杨先乐等:中华绒螯蟹血淋巴内盐酸环丙沙星的反相高效液相色谱法的建立 average extracted-precision were 1. 19 +0. 92 %, 1. 55 +0. 01 %and 2. 31 +1. 03 %, respectively. The law of the metabolism of blood-drug concentration was disclosed dropping from 37. 12 H0. 08 Hg mL"to 5.96 ug mL., by using RP-HPLC method to determine the ciprofloxacinum in hemolymph within 48 hours in crab after administration of the drug through intramuscular Key words Eriocheir sinensis, ciprofloxacinum; pharmacokinetics; RP-HPLC 盐酸环丙沙星( Ciprofloxacinum)属第三代喹诺酮类抗菌药,它通过与DNA回旋酶亚基A结合,抑制 了酶的切割与连接功能,阻止了DNA的复制,而起到抗菌作用山。由于盐酸环丙沙星的抗菌活性高抗 菌谱广、不易产生耐药性,被广泛地应用在水产动物细菌性疾病的防治上24。对由弧菌、嗜水气单胞 菌等引起的中华绒螯蟹细菌性疾病,盐酸环丙沙星也是首选药物之一1。但由于对该药在中华绒螯蟹 体内的药代动力学缺乏研究,因此,正确的使用剂量疗程以及相应的停药期都是借鉴人、兽医的资料, 存在较大的盲目性,这不仅影响了药物的使用效果,而且也给中华绒螯蟹的品质带来了一定的影响。 以往有关水产动物药动学方面的研究,大部分集中于鱼类,仅少数涉及到虾类、中华鳖等其它水产 动物61。由于进行中华绒螯蟹药代动力学研究的给药、采样方法和其它水产动物有较大的区别,在 某种程度上有一定难度,因此,用反向液相色谱测定法测定中华绒螯蟹体内药物的含量及药物动力学方 面的研究鲜有报道。本文旨在摸索从中华绒螯蟹体内抽取血淋巴并建立血药浓度检测方法,为弄清楚 盐酸环丙沙星在中华绒螯蟹体内的分布、代谢以及消除规律奠定基础,以便为中华绒螯蟹的合理用药指 示方向。 1材料与方法 1.1中华绒螯蟹 由上海前卫特种水产养殖公司一场提供,雄蟹130只,体重61.5.g;雌蟹110只,体重47.81± 7.62g。试验前,在4m×m的水泥池中分别暂养50d和15d,并在试验所用水族箱(1.0m×0.5m× 0.4m)中驯养一周。试验水温20.0±0.5℃ 1.2实验试剂 甲醇,HPLC级,上海吴径化工厂生产;盐酸环丙沙星标准品(纯度为99.54%),盐酸环丙沙星原粉 (纯度为98%),均由上海三维制药公司提供;抗凝剂肝素钠(1.45g·mL)、血淋巴抗凝剂AS ( anticoagulant solution)及ACD( acid citrate dextrose)参照蔡武城等的方法配制1。 1.3高效液相色谱仪及色谱条件 高效液相色谱仪采用 SHIMADZU LO-6A型系列,包括SC6A系统控制仪,SⅡ-6A自动进样器 SPD-6Aⅴ紫外检测器,CI06A柱温箱,LC6A高压泵,CR5A数据处理装置等。色谱条件:色谱柱为 RP-ODS C18分析柱(1cm×4.6mm,m),流动相按甲醇:磷酸缓冲液(0.05mol‘磷酸二氢甲+2.8 mL磷酸)四丁基溴化铵(0.05mol)=250:750:20(v/v/v)进行配制,流速1.0mmin1,检测波长 280nm,柱温40℃,检测灵敏度0.0AUFS 1.4抗凝效果实验 分别采取血淋巴与抗凝剂直接混合(vv=0.6.2)及抗凝剂浸润注射器与离心管后烘干的方式 比较三种抗凝剂肝素钠、AS与ACD的抗凝效果。在此基础上,选择上述抗凝效果较好的抗凝剂,比较 在血淋巴样品中加入不同体积抗凝剂的抗凝效果 1.5给药、血淋巴样的采集及血淋巴样前处理 盐酸环丙沙星原粉用双蒸水配成5和3 mg mLˉ的溶液(分别用于雄雌蟹),通过中华绒螯蟹第四 步足与体壁关节膜处肌肉注射给药,每只蟹0.1mL(即雄蟹:8.17±0.56mgg1;雌蟹:6.25±0.85 2o1994-2007ChinaAcademicJoumalElectroniePublishingHouse.Allrightsreserved.http:/wnwcnkinetaverage extracted2precision were 1. 19 ±0. 92 % , 1. 55 ±0. 01 % and 2. 31 ±1. 03 % , respectively. The law of the metabolism of blood2drug concentration was disclosed dropping from 37. 12 ±0. 08μg·mL - 1 to 5. 96 ±0. 18 μg·mL - 1 , by using RP2HPLC method to determine the ciprofloxacinum in hemolymph within 48 hours in male crab after administration of the drug through intramuscular. Key words : Eriocheir sinensis ; ciprofloxacinum ; pharmacokinetics ; RP2HPLC 盐酸环丙沙星(Ciprofloxacinum) 属第三代喹诺酮类抗菌药 ,它通过与 DNA 回旋酶亚基 A 结合 ,抑制 了酶的切割与连接功能 ,阻止了 DNA 的复制 ,而起到抗菌作用[1 ] 。由于盐酸环丙沙星的抗菌活性高、抗 菌谱广、不易产生耐药性 ,被广泛地应用在水产动物细菌性疾病的防治上[2 - 4] 。对由弧菌、嗜水气单胞 菌等引起的中华绒螯蟹细菌性疾病 ,盐酸环丙沙星也是首选药物之一[5 ] 。但由于对该药在中华绒螯蟹 体内的药代动力学缺乏研究 ,因此 ,正确的使用剂量、疗程以及相应的停药期都是借鉴人、兽医的资料 , 存在较大的盲目性 ,这不仅影响了药物的使用效果 ,而且也给中华绒螯蟹的品质带来了一定的影响。 以往有关水产动物药动学方面的研究 ,大部分集中于鱼类 ,仅少数涉及到虾类、中华鳖等其它水产 动物[6 - 16] 。由于进行中华绒螯蟹药代动力学研究的给药、采样方法和其它水产动物有较大的区别 ,在 某种程度上有一定难度 ,因此 ,用反向液相色谱测定法测定中华绒螯蟹体内药物的含量及药物动力学方 面的研究鲜有报道。本文旨在摸索从中华绒螯蟹体内抽取血淋巴并建立血药浓度检测方法 ,为弄清楚 盐酸环丙沙星在中华绒螯蟹体内的分布、代谢以及消除规律奠定基础 ,以便为中华绒螯蟹的合理用药指 示方向。 1 材料与方法 1. 1 中华绒螯蟹 由上海前卫特种水产养殖公司一场提供 ,雄蟹 130 只 ,体重 61. 5 ±4. 11g ;雌蟹 110 只 ,体重 47. 81 ± 7. 62g。试验前 ,在 4 m ×5 m 的水泥池中分别暂养 50d 和 15d ,并在试验所用水族箱 (1. 0m ×0. 5m × 0. 4m) 中驯养一周。试验水温 20. 0 ±0. 5 ℃。 1. 2 实验试剂 甲醇 , HPLC 级 ,上海吴径化工厂生产;盐酸环丙沙星标准品 (纯度为 99. 54 %) ,盐酸环丙沙星原粉 (纯度为 98 %) , 均由上海三维制药公司提供; 抗凝剂肝素钠 ( 1. 45μg·mL - 1 ) 、血淋巴抗凝剂 AS (anticoagulant solution) 及 ACD (acid citrate dextrose) 参照蔡武城等的方法配制[17] 。 1. 3 高效液相色谱仪及色谱条件 高效液相色谱仪采用 SHIMADZU LC26A 型系列 , 包括 SC26A 系统控制仪 , SIL26A 自动进样器 , SPD26AV 紫外检测器 , CTO26A 柱温箱 ,LC26A 高压泵 , C2R5A 数据处理装置等。色谱条件 :色谱柱为 RP2ODS C18分析柱(15cm ×4. 6mm , 5μm) ,流动相按甲醇∶磷酸缓冲液 (0. 05 mol·L - 1磷酸二氢甲 + 2. 8 mL 磷酸) ∶四丁基溴化铵(0. 05mol·L - 1) = 250 :750 :20 (v/ v/ v) 进行配制 ,流速 1. 0 mL·min - 1 ,检测波长 280nm ,柱温 40 ℃,检测灵敏度 0. 01AUFS 。 1. 4 抗凝效果实验 分别采取血淋巴与抗凝剂直接混合(v/ v = 0. 6∶0. 2) 及抗凝剂浸润注射器与离心管后烘干的方式 , 比较三种抗凝剂肝素钠、AS 与 ACD 的抗凝效果。在此基础上 ,选择上述抗凝效果较好的抗凝剂 ,比较 在血淋巴样品中加入不同体积抗凝剂的抗凝效果。 1. 5 给药、血淋巴样的采集及血淋巴样前处理 盐酸环丙沙星原粉用双蒸水配成 5 和 3 mg·mL - 1的溶液(分别用于雄、雌蟹) ,通过中华绒螯蟹第四 步足与体壁关节膜处肌肉注射给药 ,每只蟹 0. 1 mL (即雄蟹 :8. 17 ±0. 56mg·kg - 1 ; 雌蟹 :6. 25 ±0. 85 4 期 杨先乐等 :中华绒螯蟹血淋巴内盐酸环丙沙星的反相高效液相色谱法的建立 943 © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net