106(总第147期 水利渔业 2006年第26卷5期 草鱼呼肠孤病毒的研究进展 肖雪,颜其贵,欧洋,曹洪志,樊汶樵,李冰,赖雏莉,张传,周磊,冯林,刘亚 (四川农业大学动物生技术中心四川安014) 摘要草国(CY)病毒科、水生呼肠孤病毒属的病毒中毒力最强的病毒,严重危 害着我国淡水渔业的养殖。基因由1朵A,编码11种结CC能够合成内源 性RA聚合酶在体外转录。总结了近20年来我国在CCRV形态结构理化特性、培养特性、分子生物学以 及预防治疗等方面的研究成果,提出了CCRV的重要酶类作为RNA干涉基因的思路。由于中和效价最高 的蛋白基因M6在毒中有相对保守性,初步确认了基因工程亚单位疫苗开发的可行性。 关键词草鱼出血病草鱼呼肠(r)rna 中414标码文-0 草鱼出血病是一种危害草鱼的高度传染性、致死性28℃,且能保持14五以上的稳定,因此病毒流行具有季节 的病毒性传病。1978年开始道种病的病原体是一性。病毒毒力的差与保存温度、时间有关。比较我国 种病毒并分离鉴定了毒株854的理化特性和生物学特学者分离并保存的具有感染性的草鱼出血病病毒 性1983年从草出血病中分离出一株草鱼出血病病毒C763毒在-30 利架迪度 孤病毒在世界范围内造成了极大的危害,不仅能引起淡上,比离CRY9经过34代的传代后 水鱼类的感染面且还能染海鱼现在已实200新到64 加坡大面积发生的马鲅鱼流行病是水生呼肠微病毒引m 起草鱼出血病病毒是我国分离鉴定的第一株鱼类病现在已实了CCRV具有的集人的“型红 毒现在已有资料证实是水生呼肠孤病毒属中致病力最细胞的能力,也能引起鸡红细胞高滴度凝集,而且这种凝 强的毒仅感染草鱼面可感青鱼,是鱼集能被特性抗血清抑制。 种培育阶段的最大病害1995年病毒分类命名委员会 3培养特 ,). 该病毒能在草鱼鳍条细胞(CF)、草鱼囊细胞系 1形态特征 901,、细施(CAB)、给胞系(CP-一 病毒形态结构与正呼肠病相似。病毒粒子为2080)中增殖,对BKkm等功物的细胞不敏感。 面体:32对称的球形颗粒直径为5~12m,CK细胞是该病毒最敏感的细胞系。不同的毒株对不同 直径约0m,无膜具有层壳壳,系敏性用K 上面有20个中空型的颗粒;内壳5.2m用a蛋白肥上(HM)细(CO上 消外壳后,可面有个物突起C管(CO0接种 c现内壳上只有个速出来 CRV9014和 圆柱形钉状物 GCRV873 ,GCRV83 CK, CAB. FHIK 2理化特 种细胞系中均未观察到细胞病变CCRV-V在盲传3 粒子30围定,下作用代后通过免反应能够检测到病毒粒子。我国分高的毒 3m对均不完整C9CHM系上增,面在 子密度梯心浮力密度1.上不能生长一样在物的 度1.0为5m细系上不能长。 病毒核心能合成RVA聚台酶,酶活性的最适温度是 4病毒组织性和病理变化 收期:005-2 通讯者其 病毒主要经鱼进人体,d后发病,57d后表现 省在出的出血症状死高感染后在舒胜 生主要从事病原分子生物学研究。 组织细胞内观察到大小约为50mm的毒,散布于细胞质 内,在肠组织细胞内观察到大小为70~78m的病毒粒
·106- (总第 147期) 水 利 渔 业 2006年第26卷第5期 草鱼呼肠孤病毒的研究进展 肖 雪，颜其贵，欧 洋，曹洪志，樊汉樵，李 冰，赖维莉，张传斌，周 磊，冯 停，林 涛，刘 亚 (四川农业大学动物生物技术中心，四川雅安 625014) 摘要:草鱼呼肠孤病毒(GCRV)是呼肠孤病毒科、水生呼肠孤病毒属的病毒中毒力最强的病毒，严重危 害着我国淡水渔业的养殖。基因组由11条分节段dsRNA组成，编码11种结构多肤。GCRV能够合成内源 性RNA聚合酶，在体外转录。总结了近20年来我国在GCRV形态结构、理化特性、培养特性、分子生物学以 及预防治疗等方面的研究成果，提出了GCRV的重要酶类作为RNA干涉靶基因的思路。由于中和效价最高 的蛋白基因M6在毒株中具有相对保守性，初步确认了基因工程亚单位疫苗开发的可行性。 关健词:草鱼出血病;草鱼呼肠孤病毒(GCRV) ; dsRNA 中图分类号:5941.41 文献标识码;A 文章编号:1003一1278 (2006) 05 -0106 -04 草鱼出血病是一种危害草鱼的高度传染性、致死性 的病毒性传染病。1978年开始报道这种病的病原体是一 种病毒，并分离鉴定了毒株854的理化特性和生物学特 性。1983年从草鱼出血病中分离出一株草鱼出血病病毒 (Grass Carp Haemorrhage Virus, GCHV )，并鉴定为呼肠孤 病毒科，水生呼肠孤病毒属的一个新成员川。水生呼肠 孤病毒在世界范围内造成了极大的危害，不仅能引起淡 水鱼类的感染，而且还能感染海鱼，现在已证实2002年新 加坡大面积发生的马鱿鱼流行病是水生呼肠孤病毒引 起川。草鱼出血病病毒是我国分离鉴定的第一株鱼类病 毒，现在已有资料证实是水生呼肠孤病毒属中致病力最 强的毒株川，不仅感染草鱼，而且还可以感染青鱼，是鱼 种培育阶段的最大病害。1995年，病毒分类命名委员会 对该病毒正式命名为草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV )。 2890，且能保持14h以上的稳定，因此病毒流行具有季节 性。病毒毒力的差异与保存温度、时间有关。比较我国 学者分离并保存的具有感染性的草鱼出血病病毒 GCRV873,GCRV875 ,GCRV876，发现这3株病毒在 一3090 保存10年仍然能够感染草鱼肾细胞(CIK)，在病毒毒力 测定中，3种病毒感染细胞的滴度均在102TCID,/mL以 上，比新分离的GCRV991略低。经过3一4代的传代后， 其滴度均有所升高，GCRV873达到最高6.4 x 10"TCID50/ ML1s 1。 现在已证实了GCRV具有较弱的凝集人的“O"型红 细胞的能力，也能引起鸡红细胞高滴度凝集，而且这种凝 集能被特异性抗血清所抑制[6]。 1 形态特征 病毒形态结构与正呼肠孤病毒相似。病毒粒子为20 面体，5: 3. 2对称的球形颗粒，直径为65一72 rim，核心 直径约为50 nm，无囊膜，具有双层衣壳。外衣壳约9 n, 上面有20个中空型的颗粒;内衣壳5. 2 run，用 a糜蛋白 酶消化外衣壳后，可见内衣壳上面有 12个钉状物突起， 而对GCRV873精细结的研究中发现，内衣壳上只有6个 圆柱形钉状物川。 2 理化特性 病毒粒子在pH 3一10的范围内较稳定，56℃下作用 30 min仍具有感染性，对氯仿和乙醚均不敏感。完整的 病毒粒子在CSCI密度梯度离心的浮力密度为 1.37岁 cm3，蔗糖梯度离心则为1. 305 g/cm3，沉降系数为550Sa 病毒核心能合成 RNA聚合酶，酶活性的最适温度是 收稿日期:2005一12-20 通讯作者:颜其贵 作者简介:肖雪，1981年生，女，四川省雅安人，在读硕士研究 生，主要从事病原分子生物学研究。 3 培养特性 该病毒能在草鱼鳍条细胞(CF)、草鱼囊胚细胞系 (GCB)、草鱼性腺细胞(CO) , CIK、草鱼吻端细胞(ZC- 7901)、脚鱼囊胚培养细胞(CAB)、草鱼胚胎细胞系(CP- 80)等中增殖，对BHK, Vero等哺乳动物的细胞不敏感。 CIK细胞是该病毒最敏感的细胞系。不同的毒株对不同 细胞系的敏感性又有所差异。用6种细胞系:CIK, CAB , 肥头鲤上皮细胞 (FHM )、鱼卵巢细胞(GCO),鲤鱼的上 皮癌纸状细胞(EPC)和给鱼的输卵管细胞系(CCO)接种 从越南分离 出的毒株 GCRV一V, GCRV9014和 GCRV873E71 ,GCRV873能够引起CIK, CAB , FHM和GCO 典型的细胞病变，但GCRV一V和GCRV9014在感染的6 种细胞系中，均未观察到细胞病变。GCRV一V在盲传3 代后通过免疫反应能够检测到病毒粒子。我国分离的毒 株GCRV991能在CIK, FHM细胞系上很好地增殖，而在 EPC上不能生长，同其它毒株一样，在哺乳动物的BHK, Vero细胞系上不能生长。 4 病毒组织嗜性和病理变化 病毒主要经鱼鳃进人鱼体，4d后发病，5一7d后表现 出明显的出血症状，进人死亡高峰。人工感染后，在肾脏 组织细胞内观察到大小约为50nm的病毒，散布于细胞质 内，在肠组织细胞内观察到大小为 70一78nm的病毒粒
206年第卷第5 水利進业 (总第12.10 子形态与离心提纯的病毒粒子相同。因此,无外衣壳的片段的特征序列,因此又被错误包装进病毒衣壳形成缺 未成骢病毒存在于肾脏,成熟約病喜粒子是在肠道内。损型病毒願粒.。缺损型颗粒不编码功能性蛋白,能进行 各脏器約血管和微血管内皮细胞也可以观察到病毒。自我复制,但是这些小片段遇到了互补片断,就将g重组成 病毒破坏循环系统,使血管扩张,裰血作用减弱,血完整約病毒核酸,重新获得感染性,因此考虑到其安全性 清乳酸氢酶同工酶的相对活性紊乱,鱼体生理功能严问题失型颗粒-般作为研究病幸基因功能的工具 重失调进-步引发各器官的病变和功能的丧失。病毒53基因綸碉的蛋自 对肾班和肠道的直接作用进-步加剧了循环系统的破现在已经确认病毒粒子有1结构多我国学 坏。病毒对部分脏器(如肝脏)和免疫系统具有破坏力,者体5外翻泽c73基因组编吗了12条多欧,研究表 不是因为病聋的直接作用,而是病毒感染后产生的-些明,各基因组片段与编吗多狱的关系是大体一对应的, 可溶性因子以及血管损伤的进-步发展。 除89和S1:编码的多与病毒衣壳中的多联在分子 5GCRV分子生物学 量上无完全对应关系,1:编码2种多肽,推测是体外表 达的非成熟中间产物,需要进行修饰现在未见证实这 51GC基因组综构 准测約报道。S:0的翻译能力较弱外。根摇基因命名其 日前水生呼肠孤病毒属的病毒以RNM杂交为依据编码的蛋的为到Plw和WP0编码的是 可以分为7个亚型。水生呼肠孤病壽基因组具有以下共核心衣壳多肽,8、Y和Ⅶ编码的是外农壳多 同特征:RN3末端不有:(就某种病面言,耿。现在还不能完全确定报导的这些多为结构 各dRNM基因组片段5和3末端都享有相同的46个湫,但也没有排除它们有属于结构多狱的成分。 ψ的两端保守序列,紧连特异的倒转重复序列。病毒具5编吗结构蛋白V,该蛋白与的内衣壳结 有内源性BNA聚合酶,可以进行体外转录 构蛋白以相似。M6编码由68个氮基酸残基您成,分 CN基因组由2分段:组成,总分子量子量6.7KD的外衣壳蛋白。推测该蛋白拥有-4 为15460其中最的0580m,1-4蛋白水解位点,进人细胞后容易被水解掉,便与 最大的片段31由于病毒基因组是分节转录产物的释放,该位点与哺乳动物的m蛋白相似 段的,造成不同病李喜株的复杂性和高度可变性,根据1等)用Z载体表达8,得到由49个氨基酸残 基因片段在聚丙烯酰波凝胶上的迁移率,由慢到快,基因基组成,分子量为4D的内衣壳蛋白,该蛋白与嘈乳动 组片段按分子量分为3个组,分别命名为113-6、物的Sm2蛋白有密切的联系,对于该蛋白是内衣壳蛋 -1747入同,分子量有所03131还是外衣壳蛋白现在还没有定论。m c:N模型的究表明,每个片没都等时报道0编码:6氮基酸组成的外衣壳蛋白 具有(Gu8(的保序列推测其分子量30个锌指序列调节基因表 这些末端插人重复序列是相当保守的,被认为是病毒基达:该蛋白的類基酸序列与银大马哈鱼水生呼肠孤病喜 因组的一般特征。除10外每个片段只编码1种多肽。、:0条纹鲈呼肠孤病0以及哺乳类呼肠孤病毒斗相 52因组的转录和翻译 似的亲水序列,与其它呼肠孤病毒无明显同源性。 病毒基因组的转录分为早期转录和晚期转录。早期我国学者证实2具有RHA聚合酶活性,该酶在 转最是转录以病dM为模板晚期转录是以BM病毒中存在高度保守D结构。表现 子代病毒基因经为模板。CRw早期基因转录是从病毒帽化转录約BA和甲基转移酶的活性,但是缺失一般甲 感染细胞4后开始,C后获得晚期基因的转录产物,其基转移酶G保守区。W在鸟苷酸转移反应中,且 M的大小和数日大体上与病喜基因组8致。具60时表现出最大活性使-种组氨酸质子化这个 体过程是宿主细胞胞饮吞噬病毒粒子,胞内的溶菌酶消特点在已知的正呼孤病毒和水生呼肠孤病毒中具有保 化掉病毒一半的衣壳蛋白,成为多孔状态的亚病毒颗粒,守性3。具有MmPe及解旋酶活性,绑定邮 剩下約外衣壳在转录中保护反应核心,提高转录效率。M$编码的由32个基酸组成,分子量为3170 在亚病毒颗粒内,转录出的正链RNA通过颗粒上的孔释的非结构蛋白,与MV以及鸟类呼场孤病毒科(MRY的 放到细胞质中,许多新合成的mBN楼与应核心相连d8至蛋白有密切的联系王/等078研究 成环形结构是反应核心的典型特征:正链RA即可以是致的。该蛋白的二级结构含有41%a-螺旋和 泽成各种蛋白质,也可以作为半基因组装配人壳体中4.4-折叠片。对该蛋白的生化实验和免皮性分析折 成为前核。前核中的正链RNA才由病毒的聚台合酶加倍成还未见进-步的报道。部分基因片段不上含有一个起始 为妞RNA和衣壳蛋白组装成为新的病毒体 密码子,所以部分基因片断可能编码一种蛋白 我国学者研c83其因组转录时发现在病 毒基细外存在许多小分子量的RHA片段这些片段来 6cCN的免疫性 毒基因组转录时,原病毒基因组的剪切、重排,因GCRY与其它已知的鱼类呼肠孤病毒无交灵抗原不 此含原基因经某-片段3端和5端的保守区和倒转重同毒株之间也存在抗原性差异病毒结构蛋白W、 复区缺失中间部分。末端保守序列是病毒蛋白筛选WF,,W的抗血清具有中和燉价,6诱导的中和 NA进行包装的标志重复序列是该片段区别于其它抗体效价最高,极可能是主要的中和抗原。CRN低温下
2006年第26卷第5期 水 利 渔 业 (总第147期) ·107 子，形态与离心提纯的病毒粒子相同。因此，无外衣壳的 未成熟病毒存在于肾脏，成熟的病毒粒子是在肠道内。 各脏器的血管和微血管内皮细胞也可以观察到病毒[al0 病毒破坏循环系统，使血管扩张，凝血作用减弱，血 清乳酸脱氢酶同工酶的相对活性紊乱，鱼体生理功能严 重失调，进一步引发各器官的病变和功能的丧失。病毒 对肾脏和肠道的直接作用进一步加剧了循环系统的破 坏。病毒对部分脏器(如肝脏)和免疫系统具有破坏力， 不是因为病毒的直接作用，而是病毒感染后产生的一些 可溶性因子以及血管损伤的进一步发展。 5 GCRV分子生物学 5.1 GCRV基因组结构 目前水生呼肠孤病毒属的病毒以RNA杂交为依据 可以分为7个亚型。水生呼肠孤病毒基因组具有以下共 同特征:RNA3’末端不具有Poly ( A)尾;就某种病毒而言， 各dsRNA基因组片段5‘和3‘末端都享有相同的4一6个 by的两端保守序列，紧连特异的倒转重复序列。病毒具 有内源性RNA聚合酶，可以进行体外转录。 GCRV基因组由11条分节段dsRNA组成，总分子量 为15.46 x 106 Dalton，其中最小的片段0.55 x 106Dalton, 最大的片段为3.1 x 106Dalton。由于病毒基因组是分节 段的，造成不同病毒毒株的复杂性和高度可变性。根据 基因片段在聚丙烯酞胺凝胶上的迁移率，由慢到快，基因 组片段按分子量分为3个组，分别命名为Ll一3,M4一6, S7一11。随毒株的不同，分子量有所差别(0.3x1护一3.1 x 106 Dalton) o GCRV873模型的研究表明，每个片段都 具有5' (GUUAUUU)和3'( UUCAUC)的保守序列[9-11]0 这些末端插人重复序列是相当保守的，被认为是病毒基 因组的一般特征。除Sll外，每个片段只编码 1种多肤。 5.2 基因组的转录和翻译 病毒基因组的转录分为早期转录和晚期转录。早期 转录是RNA转录酶以病毒dsRNA为模板;晚期转录是以 子代病毒基因组为模板。GCRV早期基因转录是从病毒 感染细胞4h后开始，10h后获得晚期基因的转录产物，其 mRNA的大小和数目大体上与病毒基因组相一致〔121。具 体过程是宿主细胞胞饮吞噬病毒粒子，胞内的溶菌酶消 化掉病毒一半的衣壳蛋白，成为多孔状态的亚病毒颗粒， 剩下的外衣壳在转录中保护反应核心，提高转录效率。 在亚病毒颗粒内，转录出的正链 RNA通过颗粒上的孔释 放到细胞质中，许多新合成的mRNA链与反应核心相连 成环形结构扩是反应核心的典型特征。正链RNA即可以 翻译成各种蛋白质，也可以作为半基因组装配人壳体中 成为前核。前核中的正链RNA才由病毒的聚合酶加倍成 为dsRNA和衣壳蛋白组装成为新的病毒体。 我国学者[13]研究GCRV873基因组转录时，发现在病 毒基因组外存在许多小分子量的RNA片段。这些片段来 源于病毒基因组转录时，原病毒基因组的剪切、重排，因 此富含原基因组某一片段3‘端和5'端的保守区和倒转重 复区，缺失中间部分。末端保守序列是病毒蛋白筛选 dsRNA进行包装的标志，重复序列是该片段区别于其它 片段的特征序列，因此又被错误包装进病毒衣壳形成缺 损型病毒颗粒。缺损型颗粒不编码功能性蛋白，能进行 自我复制，但是这些小片段遇到了互补片断，就将重组成 完整的病毒核酸，重新获得感染性，因此考虑到其安全性 问题，缺失型颗粒一般作为研究病毒基因功能的工具。 5.3 基因编码的蛋白 现在已经确认病毒粒子有 11种结构多肤。我国学 者体外翻译GCRV873基因组编码了12条多肤，研究表 明，各基因组片段与编码多肤的关系是大体一一对应的， 除S8,S9和Sll编码的多肤与病毒衣壳中的多肤在分子 量上无完全对应关系，S11编码2种多肤，推测是体外表 达的非成熟中间产物，需要进行修饰，现在未见证实这一 推测的报道。S10的翻译能力较弱外。根据基因命名其 编码的蛋白为 Vpl到Vpl o VP1一5和 Vp10编码的是 核心衣壳多肤,VP8,VP9,VP6和VP7编码的是外衣壳多 肤〔’心1。现在还不能完全确定报导的这些多肤为结构多 肤，但也没有排除它们有属于结构多肤的成分。 M5编码结构蛋白VP5，该蛋白与MRV的内衣壳结 构蛋白衅相似。M6编码由648个氨基酸残基组成，分 子量68. 7KD的外衣壳蛋白。推测该蛋白拥有Asn -42 - Pro一43蛋白水解位点，进人细胞后容易被水解掉，便与 转录产物的释放，该位点与哺乳动物的 mul蛋白相似。 Qiu T等〔141用pET载体表达S8，得到由409个氨基酸残 基组成，分子量为44KD的内衣壳蛋白，该蛋白与哺乳动 物的Sigma2蛋白有密切的联系。对于该蛋白是内衣壳蛋 白，还是外衣壳蛋白现在还没有定论[15,16] o Tao Qiu 等〔11]报道S10编码由276个氨基酸组成的外衣壳蛋白， 推测其分子量约为29. 7 KD，含 1个锌指序列调节基因表 达。该蛋白的氨基酸序列与银大马哈鱼水生呼肠孤病毒 S10、条纹妒呼肠孤病毒 S10以及哺乳类呼肠孤病毒S4相 似的亲水序列，与其它呼肠孤病毒无明显同源性。 我国学者证实VP2具有 RNA聚合酶活性，该酶 在 RNA病毒中存在高度保守的GDD结构域〔’?〕。VPl表现 帽化转录的RNA和甲基转移酶的活性，但是缺失一般甲 基转移酶KxDG保守区。VP1在鸟昔酸转移反应中，且 pH <- 6. 0时表现出最大活性，使一种组氨酸质子化，这个 特点在已知的正呼肠孤病毒和水生呼肠孤病毒中具有保 守性[18-20]。0VP3具有NTPase及解旋酶活性，绑定dsRNAo S9编码的由352个氨基酸组成，分子量为 37. 7KD 的非结构蛋白，与MRV以及鸟类呼肠孤病毒科(MRV)的 QNS蛋白有密切的联系，与王炜等[21〕对GCRV873的研究 是一致的。该蛋白的二级结构含有40.1%。一螺旋和 49.4%0一折叠片。对该蛋白的生化实验和免疫性分析 还未见进一步的报道。部分基因片段不止含有一个起始 密码子，所以部分基因片断可能编码一种蛋白。 6 GCRV的免疫性 GCRV与其它已知的鱼类呼肠孤病毒无交叉抗原，不 同毒株之间也存在抗原性差异。病毒结构蛋白VPl, VP5, VP6 , VP9的抗血清具有中和效价，VP6诱导的中和 抗体效价最高，极可能是主要的中和抗原。GCRV低温下
18,(总第1412 水利進业 2060年05港第5 保存时外衣壳蛋白会不完全地自动降解,丧失了部分具试用编码该蛋白的基因制作基因工程亚单位苗。因 有兔免疫性的多肽,因此其中和效价略低于病毒粒子渗透此,在进行行病学调查的基础上,能够构建Y外亮蛋 性高于病毒子有利于提高免变效果2。目前CMY基因工程亚单位疫截 还无血清型分类的报道。我国学者研究表明CR有5 种多做(BWW、W平)含有糖减分,是糖蛋 []陈燕林江音林草鱼出血病毒形态结构及其理 7病毒的检测 化特性的研究门科学通魔报,93,13 110 对病毒的检测的方法很多电镜观察是最直按的方(2]-EK,:0agsa0amsm 法。肾脏是电镜观家病毒粒子的最住部位。细胞培养分d8 im marine threadfin 离病毒、空斑试验、病毒核酸聚丙烯酰胺凝跤电泳(d-gdee GE)等经方法虽然较为复杂,但仍是诊断CRN4公00:011 认的有效手段,现代分子生物学新技术大提高了检测(3]m,mm, detrick FM. identif 数率广志等建立的葡萄珠蘑蛋白协同癡集试 鉴(:-041可以快速高效准确地检测组织中的病,90dymh,19,9 而且简单易操作,对设备没有要求何福林等建立239-24 化鸡红细胞的珏A和田实验能快速检测病毒,而且由于4壬王炜,陈延,柯丽华等草鱼出血病毒武汉 化的鸡红细胞在4℃下保存1年多仍具有新鲜红细胞株的精细结构与基因组及多肽的研究(.病李学 表面受体活性,因此不会影响凝集果。常规SA在:904 草鱼出血病的检测上已有应用,但检测速度较慑。[5]方勤肖调义,李旅等四株草鱼呼肠孤病毒株 健忠等报道的D-EM能够检出33,)的细胞感染特性比较研究5门]中国病李,0 常规ELSH提高了20倍,面且更快速易行。R3是1(2294 近年来发展最为迅速的检测技术该技术能够检测瘕量[6]何福林肖克字,舞修草鱼出血病毒血凝作用 样品感性和特异性都是最高的最小检测量甚到可达及影响因素(门)南农业大学学报(自然科学版), 病孩按酸在病毒感染的各个时期都可检测,是病082041 毒早期诊断和预防的士要技术。 [7] Zhang Qiya, Ruan Hongmei, Li Zhenqiu, Zhang ling 8疫苗的研究 mus( CHV )from Viehman and Companison with 在该病的防治中,主要是采取用灭活苗预防,。现在 GCHV strain from China[ J]. High Technology l 由于该病毒无血清型分类,病毒各毒株间基因组也存在0391213 较大的差异,因此疫苗制作的关键就在于筛选免疫原性8]丁清泉,余兰芬王学兰等草鱼出血病鱼主要器 强的毒株。现在临床上应用国家农业部批准的甲醛灭活官组织的超薄切片观察及感染力的比较(门]水产 苗,组细浆灭话变苗和溺李苗在生产上应用已取得了报,9161 较好效果,免保力在%以上,免疫力可持续13个[9】F:8Q.tlet 月,而通过多代培养进行减春的毒活安苗采用注射法80123dhsm 接种后免疫保护力也在8%以上但安全性较差有返祖(00: 现象出现。在疫苗的开发中,免疫途径也是影响苗效c010 果的重要因素。目前针对鱼类的免疫途径主要有注射6 浸胞泡。注射耗费大量的人力物力对鱼类造成应激反应,[101(,RHL:27ert 而浸泡的效果又不是很好。新型苗的开发也要考虑到6N9 9 of grass cap hemor 免疫途径。 m(,1.l 展 0:01011 [lI] Tao Qiu, Ren -Hou Lu, Jing Zhang, Zuo-Yan Zhu 随着分子生物学的飞速发展,子结构和09tegm 其相关作用机的认:N的预防控制及疗提mdg2mw(e)[.A0, 供了新的恩考。①现在已经开发出了干涉载体,应用0.0414 RNA千涉NA心抑制病的复制已经成为可能(12张保焰柯丽华1草鱼出血病毒基因组体内转录 重要酥类具有高度深守性可以作为E的基因,在2究(国病毫91:18 复制的早就发生抑制把病毒对细胞的损害降低到最(13]2满,张菁陆后等草鱼出血病毒83株基 小程废。RNi也是研究戴除基因功能的一种技术。②因组外发现缺损性干扰颗粒的亚基因组成份(门1 尽管研究证实了6是要中和抗原但是还没有人尝病毫7:101014
·108 (总第147期) 水 利 渔 业 2006年第26卷第5期 保存时，外衣壳蛋白会不完全地自动降解，丧失了部分具 有免疫性的多肤，因此其中和效价略低于病毒粒子，渗透 性高于病毒粒子，有利于提高免疫效果[217。目前GCRV 还无血清型分类的报道。我国学者研究表明GCRV有5 种多肤(VP3,VP8,VP9,VP10, VP11)含有糖成分，是糖蛋 白[22 7。 试应用编码该蛋白的基因制作基因工程亚单位苗。因 此，在进行流行病学调查的基础上，能够构建VP6外壳蛋 白基因工程亚单位疫苗。 参考文献: 7 病毒的检测 对病毒的检测的方法很多，电镜观察是最直接的方 法。肾脏是电镜观察病毒粒子的最佳部位。细胞培养分 离病毒、空斑试验、病毒核酸聚丙烯酞胺凝胶电泳 (PAGE)等经典方法虽然较为复杂，但仍是诊断GCRV公 认的有效手段。现代分子生物学新技术大大提高了检测 效率。杨广志等【237建立的葡萄珠菌A蛋白协同凝集试 验(SPA一。oA)可以快速高效准确地检测组织中的病毒， 而且简单易操作，对设备没有要求。何福林等[(67建立醛 化鸡红细胞的HA和HI实验能快速检测病毒，而且由于 醛化的鸡红细胞在4℃下保存 1年多仍具有新鲜红细胞 表面受体活性，因此不会影响凝集效果。常规ELISA在 草鱼出血病病的检测上已有应用，但检测速度较慢。邵 健忠等{247报道的Dot一ELISA能够检出3pg的GCRV，比 常规ELISA提高了20倍，而且更快速易行。RT一PCR是 近年来发展最为迅速的检测技术，该技术能够检测痕量 样品，敏感性和特异性都是最高的，最小检测量甚至可达 0.Ipg病毒核酸，在病毒感染的各个时期都可检测，是病 毒早期诊断和预防的主要技术四。 8 疫苗的研究 在该病的防治中，主要是采取用灭活苗预防。现在 由于该病毒无血清型分类，病毒各毒株间基因组也存在 较大的差异，因此疫苗制作的关键就在于筛选免疫原性 强的毒株。现在临床上应用国家农业部批准的甲醛灭活 苗[(267。组织浆灭活疫苗和弱毒苗在生产上应用已取得了 较好效果，免疫保护力在 80%以上，免疫力可持续 13个 月，而通过多代培养进行减毒的弱毒活疫苗，采用注射法 接种后免疫保护力也在85%以上，但安全性较差，有返祖 现象出现。在疫苗的开发中，免疫途径也是影响疫苗效 果的重要因素。目前，针对鱼类的免疫途径主要有注射、 浸泡。注射耗费大量的人力物力，对鱼类造成应激反应， 而浸泡的效果又不是很好。新型疫苗的开发也要考虑到 免疫途径。 ， 展望 随着分子生物学的飞速发展，对 GCRV分子结构和 其相关作用机制的认识，为GCRV的预防、控制及治疗提 供了新的思考。①现在已经开发出了干涉载体，应用 RNA干涉(RNAi)抑制病毒的复制已经成为可能。GCRV 重要酶类具有高度保守性，可以作为RNAi的靶基因，在 复制的早期就发生抑制，把病毒对细胞的损害降低到最 小程度。RNAi也是研究敲除基因功能的一种技术。② 尽管研究证实了VP6是主要中和抗原，但是还没有人尝 [1] 陈燕林，江育林.草鱼出血病病毒形态结构及其理 化特性的研究〔Jl.科学通报，1983 , 28:1 138 1 140. [2] Seng E K, Fang Q,Chang S F, et al. Characterisation of a pathogenic virus isolated from marine threadfin fish(Eleutheronema tetradac州us)during a disease outbreak[J].Aquaculture, 2002,214: 1一18. [3] Angel A A, Rockemann D D, Hetrick F M. Identifi- cation of grass carp hemorrhage virus as a new geno- group of aquareovirus [ J ].J Gen Virol，1999，80: 2 399 ~ 2402. [4〕 王炜，陈延，柯丽华，等.草鱼出血病病毒武汉南湖 株的精细结构与基因组及多肤的研究〔J].病毒学 报，1990,6(1):44一50. [5] 方勤，肖调义，李旅，等.四株草鱼呼肠孤病毒毒株 的细胞感染特性比较研究〔J].中国病毒学，2002, (2):182一184. [6〕 何福林，肖克宇，龚择修.草鱼出血病病毒血凝作用 及影响因素【J].湖南农业大学学报(自然科学版)， 2002,28(1):47一50. [7] Zhang Qiya, Ruan Hongmei, Li Zhengiu, Zhang Jing, GuiJianfang. Detective of Grass Carp Hemorrhage Vi- 。 (GCHV)from Vietnam and Comparison with GCHV strain from China[J].High Technology Leters. 2003,9(2) :7一13. [8] 丁清泉，余兰芬，王学兰，等.草鱼出血病鱼主要器 官组织的超薄切片观察及感染力的比较【J].水产 学报，1990,14(1):66一69. [9] Fang Q, Atoui H, Cantaloube TF, et al. Sequence of genome segmentsl,2 and 3 of the grass carp reovirus (Genus Aquareovirus, famiy Reoviridae)[J].Bio- chem BiopHys Res Commun, 2000，273(4):762- 766. [10] T Qiu, R H Lu, J Zhang, Z Y. The molecular char- acterization of RNA segment S9 of grass carp hemor- rhage virus(GCHV)，an aquareovirus [ J ].Aquacul- ture,2001,203 (1一2) ;1一7. [11] Tao Qiu,Ren一Hou Lu,Jing Zhang,Zuo一Yan Zhu. Complete nucleotide sequence of the S10 genome seg- ment of grass carp reovirus(GCRV)[J〕.DAO, 2001,44(1);69一74. [12] 张保焰，柯丽华.草鱼出血病病毒基因组体内转录 的研究[J].中国病毒学，1993,(2);185一188. [13] 邱涛，张普，陆仁后，等.草鱼出血病病毒873株基 因组外发现缺损性干扰颗粒的亚基因组成份【J]. 病毒学报，2001,17(2):141一144
206年第25卷第5 水利進业 总第147期)19 [14] Qiu T, Lu RH, hang L, et ad. Molecular Charact Cap Reovirus( Emus Aquareovirus, Family Reovin ization and expression of the M6 gene d grass carp de)[[. Biochemical and Biop Hysical Research ),a门 003113.(2】壬王炜剋桃英方,等草鱼出血病病毒多肽的免 [5]王炜,蔡宜权,勤等草鱼出血病毒基因的定变原性(中国病29013 位(]中国病学,949353.1(2】陈延王炜,柯丽华,等草鱼出血病病毒的糖蛋白 6ur,ag2 Genome segment of圆和结构多的原性(病春学:19(1 51-“6 2]杨广志,罗毅平,叶雪平葡萄球蓄A蛋白协同凝 []勤朱作言草鱼呼肠孤病毒RM聚合醇基因集试验快速检测草鱼出血病毒的研究[]水产 功能区在原核细胞中的表达].病:201学报,923 8(1):6-8 4]邵健忠,项黎新李亚南,等应用D-SM技 3]sHi, se martinez-8,lsim术检测草鱼出血病病毒的研究1门],水产学报, Benavente, Vikram N. Vakharia Cloning, Expres- 1996, 20(1 ) 6-11. nylyltransferse[ J Virology, 202,2096(2): 288 of a mapid, sensitive and specie diagnostic asay for 29 fish Aquareovirus based on RT-PCR[J]. Joumal d 山 activity identified[J ]. Biotech Bui.(24】杨先乐,等草鱼出血病细胞培养灭活疫茁的研究 水:934 20]Qin Fang, Housam Attu, Jean Francois, et d Se (★任编捍万月华) (上排第38页) l14. 第囚大蜿第V时相母忘退化过程中滤泡组侵入(2)张神虎大的药用价值及人工养殖]广西业 内吞槛卵黄的过程及成熟卵母细脑未排出体外而进入:00039:310 袁亡的演变过程比鱼类更为激烈。 3]张神虎大蛻的药用价值及人工养殖冂]特种经济 通过对大蝴的精卵巢切片观察发现,即使在成熟的520:6 果刃片中可同时找精原细胞、初级櫓母绍胞次级糟(4盒如等大蜆人工繁殖研究鉴定材料江编l 母知胞,子细胞及精子,在成鹦卵巢切片中可找到不:1001 同时榣約卵母细胞这充分表明大蛻的性腺发育是不同5]刘鉴毅汉兵扬湾林芝大蛇成熟,卵的 步的,这是大蜿对自然生态环境的一种特殊适应,确保形态学观察及受糟化中的形态变化()水 种群的廷续性。这一现象也为大鲵的人工模拟生态繁89.939 奠定了基础可以对大蛇进行强化培育使其能多次产卵(6】大蛾卵巢发育和输管组织学结构的研究 和排精并且是在同时间排精和产卵。 门]游南教育学院学报.2019313914 大蜿卵母细胞发育过程中细胞学变化过程是由(13罗亚平,妻国减孙艳香等中国大航能性生雅系 逐渐增大的过程,第Ⅳ、V时相的卵母绍增大到了极5的解割学和组纠学研究(!广西师大学报 点,成熟卵可达5-9mn时核膜消融核分组,按偏(::00269 位,精母细胞发育是由大到小,细胞质逐渐减少,嗜碱性(3】刘进算江辉潺理琦等大糖果的解及组织 逐粥增强内肉部结构速盖成变态后精子头部里长辣形态结究签济7:089:3 椒状,尾部较长,粗壮有力,比起大多数鱼类精子发生过 16 程有独特之处。 9阳爱生,下伟,等大还发育初步研究(动物 学报91044 参考文獻: [0]楼允东,等组织胚胎学(第二版1)1北京:中 ]CmEu-j,T0F-,M国农业出社,9 (★任编捍张俊友
2006年第26卷第5期 水 利 渔 业 (总第147期) ·109· [14] 目l e s J 一e se se sJ 1 1 2 2 弓‘ ﹄. . L l， . ‘ ，. . J 工. . J 内j 月 f 2 ， ‘ re s L r . L [17] [18] Qiu T, Lu RH, Zhang J, et al. Molecular Characterization and expression of the M6 gene of grass carp hemorrhage virus(GCHV)，an aquareovirus【J]. Arch Viro1,2002,146(7):1 391一1397. 王炜，蔡宜权，方勤，等.草鱼出血病病毒基因的定 位[J].中国病毒学，1994,9(4) :356 -361. Qiu T, Zhang J, et al. Genome segment S8 of grass carp hemorrhage virus encodes a voropm proten [ J ]. Intervirology, 2001,44(5).317一320. 方勤，朱作言.草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因 功能区在原核细胞中的表达【J].病毒学报，2002, 18(1):86一88. JosepH Hsiao, Jose Martinez一Costas, Javier Benavente, Vikram N. Vakharia. Cloning, Expres- sion, and Characterization of Avian Reovirus Gua- nylyltransferase [ J ].Virology, 2002, 296 (2):288 -299. Luongo, Cindy L. Histidines needed for reovirus guanylyltransferase activity identified [ J ].Biotech Business Week. Atlanta,2004,9:510. 切n Fang, Houssam Attoui, Jean Francois , et al. Sequence of Genome Segments 1,2, and 3 of the Grass ﹄l e s J le se se s J 哎 ︺ 石 U J. 1 ︸. 几 r .. L l. . .L [25] [26] Carp Reovirus(Genus Aquareovirus, Family Reoviridae)[J ] . Biochemical and BiopHysical Research Communications, 2000 , 274 (3) :762一766. 王炜，赵桃英，方勤，等.草鱼出血病病毒多肤的免 疫原性[J].中国病毒学，1995,10(2):166一168. 陈延，王炜，柯丽华，等.草鱼出血病病毒的糖蛋白 和结构多肚的抗原性〔J].病毒学报，1992,8(1): 57一61. 杨广志，罗毅平，叶雪平，葡萄球菌A蛋白协同凝 集试验快速检测草鱼出血病病毒的研究【J].水产 学报，1991,15(1):27一33. 邵健忠，项黎新，李亚南，等.应用Dot一ELISA技 术检测草鱼出血病病毒的研究〔J]，水产学报， 1996,20(1):6一11. E K Seng, Q Fang, T J Lam, Y M Sin. Development of a rapid, sensitive and specific diagnostic assay for fish Aquareovirus based on RT一PCR[J].Journal of Virological Methods ,2004，118(2) :111一122. 杨先乐，等.草鱼出血病细胞培养灭活疫苗的研究 [J].水产学报，1989,13(2):138一143. (责任编挥 万月华) ﹄l e s j le J n， n U ， 1 ， ‘ r e s J ~. . L (上接第38页) 第四，大貌第M时相卵母细胞退化过程中，滤泡细胞侵人 卵内吞噬卵黄的过程及成熟卵母细胞未排出体外而进人 衰亡的演变过程比鱼类更为激烈。 通过对大貌的精、卵巢切片观察发现，即使在成熟的 精巢切片中可同时找到精原细胞、初级精母细胞、次级精 母细胞、精子细胞及精子，在成熟的卵巢切片中可找到不 同时相的卵母细胞，这充分表明大貌的性腺发育是不同 步的。这是大鱿对自然生态环境的一种特殊适应，确保 种群的延续性。这一现象也为大貌的人工模拟生态繁殖 奠定了基础，可以对大貌进行强化培育，使其能多次产卵 和排精，并且是在同一时间排精和产卵。 大貌卵母细胞发育过程中，细胞学变化过程是由小 逐渐增大的过程，第W,V时相的卵母细胞增大到了极 点，成熟卵可达5一9mm，此时核膜消融，核仁分组，核偏 位。精母细胞发育是由大到小，细胞质逐渐减少，嗜碱性 逐渐增强，内部结构被遮盖，成熟变态后精子头部呈长辣 椒状，尾部较长，粗壮有力，比起大多数鱼类精子发生过 程有独特之处。 参考文献: [1 ] CHEN Li一jing, TAO Feng一yong, LU Qing一bin. Advances in research of Chinese giant salamander[ J]. Journal of Shanghai Fisheries University,2003，(12): 110~114. [2〕 张神虎.大貌的药用价值及人工养殖【J].广西农业 生物科学，2001,20(4):309一310. [3〕 张神虎.大貌的药用价值及人工养殖〔J].特种经济 动植物，2003，(2) :16. [4] 敖鑫如，等.大貌人工繁殖研究鉴定材料汇编〔R]. 南昌大学，2000,12. [5] 刘鉴毅，肖汉兵，杨众清，林锡芝.大貌成熟精、卵的 形态学观察及受精卵孵化中的形态变化【J].淡水 渔业，1999,29(3) :6一9. [6] 赖勤.大统卵巢发育和输卵管组织学结构的研究 [J].湖南教育学院学报，2001,19(3):159一164. [7] 罗亚平，姜国诚，孙艳香，等.中国大蜕雌性生殖系 统的解剖学和组织学研究【J].广西师范大学学报 (自然科学版)}2002,20(2) :85 -90. [8] 刘进辉，江辉，谭理琦，等.大统精巢的解剖及组织 形态结构研究【J].经济动物学报，2004,8(3):163 ~166. [9] 阳爱生，卞伟，等.大貌胚胎发育初步研究【J].动物 学报，1983,29(1):42一47. [10〕 楼允东，等.组织胚胎学(第二版)[M].北京:中 国农业出版社，1996. (责任编辉 张俊友)
