第25卷第4期 水产学报 o.25,No.4 2001年8月 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA Aug.,2001 文章编号:1000-0615(2001)04-0348-07 中华绒螯蟹血淋巴内盐酸环丙沙星的 反相高效液相色谱法的建立 杨先乐,刘至治,孙文钦,蔡完其 (上海水产大学农业部水产增养殖生态、生理重点开放实验室,上海20000 摘要:应用反相高效液相色谱法(RPHC)建立了盐酸环丙沙星在中华绒螯蟹血淋巴内含量的测定方法。本 法采用肌肉注射的给药方法,给药剂量为8.17±0.56mgkg和6.25±0.85mg*kg1。血淋巴从心区抽取 经各种抗凝方法的比较,认为等量的ACD与等量的血淋巴混合,可得到持久的抗凝效果。血淋巴样经甲醇去 蛋白,3000r/min离心10min后,取上清液上HC。色谱柱, RPODS5150×4.6mm;流动相,甲醇磷酸缓冲液 四丁基溴化铵=25075020(v/v/ν);流速,1 mL minˆl;进样量,2叽;检测波长,280nm。研究表明,本法线 性关系与重复性良好;雌雄蟹平均回收率分别为100.08书3.43%和99.11+8.20%;日间精密度、平均提取精 密度分别为1.19±0.92%、1.55±0.01%。用该方法对肌肉注射给药后48h内中华绒螯蟹雄蟹血淋巴中的盐 酸环丙沙星的血药浓度进行检测揭示出由37130gm降至5%6址18m”的代谢规律, 关键词:中华绒螯蟹;盐酸环丙沙星;药物动力学;反相高效液相色谱法 中图分类号:S65.116文献标识码:A The method of RP hPlC determination of ciprofloxacinum in hemolymph of Erioc heir sinenses YANG Xiarrle, LIU Zhi-zhi, SUN Wen-qin, CAI Wan-qi Key Laboratory d Ecology Physiology d Aquaculture d Ministry g agriculture Shanghai Fisheries University, Shanghai 200090, China Abstract: A method of determination of ciprofloxacinum in the hemolymph of Chinese mitten-handed crab Eirmcheir sinensis, was established by RP- HPLC. The drug was administered by intramuscular at a dose of 8.17 0. 56 and 6.25 H0. 85 mg kg" to male and female crab, repectively. The hemolymph was extracted from the cardiac region. By comparison among various anti-coagulant methods, the permanent result of anticoagulation was obtained through ACD mixing with equal volume hemolymph. Hemolymph samples got rid of protein by methanol, centrifuged at 3000 r min for 10 minutes and then the supernatant was used to HPL C. The RP-ODS 5HL 50 X4. 6mm ID column was used, with a mobile phase of methanol -phosphate buffer-tertrabutylammonium bromide= 250 3750 20( v/v/v); The flow rate was 1 mL min; the auto-injected volume, 2 HL and the detection wavelength, 280nm. The study showed that the linearity and repeatability were good; the average recovery of both male and female crab were: 100.08 +3. 43%and 99. 11 +8. 20%; the intra-day precision, the 收稿日期:200011-29 资助项目:农业部渔业重点科研项目(渔95B-00-01) 第一作者:杨先乐(1948-),男,湖南省桃源县人,研究员,主要从事水产动物病害研究。Tel:021-65710870,Emai:刈yang@sh 2 o1994-2007 China Academic Jourmal Electronic Publishing House. All rights reserved hp: /w. cnki. net
第 25 卷第 4 期 2001 年 8 月 水 产 学 报 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA Vol. 25 , No. 4 Aug. ,2001 文章编号 :1000 - 0615(2001) 04 - 0348 - 07 中华绒螯蟹血淋巴内盐酸环丙沙星的 反相高效液相色谱法的建立 收稿日期 :2000211229 资助项目 :农业部渔业重点科研项目(渔 95 - B - 00 - 01) 第一作者 :杨先乐(1948 - ) ,男 ,湖南省桃源县人 ,研究员 ,主要从事水产动物病害研究。Tel :021 - 65710870 , E2mail : xlyang @shfu. edu. cn 杨先乐 , 刘至治 , 孙文钦 , 蔡完其 (上海水产大学农业部水产增养殖生态、生理重点开放实验室 ,上海 200090) 摘要 :应用反相高效液相色谱法(RP2HPLC) 建立了盐酸环丙沙星在中华绒螯蟹血淋巴内含量的测定方法。本 法采用肌肉注射的给药方法 ,给药剂量为 8. 17 ±0. 56mg·kg - 1和 6. 25 ±0. 85mg·kg - 1。血淋巴从心区抽取。 经各种抗凝方法的比较 ,认为等量的 ACD 与等量的血淋巴混合 ,可得到持久的抗凝效果。血淋巴样经甲醇去 蛋白 ,3000 r/ min 离心 10min 后 ,取上清液上 HPLC。色谱柱 , RP2ODS25μ150 ×4. 6mm ;流动相 ,甲醇2磷酸缓冲液 2四丁基溴化铵 = 250∶750∶20 (v / v / v) ;流速 ,1 mL·min - 1 ;进样量 ,2μL ;检测波长 ,280nm。研究表明 ,本法线 性关系与重复性良好;雌、雄蟹平均回收率分别为 100. 08 ±3. 43 %和 99. 11 ±8. 20 % ;日间精密度、平均提取精 密度分别为 1. 19 ±0. 92 %、1. 55 ±0. 01 %。用该方法对肌肉注射给药后 48h 内中华绒螯蟹雄蟹血淋巴中的盐 酸环丙沙星的血药浓度进行检测 ,揭示出由 37. 13 ±0. 08μg·mL - 1降至 5. 96 ±0. 18μg·mL - 1的代谢规律。 关键词 :中华绒螯蟹;盐酸环丙沙星;药物动力学;反相高效液相色谱法 中图分类号 :S65. 116 文献标识码 : A The method of RP2HPLC determination of ciprofloxacinum in hemolymph of Eriocheir sinenses YANG Xian2le , LIU Zhi2zhi , SUN Wen2qin , CAI Wan2qi ( Key Laboratory of Ecology & Physiology of Aquaculture of Ministry of Agriculture , Shanghai Fisheries University , Shanghai 200090 , China) Abstract :A method of determination of ciprofloxacinum in the hemolymph of Chinese mitten 2handed crab , Eirocheir sinensis , was established by RP2HPLC. The drug was administered by intramuscular at a dose of 8. 17 ±0. 56 and 6. 25 ±0. 85 mg·kg - 1 to male and female crab ,repectively. The hemolymph was extracted from the cardiac region. By comparison among various anti2coagulant methods , the permanent result of anticoagulation was obtained through ACD mixing with equal volume hemolymph. Hemolymph samples got rid of protein by methanol , centrifuged at 3000 r·min - 1 for 10 minutes and then the supernatant was used to HPLC. The RP2ODS2 5μL 50 ×4. 6mm ID column was used , with a mobile phase of methanol2phosphate buffer2tertrabutylammonium bromide = 250∶750∶20 ( v/ v/ v ) ; The flow rate was 1 mL·min - 1 ; the auto2injected volume , 2μL and the uv detection wavelength , 280nm. The study showed that the linearity and repeatability were good ; the average recovery of both male and female crab were : 100. 08 ±3. 43 % and 99. 11 ±8. 20 % ; the intra2day precision , the © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
杨先乐等:中华绒螯蟹血淋巴内盐酸环丙沙星的反相高效液相色谱法的建立 average extracted-precision were 1. 19 +0. 92 %, 1. 55 +0. 01 %and 2. 31 +1. 03 %, respectively. The law of the metabolism of blood-drug concentration was disclosed dropping from 37. 12 H0. 08 Hg mL"to 5.96 ug mL., by using RP-HPLC method to determine the ciprofloxacinum in hemolymph within 48 hours in crab after administration of the drug through intramuscular Key words Eriocheir sinensis, ciprofloxacinum; pharmacokinetics; RP-HPLC 盐酸环丙沙星( Ciprofloxacinum)属第三代喹诺酮类抗菌药,它通过与DNA回旋酶亚基A结合,抑制 了酶的切割与连接功能,阻止了DNA的复制,而起到抗菌作用山。由于盐酸环丙沙星的抗菌活性高抗 菌谱广、不易产生耐药性,被广泛地应用在水产动物细菌性疾病的防治上24。对由弧菌、嗜水气单胞 菌等引起的中华绒螯蟹细菌性疾病,盐酸环丙沙星也是首选药物之一1。但由于对该药在中华绒螯蟹 体内的药代动力学缺乏研究,因此,正确的使用剂量疗程以及相应的停药期都是借鉴人、兽医的资料, 存在较大的盲目性,这不仅影响了药物的使用效果,而且也给中华绒螯蟹的品质带来了一定的影响。 以往有关水产动物药动学方面的研究,大部分集中于鱼类,仅少数涉及到虾类、中华鳖等其它水产 动物61。由于进行中华绒螯蟹药代动力学研究的给药、采样方法和其它水产动物有较大的区别,在 某种程度上有一定难度,因此,用反向液相色谱测定法测定中华绒螯蟹体内药物的含量及药物动力学方 面的研究鲜有报道。本文旨在摸索从中华绒螯蟹体内抽取血淋巴并建立血药浓度检测方法,为弄清楚 盐酸环丙沙星在中华绒螯蟹体内的分布、代谢以及消除规律奠定基础,以便为中华绒螯蟹的合理用药指 示方向。 1材料与方法 1.1中华绒螯蟹 由上海前卫特种水产养殖公司一场提供,雄蟹130只,体重61.5.g;雌蟹110只,体重47.81± 7.62g。试验前,在4m×m的水泥池中分别暂养50d和15d,并在试验所用水族箱(1.0m×0.5m× 0.4m)中驯养一周。试验水温20.0±0.5℃ 1.2实验试剂 甲醇,HPLC级,上海吴径化工厂生产;盐酸环丙沙星标准品(纯度为99.54%),盐酸环丙沙星原粉 (纯度为98%),均由上海三维制药公司提供;抗凝剂肝素钠(1.45g·mL)、血淋巴抗凝剂AS ( anticoagulant solution)及ACD( acid citrate dextrose)参照蔡武城等的方法配制1。 1.3高效液相色谱仪及色谱条件 高效液相色谱仪采用 SHIMADZU LO-6A型系列,包括SC6A系统控制仪,SⅡ-6A自动进样器 SPD-6Aⅴ紫外检测器,CI06A柱温箱,LC6A高压泵,CR5A数据处理装置等。色谱条件:色谱柱为 RP-ODS C18分析柱(1cm×4.6mm,m),流动相按甲醇:磷酸缓冲液(0.05mol‘磷酸二氢甲+2.8 mL磷酸)四丁基溴化铵(0.05mol)=250:750:20(v/v/v)进行配制,流速1.0mmin1,检测波长 280nm,柱温40℃,检测灵敏度0.0AUFS 1.4抗凝效果实验 分别采取血淋巴与抗凝剂直接混合(vv=0.6.2)及抗凝剂浸润注射器与离心管后烘干的方式 比较三种抗凝剂肝素钠、AS与ACD的抗凝效果。在此基础上,选择上述抗凝效果较好的抗凝剂,比较 在血淋巴样品中加入不同体积抗凝剂的抗凝效果 1.5给药、血淋巴样的采集及血淋巴样前处理 盐酸环丙沙星原粉用双蒸水配成5和3 mg mLˉ的溶液(分别用于雄雌蟹),通过中华绒螯蟹第四 步足与体壁关节膜处肌肉注射给药,每只蟹0.1mL(即雄蟹:8.17±0.56mgg1;雌蟹:6.25±0.85 2o1994-2007ChinaAcademicJoumalElectroniePublishingHouse.Allrightsreserved.http:/wnwcnkinet
average extracted2precision were 1. 19 ±0. 92 % , 1. 55 ±0. 01 % and 2. 31 ±1. 03 % , respectively. The law of the metabolism of blood2drug concentration was disclosed dropping from 37. 12 ±0. 08μg·mL - 1 to 5. 96 ±0. 18 μg·mL - 1 , by using RP2HPLC method to determine the ciprofloxacinum in hemolymph within 48 hours in male crab after administration of the drug through intramuscular. Key words : Eriocheir sinensis ; ciprofloxacinum ; pharmacokinetics ; RP2HPLC 盐酸环丙沙星(Ciprofloxacinum) 属第三代喹诺酮类抗菌药 ,它通过与 DNA 回旋酶亚基 A 结合 ,抑制 了酶的切割与连接功能 ,阻止了 DNA 的复制 ,而起到抗菌作用[1 ] 。由于盐酸环丙沙星的抗菌活性高、抗 菌谱广、不易产生耐药性 ,被广泛地应用在水产动物细菌性疾病的防治上[2 - 4] 。对由弧菌、嗜水气单胞 菌等引起的中华绒螯蟹细菌性疾病 ,盐酸环丙沙星也是首选药物之一[5 ] 。但由于对该药在中华绒螯蟹 体内的药代动力学缺乏研究 ,因此 ,正确的使用剂量、疗程以及相应的停药期都是借鉴人、兽医的资料 , 存在较大的盲目性 ,这不仅影响了药物的使用效果 ,而且也给中华绒螯蟹的品质带来了一定的影响。 以往有关水产动物药动学方面的研究 ,大部分集中于鱼类 ,仅少数涉及到虾类、中华鳖等其它水产 动物[6 - 16] 。由于进行中华绒螯蟹药代动力学研究的给药、采样方法和其它水产动物有较大的区别 ,在 某种程度上有一定难度 ,因此 ,用反向液相色谱测定法测定中华绒螯蟹体内药物的含量及药物动力学方 面的研究鲜有报道。本文旨在摸索从中华绒螯蟹体内抽取血淋巴并建立血药浓度检测方法 ,为弄清楚 盐酸环丙沙星在中华绒螯蟹体内的分布、代谢以及消除规律奠定基础 ,以便为中华绒螯蟹的合理用药指 示方向。 1 材料与方法 1. 1 中华绒螯蟹 由上海前卫特种水产养殖公司一场提供 ,雄蟹 130 只 ,体重 61. 5 ±4. 11g ;雌蟹 110 只 ,体重 47. 81 ± 7. 62g。试验前 ,在 4 m ×5 m 的水泥池中分别暂养 50d 和 15d ,并在试验所用水族箱 (1. 0m ×0. 5m × 0. 4m) 中驯养一周。试验水温 20. 0 ±0. 5 ℃。 1. 2 实验试剂 甲醇 , HPLC 级 ,上海吴径化工厂生产;盐酸环丙沙星标准品 (纯度为 99. 54 %) ,盐酸环丙沙星原粉 (纯度为 98 %) , 均由上海三维制药公司提供; 抗凝剂肝素钠 ( 1. 45μg·mL - 1 ) 、血淋巴抗凝剂 AS (anticoagulant solution) 及 ACD (acid citrate dextrose) 参照蔡武城等的方法配制[17] 。 1. 3 高效液相色谱仪及色谱条件 高效液相色谱仪采用 SHIMADZU LC26A 型系列 , 包括 SC26A 系统控制仪 , SIL26A 自动进样器 , SPD26AV 紫外检测器 , CTO26A 柱温箱 ,LC26A 高压泵 , C2R5A 数据处理装置等。色谱条件 :色谱柱为 RP2ODS C18分析柱(15cm ×4. 6mm , 5μm) ,流动相按甲醇∶磷酸缓冲液 (0. 05 mol·L - 1磷酸二氢甲 + 2. 8 mL 磷酸) ∶四丁基溴化铵(0. 05mol·L - 1) = 250 :750 :20 (v/ v/ v) 进行配制 ,流速 1. 0 mL·min - 1 ,检测波长 280nm ,柱温 40 ℃,检测灵敏度 0. 01AUFS 。 1. 4 抗凝效果实验 分别采取血淋巴与抗凝剂直接混合(v/ v = 0. 6∶0. 2) 及抗凝剂浸润注射器与离心管后烘干的方式 , 比较三种抗凝剂肝素钠、AS 与 ACD 的抗凝效果。在此基础上 ,选择上述抗凝效果较好的抗凝剂 ,比较 在血淋巴样品中加入不同体积抗凝剂的抗凝效果。 1. 5 给药、血淋巴样的采集及血淋巴样前处理 盐酸环丙沙星原粉用双蒸水配成 5 和 3 mg·mL - 1的溶液(分别用于雄、雌蟹) ,通过中华绒螯蟹第四 步足与体壁关节膜处肌肉注射给药 ,每只蟹 0. 1 mL (即雄蟹 :8. 17 ±0. 56mg·kg - 1 ; 雌蟹 :6. 25 ±0. 85 4 期 杨先乐等 :中华绒螯蟹血淋巴内盐酸环丙沙星的反相高效液相色谱法的建立 943 © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
水产学报 mgkg)。从蟹背部心区开一小孔,用抗凝剂润湿管壁的卡介苗注射器抽取血淋巴,每只蟹1mL。给药 前,先各抽取一组蟹(5只)的血淋巴,作为空白对照;给药后,按所设时间点,定时抽取血淋巴,每个时间 点取5只蟹,并做一个重复。用最佳抗凝方法6000minl15min分离血浆,样品置于-60℃冰箱备用 RP HPLC检测前,血浆自然溶解后摇匀,准确吸取0.5m于10m离心管中,加入甲醇1mL,旋涡混合 2min,再加入甲醇0.5nL,同法混合2min,3000 r min离心l0min,吸取上清液于1.5mL样品瓶中,自 动进样器2进样。 1.6标准曲线的制备 用定容浓度依次为1.0152.030、3.045、4.060、5.075、10.15吗gmnL的盐酸环丙沙星标准溶液系 列,以 RP-HPLO测得的峰面积为纵坐标,相应的浓度为横坐标,作出浓度范围为1~10ugmL的标准 曲线,并通过 SYSTAT软件,求出回归方程和相关系数 1.7回收率测定 采用加入法。将0.5mL雄蟹空白血浆分别加入含盐酸环丙沙星标准溶液(浓度为101.5 Hg mL) 150、2550、75μ的离心管中,处理与RPHC测定同“血样”。同法进行雌蟹空白血浆的回收率测 定。HC测定后,按标准曲线回归方程计算回收率[回收率(%)=样品实测浓度/样品实际浓度× 100%] 1.8精密度测定 采用加入法 1.8.1提取精密度(重复性 在5只各盛有0.5mL蟹空白血浆的离心管中分别加入浓度为1033ugmL的标准盐酸环丙沙 星溶液50μ,其余同“血样”处理。平行测定后,计算出各管盐酸环丙沙星浓度及变异系数(RSD)。同 法,对浓度为101.5吗gmL的标准盐酸环丙沙星溶液再重复平行测定一次,计算RsD。 1.8.2日间精密度 将浓度为2.03、4.06、10.15吗gmL的标准盐酸环丙沙星溶液1mL加入1.5mL样品瓶中,RP HPC法连续测定2次,每隔3d一次,计算平均峰面积及RSD。 1.9中华绒螯雄蟹血淋巴内盐酸环丙沙星药物浓度(以下简称血药浓度)的测定 按所建立的方法,测定肌肉注射给药0.017h(lmin)、0.083h(5min)、0.167h(10min)0.5h、lh、1.5h 2h4h、S8h、l2h24h<48h后中华绒螯蟹雄蟹的血药浓度,以此检验所建立的方法。 2结果 2.1最佳抗凝剂和抗凝方法 通过在相同条件下,肝素钠AS与ACD三种抗凝剂的抗凝效果比较,结果表明在血淋巴中加入肝 素钠者1.5h后,即出现50%以上的胶状凝集,而AS在30h后才有少量絮状沉淀出现,ACD36.5h后才 有少量白色絮状物;采取润湿管壁后烘干方式,发现使用肝素钠者血淋巴样迅速凝固,而使用ACD者 72h后仍未见凝固现象。表1是ACD的不同处理方式与ACD与血淋巴不同体积比的抗凝效果。结果 表明,ACD采取润湿烘干方式不适于血淋巴较长时间保存,只有将等量的ACD与等量的血淋巴混合 才能取得较持久的抗凝效果 2.2中华绒螯蟹血淋巴中盐酸环丙沙星的色谱行为 在1.3所设计的色谱条件下,HC基线走动平稳,盐酸环丙沙星保留时间为10.3min,样品血浆中 虽有杂质峰出现,但无干扰峰,与药峰分离良好(图1)。 2.3标准曲线的线性范围和灵敏度 在标准品盐酸环丙沙星浓度为1~10吗gmL时,标准曲线为Y=-675.63+1204.723X(Y峰面 e1994-2007ChinaAcademicournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://n.cnki,ner
mg·kg - 1) 。从蟹背部心区开一小孔 ,用抗凝剂润湿管壁的卡介苗注射器抽取血淋巴 ,每只蟹 1 mL 。给药 前 ,先各抽取一组蟹(5 只) 的血淋巴 ,作为空白对照;给药后 ,按所设时间点 ,定时抽取血淋巴 ,每个时间 点取 5 只蟹 ,并做一个重复。用最佳抗凝方法 6000r·min - 1 15min 分离血浆 ,样品置于 - 60 ℃冰箱备用。 RP2HPLC 检测前 ,血浆自然溶解后摇匀 ,准确吸取 0. 5 mL 于 10 mL 离心管中 ,加入甲醇 1 mL ,旋涡混合 2min ,再加入甲醇 0. 5 mL ,同法混合 2min ,3000 r·min - 1离心 10min ,吸取上清液于 1. 5 mL 样品瓶中 ,自 动进样器 2μL 进样。 1. 6 标准曲线的制备 用定容浓度依次为 1. 015、2. 030、3. 045、4. 060、5. 075、10. 15μg·mL - 1的盐酸环丙沙星标准溶液系 列 ,以 RP2HPLC 测得的峰面积为纵坐标 ,相应的浓度为横坐标 ,作出浓度范围为 1～10μg·mL - 1的标准 曲线 ,并通过 S YSTAT 软件 ,求出回归方程和相关系数。 1. 7 回收率测定 采用加入法。将 0. 5 mL 雄蟹空白血浆分别加入含盐酸环丙沙星标准溶液(浓度为 101. 5μg·mL - 1) 15、20、25、50、75μL 的离心管中 ,处理与 RP2HPLC 测定同“血样”。同法进行雌蟹空白血浆的回收率测 定。HPLC 测定后 ,按标准曲线回归方程计算回收率[回收率 ( %) = 样品实测浓度 / 样品实际浓度 × 100 % ] 。 1. 8 精密度测定 采用加入法。 1. 8. 1 提取精密度(重复性) 在 5 只各盛有 0. 5 mL 蟹空白血浆的离心管中分别加入浓度为 1011. 33μg·mL - 1的标准盐酸环丙沙 星溶液 50μL ,其余同“血样”处理。平行测定后 ,计算出各管盐酸环丙沙星浓度及变异系数 (RSD) 。同 法 ,对浓度为 101. 5μg·mL - 1的标准盐酸环丙沙星溶液再重复平行测定一次 ,计算 RSD 。 1. 8. 2 日间精密度 将浓度为 2. 03、4. 06、10. 15μg·mL - 1的标准盐酸环丙沙星溶液 1 mL 加入 1. 5mL 样品瓶中 , RP2 HPLC 法连续测定 2 次 ,每隔 3 d 一次 ,计算平均峰面积及 RSD 。 1. 9 中华绒螯雄蟹血淋巴内盐酸环丙沙星药物浓度(以下简称血药浓度) 的测定 按所建立的方法 ,测定肌肉注射给药 0. 017h (1min) 、0. 083h (5min) 、0. 167h (10min) 、0. 5h、1h、1. 5h、 2h、4h、8h、12h、24h、48h 后中华绒螯蟹雄蟹的血药浓度 ,以此检验所建立的方法。 2 结果 2. 1 最佳抗凝剂和抗凝方法 通过在相同条件下 ,肝素钠、AS 与 ACD 三种抗凝剂的抗凝效果比较 ,结果表明在血淋巴中加入肝 素钠者 1. 5h 后 ,即出现 50 %以上的胶状凝集 ,而 AS 在 30h 后才有少量絮状沉淀出现 ,ACD 36. 5h 后才 有少量白色絮状物;采取润湿管壁后烘干方式 ,发现使用肝素钠者血淋巴样迅速凝固 ,而使用 ACD 者 72 h 后仍未见凝固现象。表 1 是 ACD 的不同处理方式与 ACD 与血淋巴不同体积比的抗凝效果。结果 表明 ,ACD 采取润湿烘干方式不适于血淋巴较长时间保存 ,只有将等量的 ACD 与等量的血淋巴混合 , 才能取得较持久的抗凝效果。 2. 2 中华绒螯蟹血淋巴中盐酸环丙沙星的色谱行为 在 1. 3 所设计的色谱条件下 , HPLC 基线走动平稳 ,盐酸环丙沙星保留时间为 10. 3min ,样品血浆中 虽有杂质峰出现 ,但无干扰峰 ,与药峰分离良好(图 1) 。 2. 3 标准曲线的线性范围和灵敏度 在标准品盐酸环丙沙星浓度为 1～10μg·mL - 1时 ,标准曲线为 Y = - 675. 63 + 1204. 723X ( Y2峰面 053 水 产 学 报 25 卷 © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
杨先乐等:中华绒螯蟹血淋巴内盐酸环丙沙星的反相高效液相色谱法的建立 351 积,X盐酸环丙沙星浓度)(图2)。相关系数为r=0.9985,相关性良好。根据标准曲线,以引起两倍基 线噪音的药量为最低检测限,得出本法的灵敏度为0.01吗gmL。 表1AOD的处理方式及其不同体积的抗凝效果比较 lab. 1 The comparison of anticoagulation of AdD by different treatments and various volume 处理方式 ACD加入量 血淋巴量 ACD与血淋巴 的体积比 试验重复次数 抗凝效果 ACD润湿管壁 后烘干 0.2 /土 ACD与 血淋巴混合 +/+ 0.2 +/+/+/+ 注抗凝效果样品在低温(4下放置15d以上,“+代表凝固,“"代表不凝固 图1盐酸环丙沙星的色谱行为 Fig. I Liquid chromatogram of ciprofloxacinum A.标准盐酸环丙沙星;B.雄蟹空白血浆;C.加入标准盐酸环丙沙星后的雄蟹血浆;D.给药I后的雄蟹血浆样品; E.雌蟹空白血浆;F给药48h后的雌蟹血浆样品;1所指示的色谱峰为盐酸环丙沙星峰 2.4回收率 分别对雌、雄蟹空白血淋巴中5种不同浓度的 盐酸环丙沙星回收率测定结果表明,其范围8 88.71%105.76%和97.37%~105.45%间;平均回 收率为99.11±8.20%和100.08±3.43%(表2,表誉 2.5精密度 浓度/1-10ug 浓度为1011.33吗gm与101.5吗gmL的盐 酸环丙沙星标准溶液的提取精密度(重复性)测定结 图2盐酸环丙沙星标准曲线 果表明,其变异系数(RSD)分别为1.55%与1.54% Fig. 2 The standard curve of ciprofloxacinum o1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved hup. //wr cnki, ner
积 , X2盐酸环丙沙星浓度) (图 2) 。相关系数为 r = 0. 9985 ,相关性良好。根据标准曲线 ,以引起两倍基 线噪音的药量为最低检测限 ,得出本法的灵敏度为 0. 01μg·mL - 1。 表 1 ACD 的处理方式及其不同体积的抗凝效果比较 Tab. 1 The comparison of anticoagulation of ACD by different treatments and various volume 处理方式 ACD 加入量 (mL) 血淋巴量 (mL) ACD 与血淋巴 的体积比 试验重复次数 抗凝效果 ACD 润湿管壁 后烘干 - - - 0. 6 0. 5 0. 2 - - - 2 3 2 + / + + / + / + + / + ACD 与 血淋巴混合 0 0. 3 0 1 + 0 0. 5 0 1 + 0. 1 1. 0 1/ 10 1 + 0. 2 1. 0 1/ 5 1 + 0. 2 0. 6 1/ 3 1 + 0. 2 0. 5 2/ 5 2 + / + 0. 2 0. 4 1/ 2 1 + 0. 3 0. 5 3/ 5 4 + / + / + / + 0. 4 0. 5 4/ 5 4 + / + / + / + 0. 5 0. 5 1 2 - / - 注 :抗凝效果样品在低温(4 ℃) 下放置 15 d 以上“, + ”代表凝固“, - ”代表不凝固。 图 1 盐酸环丙沙星的色谱行为 Fig. 1 Liquid chromatogram of ciprofloxacinum A. 标准盐酸环丙沙星;B . 雄蟹空白血浆; C. 加入标准盐酸环丙沙星后的雄蟹血浆; D. 给药 1h 后的雄蟹血浆样品; E. 雌蟹空白血浆; F. 给药 48h 后的雌蟹血浆样品;1 所指示的色谱峰为盐酸环丙沙星峰 图 2 盐酸环丙沙星标准曲线 Fig. 2 The standard curve of ciprofloxacinum 2. 4 回收率 分别对雌、雄蟹空白血淋巴中 5 种不同浓度的 盐酸环丙沙星回收率测定结果表明 , 其范围在 88. 71 %～105. 76 %和 97. 37 %～105. 45 %间;平均回 收率为 99. 11 ±8. 20 %和 100. 08 ±3. 43 % (表 2 ,表 3) 。 2. 5 精密度 浓度为 1011. 33μg·mL - 1与 101. 5μg·mL - 1的盐 酸环丙沙星标准溶液的提取精密度(重复性) 测定结 果表明 ,其变异系数(RSD) 分别为 1. 55 %与 1. 54 % , 4 期 杨先乐等 :中华绒螯蟹血淋巴内盐酸环丙沙星的反相高效液相色谱法的建立 153 © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
352 平均为1.55+0.01%(表4)。 表2中华绒螯蟹雌蟹血淋巴中盐酸环丙沙星回收率的测定结果 Tab. 2 The recovery of ciprofloxacin um in the hemolymph of female Eriocheir sinensi 项目 标准盐酸环丙沙星溶液(1015m·加入量) 样品实际浓度(吗gml) 24.67 36.55 样品实测浓度(m·) 6.68 13.21 回收率(%) 88.71 91.81 105.76 105.67 103.58 平均回收率(% 99.11+8.20 表3中华绒螯蟹雄蟹血淋巴中盐酸环丙沙星回收率的测定结果 Tab. 3 The recovery of ciprofloxacinum in the hemolymph of male Eriocheir sinensis 项目 标准盐酸环丙沙星溶液(1015m加入量(叫) 样品实际浓度(gmnL) l.01 2.48 样品实测浓度吗gmL) 回收率(%) 97.37 101.60 105.45 平均回收率(%) 100.08±3.4 表4对中华绒螯蟹血淋巴中盐酸环丙沙星测定的提取精密度(重复性) in the hemolymph of Eriocheir sinensis 标准盐酸环丙沙星溶液(m 加入量(叽 次实测浓度啤gmL 25.82/25.6326.24/25.2/26.09 2.58/2.6212.632.53/2.61 平均实测浓度吗mL 25.80±0.40 2.59±0 F均RSD(%) 表5是3种不同浓度的标准盐酸环丙沙星的日间精密度测定结果。由表5可知,RSD最低为 0.21%,最高为2.04%,平均为1.19±0.92% 表5标准盐酸环丙沙星溶液测定的日间精密度 lab. 5 The inter day precision of standard ciproflxacinum 标准盐酸环丙沙星溶液浓度 平均RSD (ug mL) 均数±准差 (%) 2.030 2182.5±44.55 4346.5±57.28 1.19±0.92 1l224/l1L 112075+23.33 2.6注射给药后中华绒螯蟹雄蟹血淋巴内盐酸环丙沙星的代谢规律 应用上述所建立的 RP HPLC法,对肌肉注射盐酸环丙沙星的中华绒螯蟹雄蟹的血药浓度进行两次 平行测定,药时曲线如图3。结果表明,2h内,血药浓度迅速下降,由开始时的37.13±0.18吗gmnL降 至0.167h(10min)的20.27±0.59吗gmL1,1h的15.16±0.78吗gmL1以及2h的11.66±0.09 吗gm,2h至24h,血药浓度缓慢下降,维持在10吗gmnL左右;48h后,血药浓度降到5.96±0.18 c1994-2007ChinaAcademicJourmalElectroniePublishingHouseAllrightsreservedhttp://nnv.cnki.ner
平均为 1. 55 ±0. 01 % (表 4) 。 表 2 中华绒螯蟹雌蟹血淋巴中盐酸环丙沙星回收率的测定结果 Tab. 2 The recovery of ciprofloxacinum in the hemolymph of female Eriocheir sinensis 项目 标准盐酸环丙沙星溶液(101. 5μg·mL - 1) 加入量(μL) 15 20 25 50 75 样品实际浓度(μg·mL - 1) 7. 53 10. 01 12. 49 24. 67 36. 55 样品实测浓度(μg·mL - 1) 6. 68 9. 19 13. 21 26. 07 37. 86 回收率( %) 88. 71 91. 81 105. 76 105. 67 103. 58 平均回收率( %) 99. 11 ±8. 20 表 3 中华绒螯蟹雄蟹血淋巴中盐酸环丙沙星回收率的测定结果 Tab. 3 The recovery of ciprofloxacinum in the hemolymph of male Eriocheir sinensis 项目 标准盐酸环丙沙星溶液(101. 5μg·mL - 1) 加入量(μL) 15 20 25 50 75 样品实际浓度(μg·mL - 1) 0. 76 1. 01 1. 25 2. 48 3. 67 样品实测浓度(μg·mL - 1) 0. 74 0. 99 1. 27 2. 43 3. 87 回收率( %) 97. 37 98. 02 101. 60 97. 98 105. 45 平均回收率( %) 100. 08 ±3. 43 表 4 对中华绒螯蟹血淋巴中盐酸环丙沙星测定的提取精密度( 重复性) Tab. 4 The extracted2precision ( or repeatability) of ciprofloxacinum in the hemolymph of Eriocheir sinensis 项 目 标准盐酸环丙沙星溶液(μg·mL - 1) 1011. 33 101. 5 加入量(μL) 50 50 各次实测浓度(μg·mL - 1) 25. 82/ 25. 63/ 26. 24/ 25. 22/ 26. 09 2. 58/ 2. 62/ 2. 63/ 2. 53/ 2. 61 平均实测浓度(μg·mL - 1) 25. 80 ±0. 40 2. 59 ±0. 04 RSD ( %) 1. 55 1. 54 平均 RSD ( %) 1. 55 ±0. 01 表 5 是 3 种不同浓度的标准盐酸环丙沙星的日间精密度测定结果。由表 5 可知 , RSD 最低为 0. 21 % ,最高为 2. 04 % ,平均为 1. 19 ±0. 92 %。 表 5 标准盐酸环丙沙星溶液测定的日间精密度 Tab. 5 The inter2day precision of standard ciproflxacinum 标准盐酸环丙沙星溶液浓度 (μg·mL - 1) 峰 面 积 日间各次实测值 平均数 ±标准差 RSD ( %) 平均 RSD ( %) 2. 030 2214/ 2151 2182. 5 ±44. 55 2. 04 4. 060 4306/ 4387 4346. 5 ±57. 28 1. 32 1. 19 ±0. 92 10. 15 11224/ 11191 11207. 5 ±23. 33 0. 21 2. 6 注射给药后中华绒螯蟹雄蟹血淋巴内盐酸环丙沙星的代谢规律 应用上述所建立的 RP2HPLC 法 ,对肌肉注射盐酸环丙沙星的中华绒螯蟹雄蟹的血药浓度进行两次 平行测定 ,药2时曲线如图 3。结果表明 ,2h 内 ,血药浓度迅速下降 ,由开始时的 37. 13 ±0. 18μg·mL - 1降 至 0. 167h (10min) 的 20. 27 ±0. 59μg·mL - 1 , 1 h 的 15. 16 ±0. 78μg·mL - 1以及 2h 的 11. 66 ±0. 09 μg·mL - 1 ;2h 至 24h ,血药浓度缓慢下降 ,维持在 10μg·mL - 1左右; 48h 后 , 血药浓度降到 5. 96 ±0. 18 μg·mL - 1。 253 水 产 学 报 25 卷 © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
杨先乐等:中华绒螯蟹血淋巴内盐酸环丙沙星的反相高效液相色谱法的建立 353 40 I组实測值 ll组实测值 IⅡ!组平均值 赵 给药后时间/h 图3肌肉注射盐酸环丙沙星后的药时曲线 Fig 3 The Concentration Time curve of ciprofloxacinum after intramuscular administration 3讨论 中华绒螯蟹属甲壳动物,循环系统为开放式,主要成分为血淋巴,它和鱼类有较大的区别。关于中 华绒螯蟹血淋巴内药物检测方法的研究,至今尚无报道。动物体内药物浓度的检测方法有酶免疫法、薄 层色谱、液相色谱、质谱和光谱等,而以 RPHPLC法较为常用,因为它具有灵敏度高、回收率高、精密度 高及重现性好等特点,该法也常用于水产动物体内药物浓度的检测上6317。对于甲壳动物中华绒螯 蟹,是否亦能用该法检测其血淋巴内的药物含量,使用该法的具体条件是什么,这是本文所要解决的关 键问题。本文的结果对此作出了肯定的回答 (1)中华绒螯蟹的血淋巴与鱼类的血浆有较大的区别,本试验成功地摸索出了从中华绒螯蟹抽取血 淋巴的方法,并筛选了合适的抗凝剂以及确定了抗凝剂的用量,为制备标准的分析样品奠定了基础。试 验证明,ACD的抗凝作用最好,而且当其与血淋巴等量混合后,可取得较持久的抗凝效果;此种方法,完 全可满足样品分析的要求。 (2)在试验所摸索的条件下,血淋巴内盐酸环丙沙星的色谱行为不仅基线走动平稳保持时间较长 且无干扰峰,这就为药峰峰面积的测定提供了可能。在标准品盐酸环丙沙星浓度范围为1~10 吗gmL时,标准曲线的相关系数r=0.9985,具有极好的相关性,由此表明了该方法为试验样品的准确 定量提供了保障 (3)回收率提示着检测方法的准确性。用HC法,陈会波等测定鳗康素的回收率为95.32 o19 Uno等测定虹鳟和五条蛳血浆中的磺胺间甲氧嘧啶(SMM)及其代谢物( AC-SMM)的回收率分别为 96.6%和93.9%98.0%和950%;用 RP HPLO法陈文银和管国华6测定诺氟沙星在中华鳖血浆中 的平均回收率为98.9%;而我们对雌、雄蟹空白血淋巴中5组不同加入量的标准盐酸环丙沙星检测的回 收率范围分别为8871%~10576%和9737%105.45%,平均为99.11±8.20%和100.08±3.43%, 表明该法具有较高的准确性 (4)精密度是测定方法可靠性的保证。张祚新等测定鲤鱼体内诺氟沙星的日内和日间精密度分 别为472%和4.98%;Pak等测定对虾体内的SDM和OMP( Ormemthoprim)在血淋巴中的含量时的精 密度范围为0.05~50吗gmL12l而本试验的结果表明,日内精密度(或提取精密度)无论是在较高浓 度还是较低浓度样品均在1.54%~1.55%间,日间精密度为1.19±0.92%。由此可以看出,本测定方法 具有较高的可靠性。 应用所建立的方法,我们检测了肌注给药后48h内各时间点的中华绒螯蟹雄蟹血淋巴内的盐酸环 o1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. hp: //nwwr cnkiner
图 3 肌肉注射盐酸环丙沙星后的药2时曲线 Fig. 3 The Concentration2Time curve of ciprofloxacinum after intramuscular administration 3 讨论 中华绒螯蟹属甲壳动物 ,循环系统为开放式 ,主要成分为血淋巴 ,它和鱼类有较大的区别。关于中 华绒螯蟹血淋巴内药物检测方法的研究 ,至今尚无报道。动物体内药物浓度的检测方法有酶免疫法、薄 层色谱、液相色谱、质谱和光谱等 ,而以 RP2HPLC 法较为常用 ,因为它具有灵敏度高、回收率高、精密度 高及重现性好等特点 ,该法也常用于水产动物体内药物浓度的检测上[6 ,8 - 17 ] 。对于甲壳动物中华绒螯 蟹 ,是否亦能用该法检测其血淋巴内的药物含量 ,使用该法的具体条件是什么 ,这是本文所要解决的关 键问题。本文的结果对此作出了肯定的回答 : (1) 中华绒螯蟹的血淋巴与鱼类的血浆有较大的区别 ,本试验成功地摸索出了从中华绒螯蟹抽取血 淋巴的方法 ,并筛选了合适的抗凝剂以及确定了抗凝剂的用量 ,为制备标准的分析样品奠定了基础。试 验证明 ,ACD 的抗凝作用最好 ,而且当其与血淋巴等量混合后 ,可取得较持久的抗凝效果;此种方法 ,完 全可满足样品分析的要求。 (2) 在试验所摸索的条件下 ,血淋巴内盐酸环丙沙星的色谱行为不仅基线走动平稳 ,保持时间较长 , 且无干扰峰 , 这就为药峰峰面积的测定提供了可能。在标准品盐酸环丙沙星浓度范围为 1～10 μg·mL - 1时 ,标准曲线的相关系数 r = 0. 9985 ,具有极好的相关性 ,由此表明了该方法为试验样品的准确 定量提供了保障。 (3) 回收率提示着检测方法的准确性。用 HPLC 法 ,陈会波等测定鳗康素的回收率为 95. 32 % [19] , Uno 等[20 ]测定虹鳟和五条 血浆中的磺胺间甲氧嘧啶 (SMM) 及其代谢物 (AC2SMM) 的回收率分别为 96. 6 %和 93. 9 %、98. 0 %和 95. 0 % ;用 RP2HPLC 法 ,陈文银和管国华[16 ]测定诺氟沙星在中华鳖血浆中 的平均回收率为 98. 9 % ;而我们对雌、雄蟹空白血淋巴中 5 组不同加入量的标准盐酸环丙沙星检测的回 收率范围分别为 88. 71 %～105. 76 %和 97. 37 %～105. 45 % ,平均为 99. 11 ±8. 20 %和 100. 08 ±3. 43 % , 表明该法具有较高的准确性。 (4) 精密度是测定方法可靠性的保证。张祚新等[18 ]测定鲤鱼体内诺氟沙星的日内和日间精密度分 别为 4. 72 %和 4. 98 % ; Park 等测定对虾体内的 SDM 和 OMP (Ormemthoprim) 在血淋巴中的含量时的精 密度范围为 0. 05～50μg·mL - 1[21 ] 。而本试验的结果表明 ,日内精密度(或提取精密度) 无论是在较高浓 度还是较低浓度样品均在 1. 54 %～1. 55 %间 ,日间精密度为 1. 19 ±0. 92 %。由此可以看出 ,本测定方法 具有较高的可靠性。 应用所建立的方法 ,我们检测了肌注给药后 48h 内各时间点的中华绒螯蟹雄蟹血淋巴内的盐酸环 4 期 杨先乐等 :中华绒螯蟹血淋巴内盐酸环丙沙星的反相高效液相色谱法的建立 353 © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
丙沙星的浓度,结果基本表现出该药在其体内的代谢规律。由图3可以看出,给药后48h内,血药浓度 均在5gmL以上,预示着该药在中华绒螯蟹体内有很好的治疗疾病的前景。这说明,RPHC测定 法可完全用于中华绒螯蟹血淋巴内盐酸环丙沙星浓度的检测,由此可探讨中华绒螯蟹对环丙沙星的体 内代谢状况,相关研究,我们将另有报道 致谢:在检测样品的过程中,上海大学生命科学学院的雍克岚教授给予了悉心指导,98级研究生陈旭同学提供了很 多帮助,谨此致谢 参考文献 竺心影药理学(第三版)M1.北京:人民卫生出版社.1995.307-311 2]杨坚,渔药手册M]北京:中国科学技术出版社199179-180. 3]李太武,丁明进,宋协民,等,皱纹盘鲍脓胞病病原菌—河流弧菌Ⅲ的抗药机制的初步研究门].海洋与湖沼,19%,27(6):637- 4]林天然,余乃凤甲鱼急性肠胃炎鳃腺炎并发症的综合治疗U]内陆水产,1997,7:25 [5]孟庆显,余开康.鱼虾蟹贝疾病诊治和防治M]北京:中国农业出版社.199.255-28 [6] Nouws J F M, Crondel J L, Schutte A R, et al. Pharmacokinetics of ciprofloxacin in carp, African catfish and rainbow trou[J]. Vet Quart 1988,10:179-180. [7] Snieszko S F, Friddle SO, Griffin, Successful treatment of ulcer disease in book trout( Saluelimzs fontinalis)with terramycin[J]. Science 1951,113:179-182 [8] Bruno D W, An investigation into oxytetracycline residues in Atlantic salmon, Salmo. salarL[J]. J Fish Dis, 1989, 12: 77-86 [9] Harry B, Gorran B. Temprature-related absorption and excretion of oxytetracycline in rainbow trout( Salmo gairdneri L)[]. Aquae, 1990, 84 (3/4):363372 0]李美同,郭文林,仲锋,等.土霉素在鳗鲡组织中残留的消除规律U],.水产学报,1997,21(1):39-42. oral administration to rainbow trout Salmo gairdner) exposed to low water temperatures [J]. Aquac, 1990, 84(3/4): 355 [ 12] Boon J H, Nouws J M F, Vander Heiden M T, et al. Disposition of flumequine in plasma of European eel (Anguilla anguilla) after a single [ 13] Hustredt S O, Salte R. Distribution and elimination of oxolinic acid in rainbow trout Oncowlynchs mykiss Walbaum) after a single rapid [14] Kleinow K M, Jarboe HH, Shoemaker K E, et al. Comparative phamocokintics and bioavailability of oxolinic acid in channel catfish latalunns punctatus)and rainbow trout Oncorlnchns mykiss)[J]. Can J Fish Aquat Sci, 1994, 51: 1205-1211 5]李兰生,王勇强.对虾体内氯霉素含量测定方法的研究卩].青岛海洋大学学报,1995,25(3):400-406 16]陈文银,管国华.甲鱼血液中诺氟沙星浓度的反相高效液相色谱测定法[.上海水产大学学报,1997,6(4):301·303 7]蔡武城,李碧羽,李玉民,生化实验技术教程[M].上海:复旦大学出版社.1983:47 18]张祚新,张雅斌,杨勇胜,等诺氟沙星在鲤鱼体内的药代动力学UJ].中国兽医学报,200,20(1):66-69 1]陈会波,翁燕珍,郭少忠,等.鳗康素的药代动力学研究[A].鱼病学研究论文集(二)[C1.北京:海洋出版社,1995.143-147 [20] Uno K, Aoki T, Ueno R, et al. Pharmacokinetics and metabolism of sulphamonomethoxine in rainbow trout( Oncorhynchus mykiss)and (i/ yellowtail( Seriola quingeradiara) following bolus intra vascular adminstration[J]. Aquac, 1997, 153(1-2): 1-8 Park E D, Lightner D V, Milner N, et al. Explorat ory bioavailability and pharmacokinetic studies of sulphadimethoxine and ormetoprim in the penaeid shrimp, Penaeus annamei[J]. Aquac, 1995, 130: 113-128 o1994-2007 China Academic oumal Electronic Publishing House. All rights reserved. htp: //wr cnki, ner
丙沙星的浓度 ,结果基本表现出该药在其体内的代谢规律。由图 3 可以看出 ,给药后 48h 内 ,血药浓度 均在 5μg·mL - 1以上 ,预示着该药在中华绒螯蟹体内有很好的治疗疾病的前景。这说明 , RP2HPLC 测定 法可完全用于中华绒螯蟹血淋巴内盐酸环丙沙星浓度的检测 ,由此可探讨中华绒螯蟹对环丙沙星的体 内代谢状况 ,相关研究 ,我们将另有报道。 致谢 :在检测样品的过程中 ,上海大学生命科学学院的雍克岚教授给予了悉心指导 ,98 级研究生陈旭同学提供了很 多帮助 ,谨此致谢。 参考文献 : [1 ] 竺心影. 药理学(第三版) [ M ] . 北京 :人民卫生出版社. 1995. 307 - 311. [2 ] 杨 坚 ,渔药手册[ M ] . 北京 :中国科学技术出版社. 1998. 179 - 180. [3 ] 李太武 ,丁明进 ,宋协民 ,等. 皱纹盘鲍脓胞病病原菌 ———河流弧菌2Ⅱ的抗药机制的初步研究[J ] . 海洋与湖沼 ,1996 ,27 (6) :637 - 645. [4 ] 林天然 ,余乃凤. 甲鱼急性肠胃炎鳃腺炎并发症的综合治疗[J ] . 内陆水产 ,1997 ,7 :25. [5 ] 孟庆显 ,余开康. 鱼虾蟹贝疾病诊治和防治[ M ] . 北京 :中国农业出版社. 1996. 255 - 281. [ 6 ] Nouws J F M , Crondel J L , Schutte A R , et al . Pharmacokinetics of ciprofloxacin in carp ,African catfish and rainbow trout [J ] . Vet Quart , 1988 , 10 :179 - 180. [7 ] Snieszko S F , Friddle S O , Gniffin. Successful treatment of ulcer disease in book trout ( Saluelinus fontinalis) with terramycin[J ] . Science , 1951 , 113 :179 - 182. [8 ] Bruno D W. An investigation into oxytetracycline residues in Atlantic salmon , Salmo. salar L [J ] . J Fish Dis , 1989 , 12 :77 - 86. [ 9] Harry B , Gorran B . Temprature2related absorption and excretion of oxytetracycline in rainbow trout ( Salmo gairdneri L) [J ] . Aquac , 1990 , 84 (3/ 4) : 363 - 372. [10] 李美同 ,郭文林 ,仲 锋 ,等. 土霉素在鳗鲡组织中残留的消除规律[J ] . 水产学报 ,1997 ,21 (1) : 39 - 42. [11] Sohlberg S , Czerwinska K , Rasmussen K, et al . Plasma concentrations of flumequine after intraarterial and oral administration to rainbow trout ( Salmo gairdneri) exposed to low water temperatures[J ] . Aquac , 1990 , 84 (3/ 4) :355 - 361. [ 12] Boon J H , Nouws J M F , Vander Heiden M H T , et al . Disposition of flumequine in plasma of European eel ( Anguilla anguilla) after a single intra2muscular injection[J ] . Aquac , 1991 , 99 (3/ 4) : 213 - 223. [13] Hustredt S O , Salte R. Distribution and elimination of oxolinic acid in rainbow trout ( Oncorhynchs mykiss Walbaum) after a single rapid intravascular injection[J ] . Aquac , 1991 , 192 : 297 - 303. [14] Kleinow K M , Jarboe H H , Shoemaker K E , et al . Comparative phamocokintics and bio2availability of oxolinic acid in channel catfish ( Ictalurus punctatus) and rainbow trout ( Oncorhynchus mykiss) [J ] . Can J Fish Aquat Sci , 1994 , 51 :1205 - 1211. [15] 李兰生 ,王勇强. 对虾体内氯霉素含量测定方法的研究[J ] . 青岛海洋大学学报 ,1995 ,25(3) : 400 - 406. [16] 陈文银 ,管国华. 甲鱼血液中诺氟沙星浓度的反相高效液相色谱测定法[J ] . 上海水产大学学报 , 1997 ,6(4) : 301 - 303. [17] 蔡武城 ,李碧羽 ,李玉民. 生化实验技术教程[ M ] . 上海 :复旦大学出版社. 1983 : 47. [18] 张祚新 ,张雅斌 ,杨勇胜 ,等. 诺氟沙星在鲤鱼体内的药代动力学[J ] . 中国兽医学报 ,2000 ,20(1) : 66 - 69. [19] 陈会波 ,翁燕珍 ,郭少忠 ,等. 鳗康素的药代动力学研究[ A ] . 鱼病学研究论文集(二) [ C ] . 北京 : 海洋出版社 , 1995. 143 - 147. [20] Uno K, Aoki T , Ueno R , et al . Pharmacokinetics and metabolism of sulphamonomethoxine in rainbow trout ( Oncorhynchus mykiss) and yellowtail ( Seriola quinqueradiara) following bolus intra2vascular adminstration[J ] . Aquac ,1997 ,153(1 - 2) :1 - 8. [ 21] Park E D , Lightner D V , Milner N , et al . Exploratory bioavailability and pharmoacokinetic studies of sulphadimethoxine and ormetoprim in the penaeid shrimp , Penaeus annamei[J ] . Aquac , 1995 ,130 :113 - 128. 453 水 产 学 报 25 卷 © 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net