动物医学进展,2007,28(3):98-101 Progress in veterinary medicine 氟喹诺酮类药物残留检测方法研究进展 李振华12,魏东23,张乃生 (1.新疆农业大学动医学院新疆乌鲁木齐830052;2.吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春130062; 3河北北方学院动物医学系,河北张家口075000 摘要:药物残留直接危害人体健康,近年来畜产品中药物残留问题倍受关注。氟喹诺酮类药物残留检 测的方法较多,同时也获得了大量的试验数据。常用的方法有微生物法、免疫分析测定法、免疫亲和色谱液 相色谱法、高髙效液相色谱法、髙效毛细管电泳法、液相色谱-质谱-质谱法、薄层色谱法、荧光分光光度法等。 文章对这些检测方法从定性(筛选)和定量两个方面进行综述。 关键词:氟喹诺酮;残留;检测方法 中图分类号:S859.84 文献标识码:A 文章编号:10075038(2007)030098-04 氟喹诺酮( Fluoroquinolones,FQNs)为一类人牧业的发展,其残留问题以及检测方法已引起广泛 工合成的新型抗菌药,因其抗菌谱广、抗菌活性强、的关注 与其他抗菌药物无交叉耐药性、毒副作用小等特点 定性分析方法 广泛用于动物和人类的多种感染性疾病的治疗。该1.1微生物法 类药物长期和广泛的应用,造成畜产品中药物残留, 微生物法适用于对畜禽组织中的抗菌药物进行 不但给人类健康带来极大的危害,同时也影响了畜快速筛选检验。它虽然能检测高浓度的残留,但检 收稿日期:2006-11-07 作者简介:李振华(1979-),男,内蒙古呼和浩特人,硕士研究生,主要从事家畜内科学和药物残留检测的研究。 通讯作者 [19]Okuno M, Akita K, Moriwaki H, et al. Prevention of rat rat secoldary biliary fibrosis[J]. Gut, 2002, 50(2): 241-247 hepatic fibrosis by the protease inhibitor, camostat mesilate[23]徐正婕,范建高,王国良.高脂饮食致大鼠非酒精性脂肪性肝 via reduced generation of active T[J]. Gastroenterol- 炎肝纤维化模型UJ].世界华人消化杂志,2002,10(4):392 gy,2001,120:17841800 [20] Bhunchet E, Fujieda K. Capillarization and vonulanization of[24]马学惠.肝纤维化动物模型的造模方法卩]中华肝脏病杂志 hepatic sinusoids in porcine serumrinduced rat liver fibrosis: a 1996,4(1):58-60 mechanism to maintain liver bolld flow[J]. Hepatology,[25]曾林,王慧芳.肝纤维化动物模型的研究概况卩J].中国比较 993.18:1450-1458 医学杂志,2003,13(2):124 [21]阴頫宏,李琴,路琴,等.胆管阻塞型肝纤维化模型及其[26]陈波,何生.肝纤维化动物模型的建立卩J」.华西医学 应用[]实验动物科学与管理2006,23(2):4850 2005,20(4):796797 [22] Raetsch C, JiaJ D, Boink g,etal. Pentoxifylline downregur[27]张斌,王中华,王江蓉等血瘀型肝纤维化大鼠模型的建立 lates profibrogenic cytokines and procollagen I expression in 与评价口]中西医结合肝病杂志,2006,16(3)155-157 Progress on Animal Model of He patic Fibrosis WANG Xiao-kun, TANG Ying (Department of Medical Experiment of Wuhan General Haspital, Wuhan. Hubei, 430070, Chinal Abstract Hepatic fibrosis is the restoration reation after hepatic injury, which involves a series of multiplex mechanisms. How to make and choose the homoplastic animal mo dels is the important base for the re- search of pat ho geny, and al so is the effective way to medicines. This paper discussed available met hods patho genesis, pathway, effect of each current animal model for hepatic fibrosis in detail and compared the advantages, disadvantages and their different usage among these methods. In the end, it pointed the devel- op ment trend of this field in the future Key words hepatic fibrosis; animal model 201994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.nki.net
动物医学进展 ,2007 ,28 (3) :982101 Progress in Veterinary Medicine 氟喹诺酮类药物残留检测方法研究进展 李振华1 ,2 ,魏 东2 ,3 ,张乃生2 3 ( 1. 新疆农业大学动医学院 ,新疆乌鲁木齐 830052 ;2. 吉林大学畜牧兽医学院 ,吉林长春 130062 ; 3. 河北北方学院动物医学系 ,河北张家口 075000) 摘 要 :药物残留直接危害人体健康 ,近年来畜产品中药物残留问题倍受关注。氟喹诺酮类药物残留检 测的方法较多 ,同时也获得了大量的试验数据。常用的方法有微生物法、免疫分析测定法、免疫亲和色谱2液 相色谱法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、液相色谱2质谱2质谱法、薄层色谱法、荧光分光光度法等。 文章对这些检测方法从定性(筛选) 和定量两个方面进行综述。 关键词 :氟喹诺酮 ;残留 ;检测方法 中图分类号 :S859. 84 文献标识码 :A 文章编号 :100725038 (2007) 0320098204 氟喹诺酮 (Fluoroquinolones ,FQNs) 为一类人 工合成的新型抗菌药 ,因其抗菌谱广、抗菌活性强、 与其他抗菌药物无交叉耐药性、毒副作用小等特点 , 广泛用于动物和人类的多种感染性疾病的治疗。该 类药物长期和广泛的应用 ,造成畜产品中药物残留 , 不但给人类健康带来极大的危害 ,同时也影响了畜 牧业的发展 ,其残留问题以及检测方法已引起广泛 的关注。 1 定性分析方法 1. 1 微生物法 微生物法适用于对畜禽组织中的抗菌药物进行 快速筛选检验。它虽然能检测高浓度的残留 ,但检 收稿日期 :2006211207 作者简介 :李振华(1979 - ) ,男 ,内蒙古呼和浩特人 ,硕士研究生 ,主要从事家畜内科学和药物残留检测的研究。 3 通讯作者 [ 19 ] Okuno M , Akita K , Moriwaki H , et al. Prevention of rat hepatic fibrosis by t he protease inhibitor , camostat mesilate via reduced generation of active TGF2beta[J ]. Gastroenterol2 ogy ,2001 ,120 :178421800. [ 20 ] Bhunchet E , Fujieda K. Capillarization and vonularization of hepatic sinusoids in porcine serum2induced rat liver fibrosis: a mechanism to maintain liver bolld flow [J ]. Hepatology , 1993 ,18 :145021458. [ 21 ] 阴頳宏 ,李 琴 ,路 琴 ,等. 胆管阻塞型肝纤维化模型及其 应用[J ]. 实验动物科学与管理 ,2006 ,23 (2) :48250. [ 22 ] Raetsch C , Jia J D , Boigk G , et al. Pentoxifylline downregu2 lates profibrogenic cytokines and procollagen I expression in rat secoldary biliary fibrosis[J ]. Gut , 2002 , 50 (2) :2412247. [ 23 ] 徐正婕 ,范建高 ,王国良. 高脂饮食致大鼠非酒精性脂肪性肝 炎肝纤维化模型[J ]. 世界华人消化杂志 ,2002 ,10 (4) : 3922 396. [24 ] 马学惠. 肝纤维化动物模型的造模方法[J ]. 中华肝脏病杂志 , 1996 ,4 (1) :58260. [25 ] 曾 林 ,王慧芳. 肝纤维化动物模型的研究概况[J ]. 中国比较 医学杂志 ,2003 ,13 (2) :124. [ 26 ] 陈 波 ,何 生. 肝纤维化动物模型的建立[J ]. 华西医学 , 2005 ,20 (4) :7962797. [ 27 ] 张 斌 ,王中华 ,王江蓉 ,等. 血瘀型肝纤维化大鼠模型的建立 与评价[J ]. 中西医结合肝病杂志 ,2006 ,16 (3) 1552157. Progress on Animal Model of Hepatic Fibrosis WAN G Xiao2kun , TAN G Ying ( Department of Medical Ex periment of W uhan General Hos pital , W uhan , Hubei ,430070 , China) Abstract :Hepatic fibro sis is t he restoration reation after hepatic injury ,which involves a series of multiplex mechanisms. How to make and choose the homoplastic animal models is t he important base for t he re2 search of pat hogeny , and also is t he effective way to medicines. This paper discussed available methods , pathogenesis , pathway , effect of each current animal model for hepatic fibrosis in detail ,and compared t he advantages , disadvantages and their different usage among t hese met hods. In t he end , it pointed t he devel2 opment trend of this field in the f uture. Key words :hepatic fibrosis;animal model
李振华等:氟喹诺酮类药物残留检测方法研究进展 测限高于样品所规定的最高残留限量(MRLs)。结合高压免疫亲和反相液相色谱柱来分析牛血清 Kerman(1998年)报道了用改进的欧洲四平皿法中FQNs,如环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和二氟 ( fourplate test,FPT)检测市场零售肉中恩诺沙星沙星。采用蛋白G交联柱自动除去对分析有干扰 和环丙沙星的残留情况。微生物抑制分析法的血浆成分,高压免疫亲和色谱柱,共价结合抗沙拉 MIA)用来检测喹诺酮类药物已有报道,通常的操沙星抗体,特异捕获FQNs类物质,其他血清成分 作方法是将组织和抗微生物药物均匀分散到琼脂培被冲洗掉,之后FQNs类物质被洗脱,进行反相 养皿中抑制微生物的生长。喹诺酮类药物使用敏感HPLC分析,荧光检测器检测,激发波长和发射波长 的大肠埃希菌菌株,用于特异性的生物体 分别为280nm和444nm。样品进样前只需要在磷 挪威已经制定了MIA作为鱼类药物残留筛选酸缓冲液中稀释,经0.2mm筛过滤以除去细小微 的官方分析方法。将经处理的鱼肝组织置于接种有粒物质即可。在牛血清中4种FQNs类物质的回收 大肠埃希菌ATCC11303菌株的营养琼脂培养皿率大于95%,而且重复性很好 中,培养过夜,测量抑菌圈的面积,对所有阳性者或2定量分析方法 可疑者用高效液相色谱法进行确证。据报道,这种2.1高效液相色谱法 方法对肌肉样品的检测限为50×10mo/L。其他 高效液相色谱法(HPLC是在经典液相层析法 喹诺酮类药物MIA检测方法也有报导。MIA方法基础上,引进了气相层析的理论,具有气相层析的全 的灵敏度基本符合分析者所期望的水平和规定的最部优点,分离能力强、测定灵敏度高,可在室温下进 高残留限量(MRLs)。尽管如此,在所期望的检测行,应用范围极广 水平下阴性样品的可靠性不能保证。例如,使用大 丁焕中等报道了血浆中沙拉沙星浓度测定的 肠埃希菌ATcC1175株和水提取的组织,对奥索HPLC法,血浆样品经甲醇沉淀血浆蛋白,高速离 利酸、氟甲喹和萘啶酸的检测灵敏度仅达250×心,取上清液作HPLC检测。色谱条件: NovarpakC 10°mol/L~300×10°mol/L。郑晶等用MIA不锈钢色谱柱,流动相为乙腈四丁基溴化铵溶液 与酶联免疫分析法检测了氟喹诺酮类药物的残留,流速1.0mL/min。荧光检测器激发波长278nr 并对这两种方法进行了比较,MIA更适合这类药物发射波长460nm。 的检测。 张国文等采用高效液相色谱荧光检测法测定 1.2免疫分析测定法 鳗鱼中4种氟喹诺酮类(乳酸左氧氟沙星、诺氟沙 免疫分析方法广泛地应用于临床诊断领域,最星、乳酸环丙沙星和恩诺沙星)药物残留量,检测限 近被应用于可食组织中的药物残留检测。这种方法分别为0.0110.023、0.010.031ug/mL。对空白 使用特定的抗体识别目标药物,目标药物和标记药样进行3个水平(0.05、0.1、0.2mg/kg)加标回收 物互相竞争性地与特异性抗体进行结合,形成药物测定,回收率在86.5%~106.4%之间 抗体复合物,通过复合物和酶结合显示的颜色或底 刘媛等用高效液相色谱同时测定鸡蛋中4种 物的颜色来进行分析。FQNs结构中含有羧基,多氟喹诺酮类药物的残留。对鸡蛋样品的提取及其在 采用FQNs羧基与载体蛋白质游离氨基的缩合反CI8固相萃取柱上的净化条件进行了研究,采用高 应,将FQNs与载体连接合成人工抗原,方法简单,效液相色谱分离,荧光检测器检测(λex=280nm 用于兽药残留分析可使分析过程大大简化。 λem=450nm),外标法定量。4种沙星标准曲线的 Sint koff等报道了血清中环丙沙星(CIP)的间线性回归系r数均在0.9999以上,环丙沙星、恩诺 接竞争EISA测定法。首先利用N羟基琥珀酰亚沙星、沙拉沙星的线性范围为2.5μg/L 胺活性酯法( NHS- EDC)将CIP与KLH和BSA连500μg/L,达诺沙星为0.5ugL~100ug/L。鸡 接制备结合物, KL H-CIP免疫新西兰白兔,制备抗蛋样品中4种沙星的加标回收率为78.1%~ 血清。BSA-CIP作包被原,采用1:3200抗血清工95.7%相对标准偏差为RSD4.1%~16.2%。环 作浓度,抑制曲线的ICso≈1ngmL。但由于FQNs丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星的最低检出限为10 主要结构部分相同或相近,因此,某一FQNs的抗g/kg,达诺沙星的最低检出限为2ug/kg 体一般与其他FQNs存在一定交叉反应。故该法 董琳琳等叩用反相高效液相色谱法同时测定 不适合作残留确证,只适用于快速筛选 4种氟喹诺酮类药物(环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙 1.3免疫亲和色谱液相色谱法 星和沙拉沙星)在鸡可食性组织中的残留,其中环丙 Holtzapple C k等报道,采用在线纯化,同时沙星、恩诺沙星、沙拉沙星的定量检出限为 91994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
测限高于样品所规定的最高残留限量 ( MRL s) 。 Okerman (1998 年) 报道了用改进的欧洲四平皿法 (four2plate test ,FPT) 检测市场零售肉中恩诺沙星 和环丙沙星的残留情况[1 ] 。微生物抑制分析法 (MIA) 用来检测喹诺酮类药物已有报道 ,通常的操 作方法是将组织和抗微生物药物均匀分散到琼脂培 养皿中抑制微生物的生长。喹诺酮类药物使用敏感 的大肠埃希菌菌株 ,用于特异性的生物体。 挪威已经制定了 MIA 作为鱼类药物残留筛选 的官方分析方法。将经处理的鱼肝组织置于接种有 大肠埃希菌 A TCC 11303 菌株的营养琼脂培养皿 中 ,培养过夜 ,测量抑菌圈的面积 ,对所有阳性者或 可疑者用高效液相色谱法进行确证。据报道 ,这种 方法对肌肉样品的检测限为 50 ×10 - 9 mol/ L 。其他 喹诺酮类药物 MIA 检测方法也有报导。MIA 方法 的灵敏度基本符合分析者所期望的水平和规定的最 高残留限量 (MRLs) 。尽管如此 ,在所期望的检测 水平下阴性样品的可靠性不能保证。例如 ,使用大 肠埃希菌 A TCC11775 株和水提取的组织 ,对奥索 利酸、氟甲喹和萘啶酸的检测灵敏度仅达 250 × 10 - 9 mol/ L～300 ×10 - 9 mol/ L 。郑晶等[2 ] 用 MIA 与酶联免疫分析法检测了氟喹诺酮类药物的残留 , 并对这两种方法进行了比较 ,MIA 更适合这类药物 的检测。 1. 2 免疫分析测定法 免疫分析方法广泛地应用于临床诊断领域 ,最 近被应用于可食组织中的药物残留检测。这种方法 使用特定的抗体识别目标药物 ,目标药物和标记药 物互相竞争性地与特异性抗体进行结合 ,形成药物 抗体复合物 ,通过复合物和酶结合显示的颜色或底 物的颜色来进行分析。FQNs 结构中含有羧基 ,多 采用 FQNs 羧基与载体蛋白质游离氨基的缩合反 应 ,将 FQNs 与载体连接合成人工抗原 ,方法简单 , 用于兽药残留分析可使分析过程大大简化。 Sint koff 等报道了血清中环丙沙星 (CIP) 的间 接竞争 EL ISA 测定法。首先利用 N2羟基琥珀酰亚 胺活性酯法(N HS2EDC) 将 CIP 与 KL H 和 BSA 连 接制备结合物 , KL H2CIP 免疫新西兰白兔 ,制备抗 血清。BSA2CIP 作包被原 ,采用 1 ∶3 200 抗血清工 作浓度 ,抑制曲线的 IC50≈1 ng/ mL 。但由于 FQNs 主要结构部分相同或相近 ,因此 ,某一 FQNs 的抗 体一般与其他 FQNs 存在一定交叉反应。故该法 不适合作残留确证 ,只适用于快速筛选。 1. 3 免疫亲和色谱2液相色谱法 Holtzapple C K等[3 ]报道 ,采用在线纯化 ,同时 结合高压免疫亲和2反相液相色谱柱来分析牛血清 中 FQNs ,如环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和二氟 沙星。采用蛋白 G2交联柱自动除去对分析有干扰 的血浆成分 ,高压免疫亲和色谱柱 ,共价结合抗沙拉 沙星抗体 ,特异捕获 FQNs 类物质 ,其他血清成分 被冲洗掉 ,之后 FQNs 类物质被洗脱 ,进行反相 HPLC 分析 ,荧光检测器检测 ,激发波长和发射波长 分别为 280 nm 和444 nm。样品进样前只需要在磷 酸缓冲液中稀释 ,经 0. 2 mm 筛过滤以除去细小微 粒物质即可。在牛血清中 4 种 FQNs 类物质的回收 率大于 95 % ,而且重复性很好。 2 定量分析方法 2. 1 高效液相色谱法 高效液相色谱法( HPLC) 是在经典液相层析法 基础上 ,引进了气相层析的理论 ,具有气相层析的全 部优点 ,分离能力强、测定灵敏度高 ,可在室温下进 行 ,应用范围极广。 丁焕中等[4 ]报道了血浆中沙拉沙星浓度测定的 HPLC 法 ,血浆样品经甲醇沉淀血浆蛋白 ,高速离 心 ,取上清液作 HPLC 检测。色谱条件 :Nova2pakC 不锈钢色谱柱 ,流动相为乙腈2四丁基溴化铵溶液 , 流速 1. 0 mL/ min。荧光检测器激发波长 278 nm , 发射波长 460 nm。 张国文等[5 ]采用高效液相色谱荧光检测法测定 鳗鱼中 4 种氟喹诺酮类 (乳酸左氧氟沙星、诺氟沙 星、乳酸环丙沙星和恩诺沙星) 药物残留量 ,检测限 分别为 0. 011、0. 023、0. 01、0. 031μg/ mL 。对空白 样进行 3 个水平 (0. 05、0. 1、0. 2 mg/ kg) 加标回收 测定 ,回收率在 86. 5 %～106. 4 %之间。 刘媛等[6 ]用高效液相色谱同时测定鸡蛋中 4 种 氟喹诺酮类药物的残留。对鸡蛋样品的提取及其在 C18 固相萃取柱上的净化条件进行了研究 ,采用高 效液相色谱分离 ,荧光检测器检测 (λex = 280 nm , λem = 450 nm) ,外标法定量。4 种沙星标准曲线的 线性回归系 r 数均在 0. 999 9 以上 ,环丙沙星、恩诺 沙星、沙 拉 沙 星 的 线 性 范 围 为 2. 5 μg/ L ～ 500μg/ L ,达诺沙星为 0. 5 μg/ L ～100 μg/ L 。鸡 蛋样 品 中 4 种 沙 星 的 加 标 回 收 率 为 78. 1 % ～ 95. 7 % ,相对标准偏差为 RSD 4. 1 %～16. 2 %。环 丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星的最低检出限为 10 μg/ kg ,达诺沙星的最低检出限为 2μg/ kg。 董琳琳等[7 ] 用反相高效液相色谱法同时测定 4 种氟喹诺酮类药物 (环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙 星和沙拉沙星) 在鸡可食性组织中的残留 ,其中环丙 沙星、恩 诺 沙 星、沙 拉 沙 星 的 定 量 检 出 限 为 李振华等 :氟喹诺酮类药物残留检测方法研究进展 99
动物医学进展2007年第28卷第3期(总第162期) 20μg/kg,达氟沙星为4ug/kg 去掉皮和骨后,清洗,切成片状搅碎混匀。鲍鱼和 2.2液相色谱法 对虾,去掉头和尾后,搅碎混匀。称取1.5g± 液相色谱法(LC)操作简单,方法灵活。 Jeffer0.01g于聚丙烯离心管中,冷藏备用。经乙腈提取, ryRM等报道了用LC法测定沙拉沙星在海峡两步固相提取纯化后(SPE和阴离子交换)供液相 鲇鱼中的残留。先将样品用酸化乙醇抽提,再用离色谱分析。克伦特罗作为内标用于前6min中出峰 子交换固相柱分离,最后用碱性甲醇洗脱,洗脱液上的FQNs物质分析,6min~12min用 penbutolol 机检测。色谱条件:苯基柱,荧光检测器(激发波长作为内标分析其它物质。 278nm,发射波长450nm),流动相为乙腈2%乙酸 施冰等建立了水产品(鳗鱼、虾、鱼肉)中7 (体积比15:85)。 RoybalJE报道了牛奶中沙拉种氟喹诺酮类药物残留量的 LC-ESPMS/MS液相 沙星、双氟沙星、思诺沙星的LC检测法,但由于串联质谱测定方法,测定的7种氟喹诺酮类药物 FQNs结构的叔胺基和羧基团能在水中发生解离,包括诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)、恩诺沙星 固定相表面的这些活性位点可通过氢键或离子交换(ENRO)、氧氟沙星(OFL)、单诺沙星(DANO)、双 作用强烈吸附FQNs,出现色谱峰拖尾,保留值不稳氟沙星(DIF)沙拉沙星(SARA)。7种氟喹诺酮抗 定或过长,甚至被长期保留在色谱柱上,导致峰形异菌素标准在1.0ng/mL~200ng/mL范围内,具有 常和分离度下降,这些都影响了FQNs检测的准确良好的线性。该方法回收率高,样品检测限(LOD) 性 0.5ug/kg~2.9ugkg,定量检测限LOQ)分别为 2.3高效毛细管电泳法 9.6(NOR)、6.8(CIP)、1.8(ENRO)、2.8(OFL)、 高效毛细管电泳法(HPCE具有操作简单、色8.2(DANO)、5.4(SARA)2.4(DIF)g/kg,可作 谱柱不受样品污染、分析速度快、分离效率髙、样品为原鳗烤鳗、虾肉、鱼肉等样品的定量检测和确证 用量少、运行成本低等优点,有利于实际样品的分方法 析。朱斌等报道了加替沙星含量测定的HPCE2.5液相色谱质谱联用法 法。采用未涂层弹性石英毛细管柱,56cm×50pm 液相色谱质谱联用法(LCMS)检测灵敏度高, (有效长度50cm);压力进样,压力138kPa,进样时能方便地对微量兽药残留组分进行检测,是目前检 间15h,电压15kV,柱温25℃,检测波长293nm,测食品中FQNs残留确证检测的最佳方法之一。 运行缓冲液100nmol/L磷酸二氢钠溶液-甲醇 Toussaint G等1建立了猪肾脏中11种FQNs残 (8515,用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至9.0),运留的LCMS分析方法。样品用甲醇-0.2%偏磷酸 行时间30min。线性范围为0.05mg/mL~(1+2)提取和脱蛋白质,50C下蒸去有机溶剂,C8 2mg/mL,平均回收率为93%,RSD=0.9%。此柱净化后测定。流动相为甲醇0.1mol/L乙酸胺 方法简便、准确,重现性良好 (40+60),流速0.8mL/min。检测限为10ug/kg。 2.4液相色谱质谱质谱法 LCMS具有很好的选择性和灵敏度,样品处理方法 Johnston l等采用反相高效液相色谱质简单。现在,几乎所有重要的FQNs已建立了LC 谱质谱法( HPLC-MS-MS)同时分析了鲑鱼组织、MS分析法 对虾和鲍鱼中的8种喹诺酮和FQNs的残留量。色2.6薄层色谱法 谱柱为 Zor bax extend18柱( Agilent,150mm 薄层色谱法和液相色谱法相比灵敏度较低 2.1mm,5μm)。柱温为30℃。流动相A为2%蚁(1000×10°mol/L或更低)。据报道,硅胶 酸,流动相B为乙腈,流动相C为Mili-Q超滤水。〔60F254荧光高效薄层色谱法测定组织中恩诺沙 梯度洗脱条件:前3min,流动相中A为10%,流动星的检测水平接近1000×10molL。因此,TC 相B为20%,流动相C为70%;到3.lmin时,流动薄层色谱法对在残留限量100×10°mol/L浓度下 相B升到55%,流动相C降到35%,并保持到的微量或痕量分析是没有意义的。在较低水平下测 10min;到10.1min时,流动相B回到20%,流动定喹诺酮残留,荧光检测器是最常用的。用反相柱 相C回到70%,一直保持到17min。流速为0.2mL分离有较尖锐的峰和较低的噪音水平或拖尾,分离 min,进样量10u,所有分析样品在12min以前出度良好。这种 PL RPS聚合柱在使用0.02mol/L 峰。在浓度为5μg/kg(其中环丙沙星为10μgkg)磷酸乙腈四氢呋喃(68:17:15)流动相时对沙拉沙 以上时,回收率很高。根据样品的不同,FQNs的检星和恩诺沙星有良好的分离度。磷酸和乙腈比例的 测限为1μg/kg~3μg/kg。样品前处理:鱼样品,微小改变及选择合适的柱子都能获得满意的结果 201994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
20μg/ kg ,达氟沙星为 4μg/ kg。 2. 2 液相色谱法 液相色谱法(LC) 操作简单 ,方法灵活。J effer2 ry R M 等[8 ]报道了用 LC 法测定沙拉沙星在海峡 鲇鱼中的残留。先将样品用酸化乙醇抽提 ,再用离 子交换固相柱分离 ,最后用碱性甲醇洗脱 ,洗脱液上 机检测。色谱条件 :苯基柱 ,荧光检测器 (激发波长 278 nm ,发射波长 450 nm) ,流动相为乙腈22 %乙酸 (体积比 15 ∶85) 。Roybal J E [9 ]报道了牛奶中沙拉 沙星、双氟沙星、思诺沙星的 LC 检测法 ,但由于 FQNs 结构的叔胺基和羧基团能在水中发生解离 , 固定相表面的这些活性位点可通过氢键或离子交换 作用强烈吸附 FQNs ,出现色谱峰拖尾 ,保留值不稳 定或过长 ,甚至被长期保留在色谱柱上 ,导致峰形异 常和分离度下降 ,这些都影响了 FQNs 检测的准确 性。 2. 3 高效毛细管电泳法 高效毛细管电泳法 ( HPCE) 具有操作简单、色 谱柱不受样品污染、分析速度快、分离效率高、样品 用量少、运行成本低等优点 ,有利于实际样品的分 析。朱斌等[10 ] 报道了加替沙星含量测定的 HPCE 法。采用未涂层弹性石英毛细管柱 ,56 cm ×50μm (有效长度 50 cm) ;压力进样 ,压力 138 kPa ,进样时 间 15 h ,电压 15 kV ,柱温 25 ℃,检测波长 293 nm , 运行缓冲液 100 nmol/ L 磷酸二氢钠溶液2甲醇 (8515 ,用 1 mol/ L 氢氧化钠溶液调 p H 至 9. 0) ,运 行时 间 30 min。线 性 范 围 为 0. 05 mg/ mL ～ 2 mg/ mL ,平均回收率为 99. 3 % ,RSD = 0. 9 %。此 方法简便、准确 ,重现性良好。 2. 4 液相色谱2质谱2质谱法 Johnstont L 等[11 ] 采用反相高效液相色谱2质 谱2质谱法 ( HPLC2MS2MS) 同时分析了鲑鱼组织、 对虾和鲍鱼中的 8 种喹诺酮和 FQNs 的残留量。色 谱柱为 ZorbaxExtendC18 柱 ( Agilent , 150 mm × 2. 1 mm ,5μm) 。柱温为 30 ℃。流动相 A 为 2 %蚁 酸 ,流动相 B 为乙腈 ,流动相 C 为 Milli2Q 超滤水。 梯度洗脱条件 :前 3 min ,流动相中 A 为 10 % ,流动 相 B 为 20 % ,流动相 C 为 70 % ;到 3. 1 min 时 ,流动 相 B 升到 55 % , 流动相 C 降到 35 % , 并保持到 10 min ;到 10. 1 min 时 ,流动相 B 回到 20 % ,流动 相 C 回到 70 % ,一直保持到 17min。流速为 0. 2 mL min ,进样量 10μL ,所有分析样品在 12 min 以前出 峰。在浓度为 5μg/ kg (其中环丙沙星为 10μg/ kg) 以上时 ,回收率很高。根据样品的不同 ,FQNs 的检 测限为 1μg/ kg～3μg/ kg。样品前处理 :鱼样品 , 去掉皮和骨后 ,清洗 ,切成片状 ,搅碎混匀。鲍鱼和 对虾 ,去掉头和尾后 , 搅碎混匀。称取 1. 5 g ± 0. 01 g于聚丙烯离心管中 ,冷藏备用。经乙腈提取 , 两步固相提取纯化后 (SPE 和阴离子交换) 供液相 色谱分析。克伦特罗作为内标用于前 6 min 中出峰 的 FQNs 物质分析 ,6 min～12 min 用 penbutolol 作为内标分析其它物质。 施冰等[11 ] 建立了水产品 (鳗鱼、虾、鱼肉) 中 7 种氟喹诺酮类药物残留量的 LC2ESI2MS/ MS 液相 串联质谱测定方法[ 12 ] ,测定的 7 种氟喹诺酮类药物 包括诺氟沙星 (NOR) 、环丙沙星 (CIP) 、恩诺沙星 ( ENRO) 、氧氟沙星 (OFL) 、单诺沙星 (DANO) 、双 氟沙星(DIF) 、沙拉沙星(SARA) 。7 种氟喹诺酮抗 菌素标准在 1. 0 ng/ mL～200 ng/ mL 范围内 ,具有 良好的线性。该方法回收率高 ,样品检测限 (LOD) 0. 5μg/ kg～2. 9μg/ kg ,定量检测限 (LOQ) 分别为 9. 6 (NOR) 、6. 8 (CIP) 、1. 8 ( ENRO) 、2. 8 (OFL ) 、 8. 2 (DANO) 、5. 4 (SARA) 、2. 4 (DIF)μg/ kg ,可作 为原鳗、烤鳗、虾肉、鱼肉等样品的定量检测和确证 方法。 2. 5 液相色谱2质谱联用法 液相色谱2质谱联用法(LC2MS) 检测灵敏度高 , 能方便地对微量兽药残留组分进行检测 ,是目前检 测食品中 FQNs 残留确证检测的最佳方法之一。 Toussaint G 等[12 ] 建立了猪肾脏中 11 种 FQNs 残 留的 LC2MS 分析方法。样品用甲醇20. 2 %偏磷酸 (1 + 2) 提取和脱蛋白质 ,50 ℃下蒸去有机溶剂 ,C18 柱净化后测定。流动相为甲醇20. 1 mol/ L 乙酸胺 (40 + 60) ,流速 0. 8 mL/ min。检测限为 10μg/ kg。 LC2MS 具有很好的选择性和灵敏度 ,样品处理方法 简单。现在 ,几乎所有重要的 FQNs 已建立了 LC2 MS 分析法。 2. 6 薄层色谱法 薄层色谱法和液相色谱法相比灵敏度较低 (1 000 ×10 - 9 mol/ L 或 更 低 ) 。据 报 道 , 硅 胶 G60F254 荧光高效薄层色谱法测定组织中恩诺沙 星的检测水平接近 1 000 ×10 - 9 mol/ L 。因此 , TC 薄层色谱法对在残留限量 100 ×10 - 9 mol/ L 浓度下 的微量或痕量分析是没有意义的。在较低水平下测 定喹诺酮残留 ,荧光检测器是最常用的。用反相柱 分离有较尖锐的峰和较低的噪音水平或拖尾 ,分离 度良好。这种 PL RPS 聚合柱在使用 0. 02 mol/ L 磷酸乙腈四氢呋喃(68 ∶17 ∶15) 流动相时对沙拉沙 星和恩诺沙星有良好的分离度。磷酸和乙腈比例的 微小改变及选择合适的柱子都能获得满意的结果。 001 动物医学进展 2007 年 第 28 卷 第 3 期(总第 162 期)
李振华等:氟喹诺酮类药物残留检测方法研究进展 用pH3的草酸缓冲液替代磷酸和改变甲醇与乙腈 鳗鱼中喹诺酮类药物残留的比较研究[J],.中国卫生检验杂志 组合可获得良好的喹诺酮的分离效果和灵敏度 206,16(1):7981 Vega M等报道了测定鱼饲料和组织中恶喹酸3] oltzapple C K, Buckley S A, Stanker L. Determin Tion of fluoroquinolones in using an orline clearr up column co Pled to (OXO)、氟甲喹(FLU)的高效薄层色谱法 highperformance immunoaffinity-reversed-phase liquid HPTL C)。 hroatographyJ] Journal of Chromatography B, 2003, 754: 1- 2.7荧光分光光度法 Waggoner和 Bowman用荧光分光光度法对雏4]丁焕中,冯淇辉,陈杖榴等沙拉沙星在猪体内的药动学研究 鸡和鸭组织中恩诺沙星残留进行了检测,这种方法 J]畜牧兽医学报,2002,33(1):5558 用二氯甲烷和甲醇进行提取,且提取次数多、时间1张国文占春瑞HPC法测定鰻鱼中多种喹诺酮食品科 技学报,2004,(11):6971 长,在激发波长350mm和发射波长450nm条件16刘媛谢孟峡,丁岚,等.高效液相色谱同时测定鸡蛋中4 下,检测限为10×10mol/L~50×10°mol/L。 种氟喹诺酮类药物的残留[J分析化学研究简报,2004,32 3小结 (3):352-35 综上所述,要检测FQNs在动物性食品中的残7琳琳,刘艳华,汪霞,等反相高效液相色谱法同时测定4 留,必须选择特异性强、灵敏度高、高效、快速的检测 种氟喹诺酮类药物在鸡可食性组织中的残留[J].色谱,2005 23(3):285288. 方法。微生物法检测限常高于FQNs的MRL,特异18] Jeffery R M, Verdel K D, Willam H,ta. Liguid chromato- 性不强,不够灵敏;荧光分光光度法虽灵敏度高,但 graphic determination of sarfloxacin residues in channel catfish 操作复杂、耗时长;HPLC法虽然前处理较复杂,所 muscle[J]. AOAC Int 2002, 77(4): 871-875 需仪器也昂贵,但具有高效、快速、灵敏、准确等特 [9 Roybal J E, Pfenning A P, Turnipseed SB,et al. Determination 点,是该类药物残留检测最常用的方法;免疫分析法 of four fluoroquinolones in milk by liquid chromatography J AOAC Int,1999,80(5):982-987 灵敏度高特异性比微生物法强,单抗的特异性更(101朱斌,蒋受军,胡昌勤,高效毛细管电泳法测定加替沙星含 高,可适用于大量样品的快速筛选及某一样品的确 量[]药分析杂志,2002,(5):39740 证3。近几年,关于EISA检测方法的报道也很1施冰,张志刚,吴抒怀,等LC/MSMS测定水产品中7种 多,尤其是试剂盒的研制 氟喹诺酮类抗菌素残留量的方法研究[J].检验检疫科学 目前,检测动物组织中的喹诺酮类药物残留的 2004,14(增):2530 [12 Toussaint G, Bordin A, Janosi A R. Validation of a liquid 研究日趋深入,我国对该类药物的残留研究仍处于 hromatograp hy tandem mass spect rometry method for the 初级阶段,还需不断研究更准确、更有效的残留检测 the simultaneous quantification of 11(fluro) quinolone antibi- 方法,以促进我国畜牧业的发展,并保障食品安全。 otics in swine kidney[J] Journal of Chromatogra Phy, 2 参考文献 976:195206 [1]Ckerman L, Hoof J V, Debeuckelaere W Evaluation of the Eur [13] Vega M, Rios G Analysis of ofloxacin flumequine in fish by ropean four-plate test as a tool for screening antibiotic residues highperformance thin layer chromagraphy [J] planar Chro- in meat samples from retailoutlets[J]. ACAC Int, 1998, 81(1) mater,1995,18:1473 [4]汪雪雁,祁克宗,朱良强.氟喹诺酮类药物残留分析研究进 [2]郑晶,黄晓蓉,郑俊超等.微生物抑制法与酶联免疫法检测 展U]安徽农业科学,2004,32(5):1021-1023 Progress on the Detection Methods of Fluoroquinolones Residue LI Zherhua', WEI Dong ZHAN G Naisheng (1. College of A nimal Veterinary Medicine, Xinjiang A gricultural University, Urmuqi, Xinjiang, 830052, China 2. College of A nimal Science and Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun, Jilin, 130062, China, 3. Department of Veterinary Medicine, North Hebei Univer Abstract: The residue of drugs endanger personal health. The anti biotic residues in livestock products are more and more severe and attract more and more attention. There are many met ho ds used to detec the resi dues of FQNs drugs and a large num ber of test data. The met hods used to detect residues of FQNs drugs include microorganism, immune analyse, HPIAC- HPLC, high performance liquid chromato grapy(HPLC) high performance capillary electrophoresis(HPCE), LC-MS-MS, thinlayer chromatography(TLC), fluo rospectrop hotometry, et al. This articl reviewed those detection methods on the qualitative method (screening) and quantitative method Key words fl uoroquinolones; residue; detection metho ds 201994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
用 p H 3 的草酸缓冲液替代磷酸和改变甲醇与乙腈 组合可获得良好的喹诺酮的分离效果和灵敏度。 Vega M 等[13 ] 报道了测定鱼饲料和组织中恶喹酸 ( OXO ) 、氟 甲 喹 ( FLU ) 的 高 效 薄 层 色 谱 法 ( HPTLC) 。 2. 7 荧光分光光度法 Waggoner 和 Bowman 用荧光分光光度法对雏 鸡和鸭组织中恩诺沙星残留进行了检测 ,这种方法 用二氯甲烷和甲醇进行提取 ,且提取次数多、时间 长 ,在激发波长 350 nm 和发射波长 450 nm 条件 下 ,检测限为 10 ×10 - 9 mol/ L～50 ×10 - 9 mol/ L 。 3 小结 综上所述 ,要检测 FQNs 在动物性食品中的残 留 ,必须选择特异性强、灵敏度高、高效、快速的检测 方法。微生物法检测限常高于 FQNs 的 MRL ,特异 性不强 ,不够灵敏 ;荧光分光光度法虽灵敏度高 ,但 操作复杂、耗时长 ; HPLC 法虽然前处理较复杂 ,所 需仪器也昂贵 ,但具有高效、快速、灵敏、准确等特 点 ,是该类药物残留检测最常用的方法 ;免疫分析法 灵敏度高 ,特异性比微生物法强 ,单抗的特异性更 高 ,可适用于大量样品的快速筛选及某一样品的确 证[15 ] 。近几年 ,关于 EL ISA 检测方法的报道也很 多 ,尤其是试剂盒的研制。 目前 ,检测动物组织中的喹诺酮类药物残留的 研究日趋深入 ,我国对该类药物的残留研究仍处于 初级阶段 ,还需不断研究更准确、更有效的残留检测 方法 ,以促进我国畜牧业的发展 ,并保障食品安全。 参考文献 : [ 1 ] Ckerman L , Hoof J V ,Debeuckelaere W. Evaluation of t he Eu2 ropean four2plate test as a tool for screening antibiotic residues in meat samples from retailoutlets[J ]. ACAC Int ,1998 ,81 (1) : 51256. [ 2 ] 郑 晶 ,黄晓蓉 ,郑俊超 ,等. 微生物抑制法与酶联免疫法检测 鳗鱼中喹诺酮类药物残留的比较研究[J ]. 中国卫生检验杂志 , 2006 ,16 (1) :79281. [ 3 ] Holtzapple C K ,Buckley S A ,Stanker L H. Determin Tion of fluoroquinolones in using an on2line clean2up column co Pled to high2performance immunoaffinity2reversed2phase liquid chroatography[J ].Journal of Chromatography B ,2003 ,754 :12 9. [ 4 ] 丁焕中 ,冯淇辉 ,陈杖榴 ,等. 沙拉沙星在猪体内的药动学研究 [J ]. 畜牧兽医学报 ,2002 ,33 (1) :55258. [ 5 ] 张国文 ,占春瑞. HPLC 法测定鳗鱼中多种喹诺酮[J ]. 食品科 技学报 ,2004 ,(11) : 69271. [ 6 ] 刘 媛 ,谢孟峡 ,丁 岚 ,等. 高效液相色谱同时测定鸡蛋中 4 种氟喹诺酮类药物的残留[J ]. 分析化学研究简报 ,2004 ,32 (3) :3522355. [ 7 ] 董琳琳 ,刘艳华 ,汪 霞 ,等. 反相高效液相色谱法同时测定 4 种氟喹诺酮类药物在鸡可食性组织中的残留[J ]. 色谱 ,2005 , 23 (3) :2852288. [ 8 ] J effery R M , Verdel K D , Willam H , et al. Liquid chromato2 graphic determination of sarfloxacin residues in channel catfish muscle[J ]. AOAC Int ,2002 ,77 (4) :8712875. [ 9 ] Roybal J E ,Pfenning A P , Turnipseed S B ,et al. Determination of four fluoroquinolones in milk by liquid chromatography[J ]. AOAC Int ,1999 ,80 (5) :9822987. [ 10 ] 朱 斌 ,蒋受军 ,胡昌勤. 高效毛细管电泳法测定加替沙星含 量[J ]. 药分析杂志 , 2002 ,(5) :3972400. [ 11 ] 施 冰 ,张志刚 ,吴抒怀 ,等. LC/ MS/ MS 测定水产品中 7 种 氟喹诺酮类抗菌素残留量的方法研究[J ]. 检验检疫科学 , 2004 ,14 (增) :25230. [ 12 ] Toussaint G ,Bordin A ,J anosi A R. Validation of a liquid chromatography tandem mass spectrometry met hrod for t he t he simultaneous quantification of 11 (fluro) quinolone antibi2 otics in swine kidney[J ].Journal of Chromatogra Phy ,2002 , 976 :1952206. [ 13 ] Vega M ,Rios G. Analysis of ofloxacin flumequine in fish by high2performance t hin layer chromagraphy [J ]. Jplanar Chro2 matogr ,1995 ,18 :1473. [ 14 ] 汪雪雁 ,祁克宗 ,朱良强. 氟喹诺酮类药物残留分析研究进 展[J ]. 安徽农业科学 ,2004 ,32 (5) :102121023. Progress on the Detection Methods of Fluoroquinolones Residue L I Zhen2hua 1 ,2 ,WEI Dong 2 ,3 , ZHAN G Nai2sheng 2 (1. College of A nimal Veterinary Medicine , Xinjiang A gricultural Universit y ,Urmuqi , Xinjiang , 830052 , China; 2. College of A nimal S cience and Veterinary Medicine , J ilin Uni versit y , Changchun , J ilin ,130062 , China; 3. Department of Veterinary Medicine , N orth Hebei Uni versit y , Zhang jiakou , Hebei , 075000 , China) Abstract :The residue of drugs endanger personal healt h. The antibiotic residues in livestock products are more and more severe and attract more and more attention. There are many met hods used to detec t he resi2 dues of FQNs drugs and a large number of test data. The met hods used to detect residues of FQNs drugs include microorganism ,immune analyse , HPIAC2HPLC , high performance liquid chromatograpy ( HPLC) , high performance capillary electrop horesis ( HPCE) , LC2MS2MS ,t hin2layer chromatograp hy ( TLC) , fluo2 rospectrop hotometry , et al. This articl reviewed t hose detection methods on t he qualitative method (screening) and quantitative method. Key words :fluoroquinolones;residue ;detection met hods 李振华等 :氟喹诺酮类药物残留检测方法研究进展 101