74中国兽医杂志2070年(第43卷)第1期 Chinese Journal of v eterinary M edin 鱼肉中氟喹诺酮类药物多残留检测方法的建立 及恩诺沙星在鲫鱼体内残留消除规律的研究 刘慧慧',饶钦雄,刘向明,李海燕!,沈建忠12,江海洋2,丁双阳2 (1中国农业大学动物医学院,北京海淀100094,2国家兽药残留基准实验室,北京海淀100094 中图分类号:S85984文献标识码B文章编号:0529-6005(2007)01-0074-03 氟喹诺酮(FQs)是第三代喹诺酮类药物,目前在成为人们关注的焦点。目前,对该类药物的检测手段 兽医及人医临床应用广泛,对水产鱼类的消化道及鳃较多,有微生物抑制实验MM)、免疫方法、薄层色 细菌性疾病也有良好的防治作用。近些年,由于该类谱(ILC)、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳 药物的广泛使用,有关其耐药性的报道越来越多,对法1、气质联用法(GCMS)、液质联用法①LCMS、 FQs耐药的沙门氏菌和弯曲杆菌所引发的人类食源 LCMSMS)、酶联免疫分析方法等,其中高效 性疾病也大多被证实与食用动物中使用FQs有关,液相色谱方法是最常用的方法之一。作者对这些方法 该类药物在动物性食品中的残留问题已经 进行改进与优化,建立了鱼肌肉组织中环丙沙星、恩 诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星的高效液相色谱检测方 收稿日期2006-10-16 法。该方法具有灵敏度高、准确、简便、快捷、节约等优 作者简介刘慧慧(1981-),女,助理兽医师硕士生,主要从事兽适用于水产品中该四种药物的检测 医药理学与毒理学研究, Em ail: Iiuhh615163cm 通讯作者:丁双阳, Emei D ings@ cau edu cn 通过该系统收集、分析、发布动物健康、管理及生产状知识是治疗效果的重要决定因素,对临床上的治疗知 况等方面的数据,并研究家畜的健康及健康管理方识进行分析、整理,建立治疗知识模型对于提高临床 法。英国、澳大利亚 (NAHSS,2006)等国都建立了国治疗的水平具有重要的意义 家级的动物疫病监测系统( natpnalanmal health23预防决策知识目前,预防是养殖业能够健康 Surveillance System),还有基于网络的人动物疾病发展的重要保证,预防要从疾病的病原、病因流行病 监测系统( Collins,2005) MM ich igan,2005),从而将动学等多个角度着手,在临床上,兽医往往根据以往疾病 物健康监测计划与调査活动整合在一起,系统地收集的流行、发生情况可以制定相应的预防措施,可能分别 动物的健康数据,对数据进行整理、分析,及时传播动从饲料饲养管理、环境、动物个体免疫等多个角度进 物健康信息。 行有计划的防范,预防知识是建立一个预防方案的主 2微观决策知识体系 要依据和动力,若建立一个有效的预防机制有必要对 微观决策主要指养殖场、兽医站及相关兽医检验建立一个完整的预防知识体系,以规范临床预防体系, 检疫部门等基层单位在临床实践,这些基层单位是兽并为预防方法的更新、完善奠定基础 医实践的主体,正是由大量的微观主体才能构成宏观 微观层面的知识在临床上有着广泛的应用,目前最 上的兽医卫生体系。对于基层单位而言,主要涉及临流行的是临床决策支持系统CDSS),如 NTERN IST 床的诊疗、预防及配合宏观上的对疫病的控制。其知 IMYCN、 ON COCN等0 Miller ra,1982)(EH 识也是按这几方面进行划分的。 Shortliffe,1976)( Shortliffe,1988),CDSS是一种使 21诊断知识对于兽医临床而言,诊断是疾病发用2条以上的病畜的疾病数据提出诊疗建议的一种活的 生后的首先要完成的任务,在诊断过程中需要大量的知识系统 W yatt J, Sp iege Halter D,1991)。CDSS主 知识,只有依靠知识才能得到准确的诊断结果。目前要有4个作用( PerreauLt L,1999):(1)临床资料管理, 已经建立了很多用于临床的基于知识的诊断系统,如主要包括临床文档编码的维护,实践规程的授权,推介 动物疾病诊断专家系统。 等(2)病畜管理,病例预约,对病畜的全程跟踪病历管 22治疗决策知识对于不同的病例,由于动物个理,预防性护理等。(3)诊费控制,通过对病患临床诊疗 体差异、疾病程度不同等,应采取合理的治疗方法,在过程的管理,避免诊疗重复,防止不必要的浪费。(4)决 临床治疗决策过程中,需要综合利用已有的知识制定策支持,临床诊断、治疗及预防决策支持,以便提供最佳 最佳的治疗方案,即需要把握好治疗原则,选择恰当的临床服务,根据不同病例使用不同的诊疗方法,对病 的治疗方法,又要了解药物的特性。兽医拥有的治疗畜进行全群管理等。 S1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHousealLrightsreservedhttp://www.cnki.net
鱼肉中氟喹诺酮类药物多残留检测方法的建立 及恩诺沙星在鲫鱼体内残留消除规律的研究 刘慧慧1 , 饶钦雄1 , 刘向明1 , 李海燕1 , 沈建忠1, 2 , 江海洋1, 2 , 丁双阳1, 2 (1. 中国农业大学动物医学院, 北京 海淀 100094; 2. 国家兽药残留基准实验室, 北京 海淀 100094) 中图分类号: S859. 84 文献标识码:B 文章编号: 052926005 (2007) 0120074203 氟喹诺酮(FQ s) 是第三代喹诺酮类药物, 目前在 兽医及人医临床应用广泛, 对水产鱼类的消化道及鳃 细菌性疾病也有良好的防治作用。近些年, 由于该类 药物的广泛使用, 有关其耐药性的报道越来越多, 对 FQ s 耐药的沙门氏菌和弯曲杆菌所引发的人类食源 性疾病也大多被证实与食用动物中使用FQ s 有关[ 1 ] , 该类药物在动物性食品中的残留问题已经 收稿日期: 2006210216 作者简介: 刘慧慧(19812) , 女, 助理兽医师, 硕士生, 主要从事兽 医药理学与毒理学研究, E2m ail: liuhh615@ 163. com 通讯作者: 丁双阳, E2m ail: D ingsy@cau. edu. cn 成为人们关注的焦点。目前, 对该类药物的检测手段 较多, 有微生物抑制实验(M IA ) [ 2 ]、免疫方法、薄层色 谱(TL C) [ 3 ]、高效液相色谱法(H PL C) [ 4 ]、毛细管电泳 法[ 5 ]、气质联用法 (GCöM S)、液质联用法 (L CöM S、 L CöM SöM S) [ 6 ]、酶联免疫分析方法[ 7 ]等, 其中高效 液相色谱方法是最常用的方法之一。作者对这些方法 进行改进与优化, 建立了鱼肌肉组织中环丙沙星、恩 诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星的高效液相色谱检测方 法。该方法具有灵敏度高、准确、简便、快捷、节约等优 点, 适用于水产品中该四种药物的检测。 通过该系统收集、分析、发布动物健康、管理及生产状 况等方面的数据, 并研究家畜的健康及健康管理方 法。英国、澳大利亚(NA H SS, 2006) 等国都建立了国 家级的动物疫病监测系统 (N ational A n im al H ealth Su rveillance System ) , 还有基于网络的人2动物疾病 监测系统(Co llin s, 2005) (M ich igan, 2005) , 从而将动 物健康监测计划与调查活动整合在一起, 系统地收集 动物的健康数据, 对数据进行整理、分析, 及时传播动 物健康信息。 2 微观决策知识体系 微观决策主要指养殖场、兽医站及相关兽医检验 检疫部门等基层单位在临床实践, 这些基层单位是兽 医实践的主体, 正是由大量的微观主体才能构成宏观 上的兽医卫生体系。对于基层单位而言, 主要涉及临 床的诊疗、预防及配合宏观上的对疫病的控制。其知 识也是按这几方面进行划分的。 2. 1 诊断知识 对于兽医临床而言, 诊断是疾病发 生后的首先要完成的任务, 在诊断过程中需要大量的 知识, 只有依靠知识才能得到准确的诊断结果。目前 已经建立了很多用于临床的基于知识的诊断系统, 如 动物疾病诊断专家系统。 2. 2 治疗决策知识 对于不同的病例, 由于动物个 体差异、疾病程度不同等, 应采取合理的治疗方法, 在 临床治疗决策过程中, 需要综合利用已有的知识制定 最佳的治疗方案, 即需要把握好治疗原则, 选择恰当 的治疗方法, 又要了解药物的特性。兽医拥有的治疗 知识是治疗效果的重要决定因素, 对临床上的治疗知 识进行分析、整理, 建立治疗知识模型对于提高临床 治疗的水平具有重要的意义。 2. 3 预防决策知识 目前, 预防是养殖业能够健康 发展的重要保证, 预防要从疾病的病原、病因、流行病 学等多个角度着手, 在临床上, 兽医往往根据以往疾病 的流行、发生情况可以制定相应的预防措施, 可能分别 从饲料、饲养管理、环境、动物个体免疫等多个角度进 行有计划的防范, 预防知识是建立一个预防方案的主 要依据和动力, 若建立一个有效的预防机制, 有必要对 建立一个完整的预防知识体系, 以规范临床预防体系, 并为预防方法的更新、完善奠定基础。 微观层面的知识在临床上有着广泛的应用, 目前最 流行的是临床决策支持系统(CD SS) , 如 IN T ERN IST I、M YC IN、ON COC IN 等(M iller RA , 1982) (E. H. Sho rtliffe, 1976) (Sho rtliffe, 1988) , CD SS 是一种使 用2 条以上的病畜的疾病数据提出诊疗建议的一种活的 知识系统(W yatt J, Sp iegelhalter D , 1991)。CD SS 主 要有4 个作用(Perreau lt L , 1999): (1) 临床资料管理, 主要包括临床文档、编码的维护, 实践规程的授权, 推介 等。(2) 病畜管理, 病例预约, 对病畜的全程跟踪、病历管 理, 预防性护理等。 (3) 诊费控制, 通过对病患临床诊疗 过程的管理, 避免诊疗重复, 防止不必要的浪费。 (4) 决 策支持, 临床诊断、治疗及预防决策支持, 以便提供最佳 的临床服务, 根据不同病例使用不同的诊疗方法, 对病 畜进行全群管理等。 47 中国兽医杂志 2007 年(第43 卷) 第1 期 Ch inese Journal of V eterinary M edicine
Chinese Journal of veterinary M ed icine 中国兽医杂志200年(第43卷)第1期75 1材料与方法 家兽药安全评价中心实验动物房,试验前驯化2周 l1 Waters600型高效液相色谱仪, Waters717自每日投喂空白颗粒饵料,水温20±Q5℃ 动进样器, Waters2475型荧光检测器, m pow er色182给药方法和剂量盐酸恩诺沙星,含量98% 谱工作站,旋涡混合器,隔膜真空泵;超纯水仪:Mi其中恩诺沙星含量为92%。将药物配制成浓度为4 Q(美国);振荡器,SPE柱: Bond elut3c,20omg, mg//mI的水溶液,按5mg/kg体重剂量灌胃给药,每 Cl8(迪马公司);高速冷冻离心机 B iofuge strato s天1次连续5天,将不回吐的实验鱼用于试验。 Heraeus,德国);实验室pH计:PHSJ-4 183组织样品的采集与测定最后1次给药后第 12喹诺酮药物对照品恩诺沙星( Enrofloxa-cin)、3、6、12、24、48、%6、68、240、480、720、1416、2136h 环丙沙星( C rofloxacin)、沙拉沙星 Saraflo- xacin),采集样品,每一时间点取4尾鱼,冷冻处死后,去皮 含量≥996%(中国兽医药品监察所);双氟沙星剔骨、匀浆,处理后的肌肉组织置于-20℃冷冻保存。 ( D ofloxacin),含量为984%( S igm a ca,美国);甲样品经处理后用HPLC检测。 醇、乙腈为色谱纯磷酸二氢钾、氢氧化钠柠檬酸、乙2结果 酸铵(分析纯) 21标准曲线FQs4种药物在上述色谱条件下得 13色谱分析条件流动枏Q05mol柠檬酸+Q1到良好的分离,见图1(A)。环丙沙星、恩诺沙星、沙拉 mol乙酸铵乙腈(体积比为80:20);流速:1m1沙星、双氟沙星的标准曲线回归方程分别为Y=734 min;色谱柱: InertsilODS-3(5m,46mm×250×103x+684×103、Y=767×103X+352×103Y mm);柱温:20℃;荧光检测波长Aex=280,λm= 236×103X+303×103Y=236×10xX+303 450,进样量:20lb ×103,相关系数(R2)均为Q999,线性范围均为Q1 14标准曲线绘制取适量混合标准储备液,用流~1000nghL 动相逐级稀释为1000ng/nl,500ngh1,200ng m1, 100 ng/m 1, 50 ng/ml, 10 ng/n 1, 2 ng/n L0 1 ng/nl,8个浓度,按照上述色谱条件进样,以各药物 峰面积Y对药物浓度ⅹ(ng/D进行线性回归分析。 5组织样品前处理准确称取20g组织,置于50 ⊙0.80 m1聚丙烯具塞离心管中。加入15ml提取液,涡动1 min,振荡10min,离心10mn(15000r/hmin,18℃)。 上清液转移至另一50ml离心管中,下层沉淀中复加 200400600800100012001400160018002000200 5m1提取液,重复提取1次,合并两次提取液,过SPE 柱。 将SPE柱置于固相萃取真空歧管装置上,用3ml 甲醇3m1提取液平衡柱将上一步骤20m1提取液过 柱,调整真空泵的压力,使流速约1滴/s3m1水淋洗 90 水完全流过SPE柱后,使其继续在真空下干燥3mn; 4ml流动相洗脱,收集洗脱液于5m具塞刻度试管 0.20年 中,涡动混匀。1m1注射器吸取适量洗脱液,经过滤 20040060080010012001400601800a000200 转入液相小瓶,供高效液相色谱分析。 图14种喹诺酮类药物的典型 HPLC-FLD色谱图 16检测限的测定取空白鱼肉样品,设6个平行, A)25nghl混合标准溶液,由左至右依次为 按上述样品前处理方法进行处理,得到空白鱼肉色谱 环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星 图,将信噪比SN=3作为检测限①LOD)。 (B)空白鱼肉组织 17添加回收率与精密度取空白鱼肉20g,添加22检测限取6个空白样品基线噪音值的平均 定体积的混合标准工作液,使组织中药物浓度为5、值,以信噪比为3计,鱼肉中4种药物检测限①OD) 0、100ng/g,涡动1min,静置5mi样品经处理后分别为环丙沙星03ng/g,恩诺沙星10ng/g,沙拉 进行HPC测定,每个浓度每天做3个平行样品,计沙星02ng/g,双氟沙星02ng/g空白样品色谱图 算回收率和日内变异系数,连续测定3天,计算日间见图1(B)。 变异系数 23回收率与精密度4种药物低、中高3个浓度 18鲫鱼肌肉组织中恩诺沙星残留消除规律的研究的样品添加回收率和日内、日间变异系数见表1 181实验动物健康鲫鱼,体重150±10g,由北24鲫鱼肌肉组织中恩诺沙星残留消除规律的研究 京海宁通养殖有限公司提供。饲养于中国农业大学国恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星总量的残留消 S1994-2007ChinaAcademicJOurmalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp://www.cnki.net
1 材料与方法 1. 1 W aters600 型高效液相色谱仪,W aters717 自 动进样器,W aters2475 型荧光检测器, Em pow er 色 谱工作站; 旋涡混合器; 隔膜真空泵; 超纯水仪:M illi2 Q (美国); 振荡器; SPE 柱: Bond E lu t. 3cc, 200m g, C18 (迪马公司); 高速冷冻离心机: B iofuge strato s (H eraeu s, 德国); 实验室pH 计: PH SJ 24A。 1. 2 喹诺酮药物对照品 恩诺沙星(En rofloxa2cin)、 环丙沙星(C ip rofloxacin)、沙拉沙星 Saraflo2xacin) , 含量≥99. 6% (中国兽医药品监察所); 双氟沙星 (D ifloxacin) , 含量为 98. 4% (Sigm a Co. , 美国); 甲 醇、乙腈为色谱纯; 磷酸二氢钾、氢氧化钠、柠檬酸、乙 酸铵(分析纯)。 1. 3 色谱分析条件 流动相: 0. 05 m o l 柠檬酸+ 0. 1 m o l 乙酸铵2乙腈 (体积比为 80∶20); 流速: 1 m lö m in ; 色谱柱: InertsilOD S23 ( 5Λm , 4. 6 mm ×2 5 0 mm ); 柱温: 20℃; 荧光检测波长 Κex = 280, Κem = 450; 进样量: 20 Λl。 1. 4 标准曲线绘制 取适量混合标准储备液, 用流 动相逐级稀释为 1 000 ngöm l, 500 ngöm l, 200 ngö m l, 100 ngöm l, 50 ngöm l, 10 ngöm l, 2 ngöm l, 0. 1 ngöm l, 8 个浓度, 按照上述色谱条件进样, 以各药物 峰面积Y 对药物浓度X (ngöm l) 进行线性回归分析。 1. 5 组织样品前处理 准确称取2. 0 g 组织, 置于50 m l 聚丙烯具塞离心管中。加入15 m l 提取液, 涡动1 m in, 振荡10 m in, 离心10 m in (15 000 röm in, 18℃)。 上 清液转移至另一50 m l 离心管中, 下层沉淀中复加 5 m l 提取液, 重复提取1 次, 合并两次提取液, 过SPE 柱。 将 SPE 柱置于固相萃取真空歧管装置上, 用3 m l 甲醇、3 m l 提取液平衡柱; 将上一步骤20 m l 提取液过 柱, 调整真空泵的压力, 使流速约1 滴ös; 3 m l 水淋洗, 水完全流过SPE 柱后, 使其继续在真空下干燥3 m in; 4 m l 流动相洗脱, 收集洗脱液于 5 m l 具塞刻度试管 中, 涡动混匀。1 m l 注射器吸取适量洗脱液, 经过滤, 转入液相小瓶, 供高效液相色谱分析。 1. 6 检测限的测定 取空白鱼肉样品, 设6 个平行, 按上述样品前处理方法进行处理, 得到空白鱼肉色谱 图, 将信噪比SöN = 3 作为检测限(LOD )。 1. 7 添加回收率与精密度 取空白鱼肉2. 0 g, 添加 一定体积的混合标准工作液, 使组织中药物浓度为5、 20、100 ngög, 涡动1 m in, 静置15 m in。样品经处理后 进行H PL C 测定, 每个浓度每天做 3 个平行样品, 计 算回收率和日内变异系数, 连续测定 3 天, 计算日间 变异系数。 1. 8 鲫鱼肌肉组织中恩诺沙星残留消除规律的研究 1. 8. 1 实验动物 健康鲫鱼, 体重 150±10 g, 由北 京海宁通养殖有限公司提供。饲养于中国农业大学国 家兽药安全评价中心实验动物房, 试验前驯化 2 周, 每日投喂空白颗粒饵料, 水温20±0. 5℃。 1. 8. 2 给药方法和剂量 盐酸恩诺沙星, 含量98% , 其中恩诺沙星含量为 92%。将药物配制成浓度为 4 m göm l 的水溶液, 按5 m gökg 体重剂量灌胃给药, 每 天1 次, 连续5 天, 将不回吐的实验鱼用于试验。 1. 8. 3 组织样品的采集与测定 最后1 次给药后第 3、6、12、24、48、96、168、240、480、720、1416、2136 h 采 集样品, 每一时间点取 4 尾鱼, 冷冻处死后, 去皮、 剔骨、匀浆, 处理后的肌肉组织置于- 20℃冷冻保存。 样品经处理后用H PL C 检测。 2 结果 2. 1 标准曲线 FQ s 4 种药物在上述色谱条件下得 到良好的分离, 见图1 (A )。环丙沙星、恩诺沙星、沙拉 沙星、双氟沙星的标准曲线回归方程分别为Y= 7. 34 ×103X+ 6. 84×103、Y= 7. 67×103X+ 3. 52×103、Y = 2. 36×103X + 3. 03×103、Y= 2. 36×103X + 3. 03 ×103 , 相关系数(R 2 ) 均为 0. 9999, 线性范围均为 0. 1 ～ 1 000 ngöm l。 图1 4 种喹诺酮类药物的典型HPLC-FLD 色谱图 (A ) 2. 5 ngöm l 混合标准溶液, 由左至右依次为: 环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星; (B) 空白鱼肉组织; 2. 2 检测限 取 6 个空白样品基线噪音值的平均 值, 以信噪比为 3 计, 鱼肉中 4 种药物检测限 (LOD ) 分别为: 环丙沙星0. 3 ngög, 恩诺沙星1. 0 ngög, 沙拉 沙星0. 2 ngög, 双氟沙星0. 2 ngög。空白样品色谱图 见图1 (B)。 2. 3 回收率与精密度 4 种药物低、中、高3 个浓度 的样品添加回收率和日内、日间变异系数见表1。 2. 4 鲫鱼肌肉组织中恩诺沙星残留消除规律的研究 恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星总量的残留消 Ch inese Journal of V eterinary M edicine 中国兽医杂志 2007 年(第43 卷) 第1 期 57
76中国兽医杂志207(第43卷)第1期 Chinese Journal of v eterinary M edin 除曲线见图2。 3讨论 本检测方法是在参照国标方法, Zhenling Z 的基础上建立起来的,以pH24磷酸-乙腈(82+18) 为流动相,环丙沙星与恩诺沙星分离较好,但双氟沙 星与沙拉沙星无法完全分离,作者对流动相的pH进 一系列1 行了系统研究pH2432时,药物峰形较好,但双 氟沙星、沙拉沙星两种药物分离不完全,pH>40 时,4种药物分离较好,但峰形较差,只有当pH=4 0,才能兼顾峰形与分离度,采用该流动相体系,药物 0□444 0300600900120015001800 出峰时间对pH依赖性很大,重现性差。按照 Zhen ling Z方法采用Q05mol柠檬酸+ Q I mol乙酸铵-乙腈 图2给药后(5mg/kg体重×天)鲫鱼肌肉 为流动相,无需调节pH,药物分离好,峰形对称且无 组织中环丙沙星与恩诺沙星残留总量的浓度一时间曲线 拖尾现象 表1回收率及变异系数 药物添加浓度(ng/g) 测定浓度(ng/g) 平均回收率(土SD,%)变异系数(n=3,%) 环丙沙星 822±439 533 909±307 8070 7730 790±170 恩诺沙星 455 911±245 69 1828 941±286 8520 8230 沙拉沙星 865±371 867±414 58±195 838±195 233 956±161 采用pH70的磷酸盐缓冲液提取鱼肉中药物,回 }畜牧兽医学报,2003,34(1):88-9 收率不稳定,基线噪音较大将pH调节为74,情况得2 I Choi. Yee A J. Detem ination of fluo roqu no one residues in 到改善。本文将高速(15000r/hmin)离心与低速离心 anmal tissues using Escherichia coli as nd icator organism J J AOAC Int,1999,82(6):1407-1412 (4000r/mn)进行对比,结果发现低速离心时上层提13] Vega M, RDs G analysis of oflxacin flumequine in fish b 取液较浑浊,在净化程序中,可能堵塞固相萃取柱,而 high"perfo m ance thin layer chromagraph [JIJ Planar 且低速离心不足以使组织与提取液完全分离,产生的 Chrom ator, 1995,18: 1473 上层清液量较少,这将直接导致回收率的降低。 m naton of four fluo roqu no lones in catfish, shrimp, and 残留消除试验,给药后3h后,鱼肌肉组织中恩 samon by liqud chrom atography w ith fluo rescence detecton 诺沙星浓度为62mg/g,48h药物浓度降低近1/2, } J AOAC Int,2002,85(6):1293-130 264h药物浓度降至068mg/kg,之后药物代谢非常51 Hernandez M, Borrell e,ca! M. U sing nonaqueous cap 缓慢,720h药物浓度为96ng/g,低于最高残留限量 several qu ino lones in pi kidney samp les[J Electrophoresis, 2002, 23(3): 506-511 100ng/g。活性代谢产物环丙沙星在停药后3h,浓61 Moussa nt B, Bord n G, janosiA, et al Validation of a liquid 度达到Q18mg/kg在停药后1天内维持在较高浓度 chrom atography tandem mass pectrometry method for the 02mg/g),之后缓慢降低,1416h后检测不 n s ine kidney [J] J Chrom atogr A, 2002, 976(1-2): 195 206 目前我国还没有对恩诺沙星在水产动物体内的[7]郑晶,黄晓蓉李耀平鳗鱼中恩诺沙星残留量的酶联免疫 休药期作出明确的规定,但一般药物规定为400℃C-日 检测方法U],食品科学,2004,25(10):247-250 -500℃-日山。500℃-日时,恩诺沙星在鲫鱼体内含量 [8]农业部公告第236号.动物性食品中恩诺沙星和环丙沙星残留 检测方法一高效液相色谱法[s2003 仍然高于最高残留限量。根据本试验结果,在20℃水91 Zhenling Z, A iguo D, Guxiang Y. Sm ultaneous deem ina"ton 温条件下,600℃-日鲫鱼体内药物浓度可以满足 of nine fluo roqu ino bnes in egg white and egg yolk by liquid MRL要求,但鉴于实际生产中水温条件可能低于本 chrom atography w ith fluorm etre detecton J J Chrom atog 试验条件,故推荐的安全休药期为740℃-日 B,2005,82:1202-1209 [0]中华人民共和国农业部公告第235号动物性食品中兽药最高 参考文献 限量[S],2002 ]谢恺舟,王志跃,张军,等环丙沙星在肉仔鸡组织中残留的研究[1]农业部公告第278号兽药休药期规定[S↓2003 o1994-2007ChinaAcademicJOurnalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
除曲线见图2。 图2 给药后(5 m gökg 体重- 1×天- 1 ) 鲫鱼肌肉 组织中环丙沙星与恩诺沙星残留总量的浓度—时间曲线 3 讨论 本检测方法是在参照国标方法[ 8 ] , Zhen ling Z [ 9 ] 的基础上建立起来的, 以pH 2. 4 磷酸2乙腈(82+ 18) 为流动相, 环丙沙星与恩诺沙星分离较好, 但双氟沙 星与沙拉沙星无法完全分离, 作者对流动相的pH 进 行了系统研究, pH 2. 4～ 3. 2 时, 药物峰形较好, 但双 氟沙星、沙拉沙星两种药物分离不完全, pH > 4. 0 时, 4 种药物分离较好, 但峰形较差, 只有当pH = 4. 0, 才能兼顾峰形与分离度, 采用该流动相体系, 药物 出峰时间对pH 依赖性很大, 重现性差。按照Zhen ling Z 方法采用 0. 05 m o l 柠檬酸+ 0. 1 m o l 乙酸铵2乙腈 为流动相, 无需调节pH , 药物分离好, 峰形对称且无 拖尾现象。 表1 回收率及变异系数 药物 添加浓度(ngög) 测定浓度(ngög) 平均回收率(±SD, % ) 变异系数(n= 3, % ) 环丙沙星 5 4. 02 4. 36 3. 95 82. 2±4. 39 5. 33 20 18. 76 17. 54 18. 28 90. 9±3. 07 3. 38 100 80. 70 79. 10 77. 30 79. 0±1. 70 2. 15 恩诺沙星 5 4. 55 4. 68 4. 44 91. 1±2. 45 2. 69 20 19. 42 18. 78 18. 28 94. 1±2. 86 3. 04 100 85. 20 84. 70 82. 30 84. 1±1. 55 1. 84 沙拉沙星 5 4. 16 4. 29 4. 53 86. 5±3. 71 4. 29 20 18. 26 17. 10 16. 66 86. 7±4. 14 4. 77 100 77. 70 75. 80 73. 80 75. 8±1. 95 2. 57 双氟沙星 5 4. 11 4. 07 4. 25 83. 8±1. 95 2. 33 20 18. 76 19. 22 19. 38 95. 6±1. 61 1. 68 100 87. 30 87. 60 85. 70 86. 9±1. 03 1. 18 采用pH 7. 0 的磷酸盐缓冲液提取鱼肉中药物, 回 收率不稳定, 基线噪音较大, 将pH 调节为7. 4, 情况得 到改善。本文将高速(15 000 röm in) 离心与低速离心 (4 000 röm in) 进行对比, 结果发现低速离心时上层提 取液较浑浊, 在净化程序中, 可能堵塞固相萃取柱, 而 且低速离心不足以使组织与提取液完全分离, 产生的 上层清液量较少, 这将直接导致回收率的降低。 残留消除试验, 给药后 3 h 后, 鱼肌肉组织中恩 诺沙星浓度为6. 2 m gökg, 48 h 药物浓度降低近1ö2, 264 h 药物浓度降至0. 68 m gökg, 之后药物代谢非常 缓慢, 720 h 药物浓度为 96 ngög, 低于最高残留限量 100 ngög [ 10 ]。活性代谢产物环丙沙星在停药后3 h, 浓 度达到0. 18 m gökg 在停药后1 天内维持在较高浓度 (≈ 0. 2 m gökg) , 之后缓慢降低, 1416 h 后检测不 出。 目前我国还没有对恩诺沙星在水产动物体内的 休药期作出明确的规定, 但一般药物规定为400℃2日 2500℃2日[ 11 ]。500℃2日时, 恩诺沙星在鲫鱼体内含量 仍然高于最高残留限量。根据本试验结果, 在20℃水 温条件下, 600℃2日鲫鱼体内药物浓度可以满足 M RL 要求, 但鉴于实际生产中水温条件可能低于本 试验条件, 故推荐的安全休药期为740℃2日。 参考文献: [ 1 ] 谢恺舟, 王志跃, 张军, 等. 环丙沙星在肉仔鸡组织中残留的研究 [J ]. 畜牧兽医学报, 2003, 34 (1): 88293. [ 2 ] Cho i J, Yee A J. D eterm ination of fluo roquino lone residues in anim al tissues using E scherich ia coli as indicato r o rganism [J ]. J AOA C Int. , 1999, 82 (6): 140721412. [3 ] V ega M , R io s G. A nalysis of ofloxacin flum equine in fish by h igh2perfo rm ance th in layer ch rom agraph [ J ]. J P lanar Ch rom atogr, 1995, 18: 1473. [ 4 ] Roybal J, W alker C C. Pfenning A P, et al. Concurrent de2 term ination of four fluo roquino lones in catfish, sh rimp, and salmon by liquid ch rom atography w ith fluo rescence detection [J ]. J AOA C Int, 2002, 85 (6): 129321301. [ 5 ] H ernandez M , Bo rrull F, Calull M. U sing nonaqueous cap i2 llary electropho resis to analyze several quino lones in p ig k idney samp les[J ]. E lectropho resis, 2002, 23 (3): 5062511. [ 6 ] Toussaint B, Bo rdin G, Jano si A , et al. V alidation of a liquid ch rom atography2tandem m ass spectrom etry m ethod fo r the sim ultaneous quantification of 11 (fluo ro ) quino lone antibio tics in sw ine k idney [J ]. J Ch rom atogr A , 2002, 976 (122): 1952 206. [7 ] 郑 晶, 黄晓蓉, 李耀平. 鳗鱼中恩诺沙星残留量的酶联免疫 检测方法[J ], 食品科学, 2004, 25 (10): 2472250. [ 8 ] 农业部公告第236 号. 动物性食品中恩诺沙星和环丙沙星残留 检测方法—高效液相色谱法[S ]. 2003. [ 9 ] Zhenling Z, A iguo D , Guixiang Y. Sim ultaneous determ ina2tion of nine fluo roquino lones in egg w h ite and egg yo lk by liquid ch rom atography w ith fluo rim etric detection [J ]. J Ch rom atogr B, 2005, 82: 120221209. [10 ] 中华人民共和国农业部公告第235 号. 动物性食品中兽药最高 残留限量[S ], 2002. [ 11 ] 农业部公告第278 号. 兽药休药期规定[S ]. 2003. 67 中国兽医杂志 2007 年(第43 卷) 第1 期 Ch inese Journal of V eterinary M edicine
