已能够较好适应矿浆环境.但驯化 表2试验因素及水平设计表 后最终浸出率未明显提高，说明对于该菌株单纯驯化无 Table 2 Experimental factors and levels for Box-Behnken design 法明显提高菌种活性，只能提高其对矿浆环境的适应 矿浆中固相质量浓度/(g·mL1)温度/℃初始接种量/% 力，因此要提高浸出率还要考虑其他途径 0.08 25 15 760 ·一州化前南株生长曲线 55 0.16 35 25 到化菌株生长曲线 ▲一别化前菌株浸出率 50 一别化南株浸出率 145 2.5改良效果验证试验 40 5 为了验证菌株改良效果，分别使用改良菌株与原 35 4 30 菌株在优化条件下进行对比浸出试验，获得二者生长 25 3 及浸出随时间变化曲线. 120 2 15 3试验结果及讨论 10 5 3.1浓度梯度驯化试验结果及讨论 20 40 6080100120140 各矿浆质量浓度下驯化细菌生长及浸出情况如图1. 培养时间h 由图1可知：当矿浆中固相质量浓度在0.14gmL 图2驯化前后菌株生长和浸出对比 以下时，细菌能够较好地适应矿浆环境，并达到较高 Fig.2 Comparison of growth and leaching rate before and after the 浸出率：固相质量浓度超过0.14g·mL后，细菌生 domestication experiment 长情况受到较大影响，浸出率大幅下降，连续多代培 3.2紫外诱变试验结果及讨论 养后，浸出率仍然没有提升.原因可能是因为浸出环 如图3所示为紫外诱变时间与细菌致死率的关 境中重金属离子浓度过高，超过菌株承受范围，导致 系.随时间变化，致死率变化明显.因此可以得知， 其蛋白变质结构发生破坏.因此，综合考虑浸矿成本 255nm紫外线对该菌株具有较强的诱变作用，该菌种 等因素，选择0.14g·mL的固相质量浓度为最终驯 适合紫外诱变选育.致死率在80%~90%之间时☒， 化质量浓度 。 较适合之后的筛选工作，因此该菌株的紫外诱变时间 60 ·一细有浓度 选定为170s. 一▲一浸出率 8 50 100 0D/ 40 6 80 30 4 60 3 2 10 40 0.05 0.080.110.140.17 0.20 204 矿浆中固相质量浓度g·ml 图1不同矿浆质量浓度条件下细菌生长及浸出结果 60 90120 150 180 Fig.I Growth and leaching results of each domestication gradient 诱变时向/s 图3诱变时间对细菌致死率的影响 驯化前后菌株生长和浸出对比变化情况及分析如 Fig.3 Effect of irradiation time on bacterial lethality rate 图2所示.由图2可知，在10~30h之间，驯化菌株细菌 浓度未明显下降，较驯化前未出现明显生长迟滞现象 3.3Box-Behnken试验结果及讨论 驯化前，细菌在25h左右进入对数期，30h左右开始进 Box-Behnken试验结果如表3所示，Box-Behnken 入对数期生长，80h进入平稳期，细菌浓度最高达到 等高线及曲面响应结果如图4~图9所示. 3.5×103mL:驯化后，细菌在20h左右开始进入对数 从响应结果整体来看，图4~图7红色区域面积 期，70h到达平稳期，细菌最大浓度达到5.0×103mL'. 较大及颜色较深，说明矿浆中固相质量浓度和温度对 甽化前，碱性细菌的最大浸出率为29.03%，驯化后达到 浸出率影响较大，这两个因素仍然是制约浸出率的重

工程科学学报，第 37 卷，第 11 期 合，获得浸出率预测模型，通过分析模型找到改良菌株 最佳浸出条件． 试验因素及水平设置如表 2 所示: 表 2 试验因素及水平设计表 Table 2 Experimental factors and levels for Box--Behnken design 矿浆中固相质量浓度/( g·mL － 1 ) 温度/℃ 初始接种量/% 0. 08 25 15 0. 16 35 25 2. 5 改良效果验证试验 为了验证菌株改良效果，分别使用改良菌株与原 菌株在优化条件下进行对比浸出试验，获得二者生长 及浸出随时间变化曲线． 3 试验结果及讨论 3. 1 浓度梯度驯化试验结果及讨论 各矿浆质量浓度下驯化细菌生长及浸出情况如图 1． 由图 1 可知: 当矿浆中固相质量浓度在 0. 14 g·mL － 1 以下时，细菌能够较好地适应矿浆环境，并达到较高 浸出率; 固相质量浓度超过 0. 14 g·mL － 1 后，细菌生 长情况受到较大影响，浸出率大幅下降，连续多代培 养后，浸出率仍然没有提升． 原因可能是因为浸出环 境中重金属离子浓度过高，超过菌株承受范围，导致 其蛋白变质结构发生破坏． 因此，综合考虑浸矿成本 等因素，选择 0. 14 g·mL － 1的固相质量浓度为最终驯 化质量浓度． 图 1 不同矿浆质量浓度条件下细菌生长及浸出结果 Fig． 1 Growth and leaching results of each domestication gradient 驯化前后菌株生长和浸出对比变化情况及分析如 图 2 所示． 由图2 可知，在10 ～ 30 h 之间，驯化菌株细菌 浓度未明显下降，较驯化前未出现明显生长迟滞现象． 驯化前，细菌在 25 h 左右进入对数期，30 h 左右开始进 入对数期生长，80 h 进入平稳期，细菌浓度最高达到 3. 5 × 108 mL － 1 ; 驯化后，细菌在 20 h 左右开始进入对数 期，70 h 到达平稳期，细菌最大浓度达到5. 0 × 108 mL － 1 ． 驯化前，碱性细菌的最大浸出率为 29. 03% ，驯化后达到 34. 23% ． 经驯化，细菌生长周期变短，进入对数期时间 缩短约 20 h，说明其已能够较好适应矿浆环境． 但驯化 后最终浸出率未明显提高，说明对于该菌株单纯驯化无 法明显提高菌种活性，只能提高其对矿浆环境的适应 力，因此要提高浸出率还要考虑其他途径． 图 2 驯化前后菌株生长和浸出对比 Fig． 2 Comparison of growth and leaching rate before and after the domestication experiment 3. 2 紫外诱变试验结果及讨论 如图 3 所示为紫外诱变时间与细菌致死率的关 系． 随时间变化，致死率变化明显． 因此可以得知， 255 nm紫外线对该菌株具有较强的诱变作用，该菌种 适合紫外诱变选育． 致死率在 80% ～ 90% 之间时［12］， 较适合之后的筛选工作，因此该菌株的紫外诱变时间 选定为 170 s． 图 3 诱变时间对细菌致死率的影响 Fig． 3 Effect of irradiation time on bacterial lethality rate 3. 3 Box--Behnken 试验结果及讨论 Box--Behnken 试验结果如表 3 所示，Box--Behnken 等高线及曲面响应结果如图 4 ～ 图 9 所示． 从响应结果整体来看，图 4 ～ 图 7 红色区域面积 较大及颜色较深，说明矿浆中固相质量浓度和温度对 浸出率影响较大，这两个因素仍然是制约浸出率的重 · 2141 ·

胡凯建等：一株碱性产氨浸铜细菌改良试验研究 1413 表3Box-Behnken试验结果 浸出率% Table 3 Results of Box-Behnken design 矿浆中固相质量 接种 浸出 23 编号 温度/℃ 浓度/(gml-l) 量/% 率1% 21 46.1721 1 505 45 0.12 30 20 48.31 2 0.08 0 15 50.13 9 3 0.08 20 45.68 4 0.16 20 30.21 40 5 0.12 35 25 35.97 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 6 0.12 50.01 矿浆中固相质量浓度g~mL) 7 0.12 35 15 36.21 图6矿浆中固相质量浓度与接种量关系等高线 8 0.12 30 20 49.1 Fig.6 Contours betweeen slurry density and initial inoculation for 0.12 0 48.21 10 0.12 30 20 leaching rate 48.7 11 0.12 25 35.11 12 0.16 3 5 38.76 13 0.80 5 50.09 60 14 0.80 25 0 40.12 4 15 0.12 25 15 34.21 40 6 0.16 30 25 35 39.35 30 17 0.16 35 20 36.14 0.08 0.10 25 浸出率% 矿浆中固相质量 0.12 浓度g·mL 0.14 40 0.1615 17 192123 接种量，C% 46.1721 31 50 图7矿浆中固相质量浓度与接种量响应曲面 45 Fig.7 Response surface of slurry density and initial inoculation for 29 leaching rate 27 40 35 浸出率/% 0.10 0.120.14 0.16 40 和矿浆中固相质量浓度g·mL,-) 23 图4矿浆中固相质量浓度与温度关系等高线 21 40 45 45 Fig.4 Contours betweeen slurry density and temperature for leaching 19 rate 46.1721 色 35 60 1 25 27 29 31 33 35 温度.B/℃ 45 图8温度与接种量关系等高线 30 Fig.8 Contours betweeen temperature and initial inoculation for 0.08 leaching rate 矿浆中固相质 0.10 0.12 5 0.14 2g3133 环境，并能快速形成优势菌群.图9中固相质量浓度 温度，B℃ 在0.14g·mL、温度30℃的情况下浸出率为 46.17%,而同样条件下的驯化菌株浸出率为 图5矿浆中固相质量浓度与温度响应曲面 34.23%,未改良前则只有29.03%.说明经过改良，该 Fig.5 Response surface of slurry density and temperature for leac- 菌株浸出率提升17.14%.响应结果说明，驯化使微生 hing rate 物对浸矿环境有了更佳的适应性，而诱变则使浸矿细 要因素；图6红色区域较宽，并且图7曲面较平缓，说 菌的浸出率得到较大提升. 明各矿浆中固相质量浓度下初始接种量对浸出率的影 利用Design Expert8对试验结果进行二次多项回 响不明显：图8红色区域面积较小，并且颜色也较浅， 归拟合，以浸出率为响应值，以矿浆中固相质量浓度、 说明各温度下初始接种量对浸出率的影响同样不明 温度和接种量为自变量，拟合得到多元二次回归方程： 显.该结果表明，经过改良微生物已能较好适应矿浆 Y=-373.712-0.379A+24.574B+5.83C+

胡凯建等: 一株碱性产氨浸铜细菌改良试验研究 表 3 Box--Behnken 试验结果 Table 3 Ｒesults of Box--Behnken design 编号 矿浆中固相质量 浓度/( g·mL － 1 ) 温度/℃ 接种 量/% 浸出 率/% 1 0. 12 30 20 48. 31 2 0. 08 30 15 50. 13 3 0. 08 35 20 45. 68 4 0. 16 25 20 30. 21 5 0. 12 35 25 35. 97 6 0. 12 30 20 50. 01 7 0. 12 35 15 36. 21 8 0. 12 30 20 49. 1 9 0. 12 30 20 48. 21 10 0. 12 30 20 48. 7 11 0. 12 25 25 35. 11 12 0. 16 30 15 38. 76 13 0. 80 30 25 50. 09 14 0. 80 25 20 40. 12 15 0. 12 25 15 34. 21 16 0. 16 30 25 39. 35 17 0. 16 35 20 36. 14 图 4 矿浆中固相质量浓度与温度关系等高线 Fig． 4 Contours betweeen slurry density and temperature for leaching rate 图 5 矿浆中固相质量浓度与温度响应曲面 Fig． 5 Ｒesponse surface of slurry density and temperature for leac￾hing rate 要因素; 图 6 红色区域较宽，并且图 7 曲面较平缓，说 明各矿浆中固相质量浓度下初始接种量对浸出率的影 响不明显; 图 8 红色区域面积较小，并且颜色也较浅， 说明各温度下初始接种量对浸出率的影响同样不明 显． 该结果表明，经过改良微生物已能较好适应矿浆 图 6 矿浆中固相质量浓度与接种量关系等高线 Fig． 6 Contours betweeen slurry density and initial inoculation for leaching rate 图 7 矿浆中固相质量浓度与接种量响应曲面 Fig． 7 Ｒesponse surface of slurry density and initial inoculation for leaching rate 图 8 温度与接种量关系等高线 Fig． 8 Contours betweeen temperature and initial inoculation for leaching rate 环境，并能快速形成优势菌群． 图 9 中固相质量浓度 在 0. 14 g·mL － 1、温 度 30 ℃ 的 情 况 下 浸 出 率 为 46. 17% ，而同样条件下的驯化菌株浸出率为 34. 23% ，未改良前则只有 29. 03% ． 说明经过改良，该 菌株浸出率提升 17. 14% ． 响应结果说明，驯化使微生 物对浸矿环境有了更佳的适应性，而诱变则使浸矿细 菌的浸出率得到较大提升． 利用 Design Expert 8 对试验结果进行二次多项回 归拟合，以浸出率为响应值，以矿浆中固相质量浓度、 温度和接种量为自变量，拟合得到多元二次回归方程: Y = － 373. 712 － 0. 379A + 24. 574B + 5. 83C + · 3141 ·

1414 工程科学学报，第37卷，第11期 升，最终达到34.23%. 60 5 (2)曲面响应结果显示接种量对浸出率影响并不 5 45 明显，说明驯化和诱变使菌株更加适应矿浆环境：限制 050 浸出率的主要因素为矿浆中固相质量浓度和温度.在 0.14gmL固相质量浓度、30℃条件下，诱变后浸出 25 232119 35 率提高约11.94%. 接种量，C% 17152527293133 温度，B℃ (3)在优化条件下，改良菌株细菌浓度最高时可达 6.5×10mL左右，改良前则只有3×10°mL,提高2倍 图9温度与接种量响应曲面 多；改良菌株最终浸出率达到了50.57%，与预测值较为接 Fig.9 Response surface of temperature and initial inoculation for leaching rate 近，而未改良菌株则只有29.03%，提高21.54%. 参考文献 0.004AB+0.008AC-0.011BC-0.051A2- [Rohwerder T,Gehrke T,Kinzler K,et al.Bioleaching review 0.401B2-0.139C2 part A.Appl Microbiol Biotechnol,2003,63 (3):239 式中：Y为浸出率；A为矿浆中固相质量浓度，g·mL: 2]Sand W,Gehrke T,Jozsa P G,et al.(Bio)chemistry of bacterial B为温度，℃：C为接种量 leaching:direct vs.indirect bioleaching.Hydrometallurgy,2001, 分析回归方程，发现存在稳定点：A=8g·mL, 59:159 B] B=30.42℃，C=19.97%.此时模型预测浸出率为 Willscher S,Bosecker K.Studies on the leaching behaviour of 53.32%. heterotrophic microorganisms isolated from an alkaline slag dump Hydrometallurgy,2003,71:257 3.4改良效果验证试验结果及讨论 [4 Xiong Y W,Wang H J,Wu A X,et al.Research status and de- 在矿浆中固相质量浓度0.08g·mL、温度 velopment trend on bioleaching with alkaline microbes.Hydromet- 30.42℃和接种量19.97%的优化条件下进行改良效 all China,2012,31(4):199 果验证试验，结果如图10所示 (熊有为，王洪江，吴爱样，等.碱性微生物浸矿研究现状及 发展趋势.湿法治金，2012,431(4)：199) 10 60 5] Qiu G Z,Zhong K N.Breeding and industrial application of leac- 9 一。一出发南株生长曲线 一口一改良角株生长曲线 8 一▲一出发南株浸出率 4-4-4-4-4 hing bacteria.Met Ore Dressing Abroad,1998,35(6):29 50 (邱冠周，钟康年.浸矿细菌的有种及工业应用.国外金属矿 一△一改良南株浸出率 -0-日、 40 选矿，1998,35(6)：29) 6 [6]Wu X L,Qiu GZ,Gao J,et al.Mutagenic breeding of silver-te- A人44又4-4 30 sistant Acidithiobacillus ferrooxidans and exploration of resistant 4 mechanism.Trans Nonferrous Met Soc China,2007,17(2):412 每3 D A 20 [] Xiong Y,Hu JP Lin B H,et al Study on the domestication and 2 mutagenic selection of Thiobacillus ferrooxidans.Multipurpose Util 10 18 44 Miner Resour,2001 (6):27 (熊英，胡建平，林滨兰，等.氧化亚铁疏杆菌的驯化与诱变 2040 6080100120140160 培养时向M 选有.矿产综合利用，2001(6)：27) 8] Yao G H,Yan J L,Wang H J.Study on heated agitation leaching 图10优化条件下改良前后菌株生长及浸出变化规律 of copper oxide ore with high mud content.Sciencepaper Online, Fig.10 Change in growth and leaching rate in the optimized condi- 2010,5(11):855 tion (姚高辉，严佳龙，王洪江.高含泥氧化铜矿加温搅拌浸出试 脸研究.中国科技论文在线，2010,5(11)：855) 从图10中可看出：相对原菌株，改良细菌株的生 ] Groudeva V I,Krumova K,Groudev S N.Bioleaching of a rich- 长，菌浓度最高时可达6.5×103mL,改良前只有3× in-earbonates copper ore at alkaline pH.Ade Mater Res,2007, 103mL,提高了2倍多；改良菌株最终浸出率达到了 2021:103 50.57%,与预测值较为接近，而未改良菌株则只有 Wang H J,Xiong Y W,Wu A X,et al.Alkaline copper oxide ore bioleaching by ammonia-producing bacteria.JUnir Sci Tech- 29.03%.这说明经驯化和诱变的改良菌种，无论在是 nol Beijing,2013,35(9）:1126 生长方面还是在矿物浸出上都得到了显著提升. (王洪江，熊有为，吴爱样，等.产氨细菌浸出碱性氧化铜矿 北京科技大学学报，2013,35(9)：1126) 4结论 [11]Jain N,Sharma D K.Biohydrometallurgy for nonsulfidic miner- (1)驯化后菌株生长迟滞现象得到缓解，20h左 als:a review.Geomicrobiol J,2004,21(3):135 [12]Du L X.Experimental Technology of Industrial Microbiology. 右开始进入对数期，70h到达平稳期，细菌最大浓度达 Tianjin:Tianjin Science and Technology Press,1992 到5.0×10°mL水平，浸出率在40h左右开始大幅上 (杜连样.工业微生物学实验技术.天津科学技术出版社

工程科学学报，第 37 卷，第 11 期 图 9 温度与接种量响应曲面 Fig． 9 Ｒesponse surface of temperature and initial inoculation for leaching rate 0. 004AB + 0. 008AC － 0. 011BC － 0. 051A2 － 0. 401B2 － 0. 139C2 ． 式中: Y 为浸出率; A 为矿浆中固相质量浓度，g·mL － 1 ; B 为温度，℃ ; C 为接种量． 分析回归方程，发现存在稳定点: A = 8 g·mL － 1， B = 30. 42 ℃，C = 19. 97% ． 此时模型预测浸出率为 53. 32% ． 3. 4 改良效果验证试验结果及讨论 在矿 浆 中 固 相 质 量 浓 度 0. 08 g·mL － 1、温 度 30. 42 ℃和接种量 19. 97% 的优化条件下进行改良效 果验证试验，结果如图 10 所示． 图 10 优化条件下改良前后菌株生长及浸出变化规律 Fig． 10 Change in growth and leaching rate in the optimized condi￾tion 从图 10 中可看出: 相对原菌株，改良细菌株的生 长，菌浓度最高时可达6. 5 × 108 mL － 1，改良前只有3 × 108 mL － 1，提高了 2 倍多; 改良菌株最终浸出率达到了 50. 57% ，与预 测 值 较 为 接 近，而 未 改 良 菌 株 则 只 有 29. 03% ． 这说明经驯化和诱变的改良菌种，无论在是 生长方面还是在矿物浸出上都得到了显著提升． 4 结论 ( 1) 驯化后菌株生长迟滞现象得到缓解，20 h 左 右开始进入对数期，70 h 到达平稳期，细菌最大浓度达 到 5. 0 × 108 mL － 1水平，浸出率在 40 h 左右开始大幅上 升，最终达到 34. 23% ． ( 2) 曲面响应结果显示接种量对浸出率影响并不 明显，说明驯化和诱变使菌株更加适应矿浆环境; 限制 浸出率的主要因素为矿浆中固相质量浓度和温度． 在 0. 14 g·mL － 1固相质量浓度、30 ℃ 条件下，诱变后浸出 率提高约 11. 94% ． ( 3) 在优化条件下，改良菌株细菌浓度最高时可达 6. 5 × 108 mL － 1左右，改良前则只有3 × 108 mL － 1，提高 2 倍 多; 改良菌株最终浸出率达到了50. 57%，与预测值较为接 近，而未改良菌株则只有29. 03%，提高21. 54% ． 参 考 文 献 ［1］ Ｒohwerder T，Gehrke T，Kinzler K，et al． Bioleaching review part A． Appl Microbiol Biotechnol，2003，63( 3) : 239 ［2］ Sand W，Gehrke T，Jozsa P G，et al． ( Bio) chemistry of bacterial leaching: direct vs． indirect bioleaching． Hydrometallurgy，2001， 59: 159 ［3］ Willscher S，Bosecker K． Studies on the leaching behaviour of heterotrophic microorganisms isolated from an alkaline slag dump． Hydrometallurgy，2003，71: 257 ［4］ Xiong Y W，Wang H J，Wu A X，et al． Ｒesearch status and de￾velopment trend on bioleaching with alkaline microbes． Hydromet￾all China，2012，31( 4) : 199 ( 熊有为，王洪江，吴爱祥，等． 碱性微生物浸矿研究现状及 发展趋势． 湿法冶金，2012，431( 4) : 199) ［5］ Qiu G Z，Zhong K N ． Breeding and industrial application of leac￾hing bacteria． Met Ore Dressing Abroad，1998，35( 6) : 29 ( 邱冠周，钟康年． 浸矿细菌的育种及工业应用． 国外金属矿 选矿，1998，35( 6) : 29) ［6］ Wu X L，Qiu G Z，Gao J，et al． Mutagenic breeding of silver-re￾sistant Acidithiobacillus ferrooxidans and exploration of resistant mechanism． Trans Nonferrous Met Soc China，2007，17( 2) : 412 ［7］ Xiong Y，Hu J P Lin B H，et al Study on the domestication and mutagenic selection of Thiobacillus ferrooxidans． Multipurpose Util Miner Ｒesour，2001( 6) : 27 ( 熊英，胡建平，林滨兰，等． 氧化亚铁硫杆菌的驯化与诱变 选育． 矿产综合利用，2001( 6) : 27) ［8］ Yao G H，Yan J L，Wang H J． Study on heated agitation leaching of copper oxide ore with high mud content． Sciencepaper Online， 2010，5( 11) : 855 ( 姚高辉，严佳龙，王洪江． 高含泥氧化铜矿加温搅拌浸出试 验研究． 中国科技论文在线，2010，5( 11) : 855) ［9］ Groudeva V I，Krumova K，Groudev S N． Bioleaching of a rich￾in-carbonates copper ore at alkaline pH． Adv Mater Ｒes，2007， 20-21: 103 ［10］ Wang H J，Xiong Y W，Wu A X，et al． Alkaline copper oxide ore bioleaching by ammonia-producing bacteria． J Univ Sci Tech￾nol Beijing，2013，35( 9) : 1126 ( 王洪江，熊有为，吴爱祥，等． 产氨细菌浸出碱性氧化铜矿． 北京科技大学学报，2013，35( 9) : 1126) ［11］ Jain N，Sharma D K． Biohydrometallurgy for nonsulfidic miner￾als: a review． Geomicrobiol J，2004，21( 3) : 135 ［12］ Du L X． Experimental Technology of Industrial Microbiology． Tianjin: Tianjin Science and Technology Press，1992 ( 杜连祥． 工业微生物学实验技术． 天津科学技术出版社， · 4141 ·