《鱼病简讯》1989年第2-3期 草鱼出血病细胞培养灭活疫苗的研究 一最佳灭活方法的探讨 杨先乐左文功 (中国水产科学研究院长江水产研究所 草鱼出血是由鱼呼肠孤病毒(FRV)引起的严重病毒性疾病(中国科学院武汉病毒研 究所、中国水产科学研究院、长江水产研宄所沙市分所草鱼出血病协作组,1983,1984a, 1984b),用草鱼出血病细胞培养灭活疫苗免疫草鱼是预防该病的途径之一,并已初步展现 出它的应用前景(杨先乐,1986,1989)。 探讨病毒火活的最佳方法是保证疫苗安全性和提高疫苗效价的一个重要手段,国外曾对 传染性胰脏坏死症(IPN)。传染性造血器官坏死症(IHN)、病毒性出血败血症(VHS) 等灭活疫苗的灭活方法作过一些研究( POtash,1968; Mackelvie& Desauteis,1975 de kinkelin Berre, 1977: woller Frried 1978; Hill, etal.,1981; Dixon&Hill1983; Nishimura et al.,1985);国内也报导过草鱼出血病 组织浆灭活疫苗的灭活方法(高汉姣等,19801),但无详细的研究,尤其对各种灭活方法 灭活后的病毒疫苗抗原性的比较和评价目前尚未涉及,我们在获得抗原性较强的FR-8J4疫 苗姝(杨先乐等,1989)的基础上,对其最佳灭活方法进行了探讨,以期为生产提供安全、 高效的细孢培养灭活疫苗提供依根。 材料和方法 ,病毒将种子毒株FR-854接种于长满单层的CIK细胞,七天左右,待细胞出现 典型细病变效应(CPE)后收获然后将同一批次的病毒液冻融混合,测定其滴度( TCI DE. ml),并将其分装于若干小瓶,蹬-30℃备用。 2.病毒染性灭活的检定将上述病毒与某一浓度的福尔马林溶液混匀后在一固定 温度下温育(每一情况的平行设立二组)。间隔一定的时间将其温育后的病毒取出,用含有 亚硫酸钠的 agles MEN以1:10稀释〔使亚硫酸钠最终浓度为0.04%),然后接种于长满 单层的HHCK细胞,连续观察七天;若七天后未出现CPE,将其于-30℃冻融后进行第一 次盲传;两组试验第二次盲传后均不产生CPE且付健康草鱼不感染者作为病毒感染性失活的 依据。试验最终浓度,以下同有0.090,075%01%,0.15%02%等五种,温育时 间依各温育温度而有所区别 华中农业大学产系八七级昊玉梅同学、本所夏春同志参加部分工作,君此致谢 1]高汉姣等,1980。草鱼出血病灭活疫苗的研究。鱼病简讯,3:1-7
《鱼病简讯 》1989年第2—3期 草鱼 出血病细胞培 养灭活疫苗 的研究 一 一 最 佳 灭 活 方 法 的 探 讨 杨 先乐 左 文功 (中国水 产科 学 研究院 长江 水产 研究 所 ) 草 鱼出血是 由鱼呼肠孤病毒 (F R V) 【起的严重 病毒性疾病 (中国科学 院武 汉病毒研 究所 、中国水产 科学研究院、长 江承产研 究所 沙市 分所草 鱼 出血病 协作组 ，1983，1984a， 1_, 984b) 用草鱼出血 病细 胞培养灭 活疫苗免疫 草 鱼是 预 防该病 的途径之一，并 已初步展 现 出它的应用前景 (杨先 乐， 1986，1989)。 一 探 讨病毒火 活的最佳方 法是 保证 疫苗安全性和提 高疫苗敖价的 一个 重要 手段 ，国外 曾对 传染性 胰脏坏歹匕症 (IPN)。传染性 造血器官坏死 症 (IHN)、病 毒性 出血败血症 (VHS) 等 活疫苗的灭恬方法 作过 一些研究 (POtash， 1968~ Mackelvie ＆ Desauteis， 1975~ de Kinkelin ＆ Berre 1977；W oller ＆ Frrledman。 1978；Hill。 eta1．， 1980； Sano et a1 ． ， 1981；DJxoi1&Hill，l983；NisMmura 尘一．，1985)；国内也报导过草鱼出血病 组织浆灭 活疫 苗的灭 活方法 (高汉妓等 ，1980… )，但无详 细 的研究 ，尤其对各种灭活方法 灭 活后的病毒 疫苗抗源性的 比较 和 评价 目前 尚未涉及 ，我 们在获得 抗原性较 强的FR一8j4疫 苗株 (杨先乐 等，1989)的基础上， 对其最佳灭活 方法进行 了探讨 ，以期为生产 提供 安全、 高效的细胞培养灭 活疫苗提供 依根 。 材料和方法 ]，病 毒 将种子毒株FR一854接种于长满单层的 CIK 细胞 ，七 天左右，待 细胞 出现 典 型细胞病变效应(CPE)后收获 ，然后将 同一批次 的病 毒液冻融混 合，测定其 滴度 (TCIDs。， m1)，并将其分装 于若 干小瓶，置 一30℃备用。 2． 病 毒 感 染性 灭 活 的 检 定 将 上 述 病 毒 与 某一 浓度 的福 尔 马 林 溶 液 混 匀 后 在 一 固 定 温度下 温育 (每 一情 况的平 行设立二组 )。间辐一定的 时间将其 温育 后 的病毒取 出，用含有 亚 硫 酸 钠 的 Eagle sMEM 1：10稀 释 (使 亚 硫 酸 钠最 终 浓 度 为 0．04 )， 然 后接 种 于 长 满 单层的 HHC【K细 胞．连续观察七 天 ；若七 天后 未出现 CPE，将 其于 一30℃冻融后进行第 一 次盲传 ；两组试验第 二反盲 停后均 不产 生 Ct；ER对健康 草鱼不感染者 作为病 毒感染 性失活的 依据 。试 验最 终 浓 度 ， 以下 同有 O．05 ， 0．075％ ， 0．1 ， 0．15 ， 0．2 等 五 种 ， 温 育 时 间依 各温 育温度而 有所 区别。 ※华 中农业 大学 水产 系八 七 级曼 玉梅同 学 、本所 夏春 同 志参加 部 分工 作 君 此取谢 。 [1]高汉蛀 等，1980。 草包 出血病 灭 活痤苗 的研究 。鱼病 简讯 ， 3t 1～ 7 维普资讯 http://www.cqvip.com
3.灭活病毒免疫原性的评价按所有能使病毒失去感染性的灭活方法,以同一批次 的病毒制备细胞培养灭活疫苗后分若于组免疫健康的一龄草鱼,然后测定其免疫保护力和血 清中和抗体效价(杨先乐等,1986,1989)。将统计结果按免疫保护力的平均数(U:)及 方差(U2),血清中和抗体效价的平均数(U3)及方差(U4),4个判据集,并分别给予 评判函数 G Us 和权值05,0,05,0。4 005进行 Fuzzy综合评判(陈贻源,1984,王东,1989)。为了排除不同批次免疫试验间可 能存在的差异,以D(x1)值龄草鱼,进一步比较并用 Fuzzy综合评判法择优评选。 试验结果 、病毒感染性的灭活 将病毒滴度为10DCID/m1的FR-854株与不同被度的福尔马斯混合后分别于32℃ 20℃和4℃下温育,其结果表明,32℃时,福尔马林浓度为0,05%者,温育96小时后病毒仍 具惑染性,而当福尔马林浓度升高到0.075%和01%时,则9小时和42小时后即能使病毒失 活(表1);20℃时,能使病毒失活的福尔马林有效浓度为0.1%,0.15%0.2%其温育 的起码时闻分别是6、4、3天(表2);由于4℃温度较低,则使福尔马林灭活病毒的过程 减慢,当福尔马林浓度在0.1%时、第冫天,0.15%时第12天,02%时第9天才能使病毒失 去感染性的法向,分别用这这8种方法对滴度为107°5TCID3/m的FR-854病毒灭活后感 染健康草鱼,均未发现死于出血病症状的现象。 132℃温育时福尔马林对FR染性的灭 福尔马林最终 温育时间(小时) 组别 浓度(%) 0.05 ++{++++++"++ ++|+++ 1 十++,+++1+++!+ 十++|+++!+++ 0。075 2 0。1 ++++++ +++未传代,即同检测到病毒 ++第一次盲传后,检测到病毒 第二次盲传后,检测到病毒, 三次传代均未发现病毒 下各表同 灭活病毒的免疫原性 用滴度为105TCID5/m的FR-854病毒按以上能使病毒感染性失活的8种灭活方法 制备细胞培养灭活疫苗后免疫草鱼的结果表明:41017(0.1%的福尔马林4℃灭活17天,见 表4,以下同)能使草鱼获得较高的免疫保护力[91.6士11.8(2)%,其次是20203,4209
3．灭活病毒免疫原性的评价 按所有能使病毒失去感染性的灭活方法，以同一批次 的病 毒制备细胞培养灭活疫苗后分若干组 免疫健康的 一龄草鱼， 然后 测定其免 疫保护力 和血 清 中和抗体效价 (杨先 乐等， 1986， 1989)。将统计结果按 免 疫保护力的 平均数 (Ut)及 方差 (Uz)，血清 中和抗 体效价 的平均数 (U3)及 方差 (U。)， 4个 判据 集 ，并分别给予 T T 1 T T T T ^ T T 评判函数 G一～川 、G2一三 ：1 、Gs=—0 U 一、G一 o 和权值0．5，0．05，0．4， 0．05进 行 Fuzzy综 合 评 判 (陈贻 源 ， 1984， 王 东 ，l989)。 为 了 排 除 不 同 批 次 免 疫 试 验 间 可 能 存在的差 异， 以D(x )值龄草 鱼，进 一步 比较 并用Fuzzy综 台评判法择优评选。 试 验 结 果 一 、 病毒 感染性的灭 恬 将病毒滴度为108DCID。o／ml的FR一854株与不 同浓度 的 福尔 马斯混台后 分 别于32℃， 20℃和4℃下温育，其结果表明，32℃时 ，福 尔马林浓度为0．05％者，温 育 96小 时后 病毒仍 具 感染性，而 当福尔马林浓度升高到0．075 和0．1 时，则96小时和42小时后即 能使病毒失 活 (表 1 ){20℃时 ，能 使病毒失活的福尔马林 有 效浓 度为0．1％， 0．15 ，0．2 ，其温育 的 起码时间分别是 6、 4、 3天 (表 2)；由于4℃温度较 低，则使福 尔马林灭活 病毒 的过程 减慢， 当福尔马林 浓度在 0．1 时，第 7天，0．1％时第12天， 0．2 时第 9天才 能使病毒失 去感染性的法 向，分别 用这这 8种方法 对滴度为 10 TCID 。／ml的FR一 854病 毒灭 活后感 染健康草鱼 ，均 未发 现死 于出血病症状的现 象。 囊1． 52℃沮青时福尔马林]~FRV暮染性的灭活 福 尔马 林最终 温育 时 间(小 时) 浓度 ( ) 驵 刺 24 30 36 I42 48 60 } 72 I 96 l ++ !+++ I + 0．05 2 +++ I+++ +++ ++ +++ 。十++ I+++ l + + + 一 + + + 一 0．075 2 l + I一 一 I— I一 0．1 2 j I + + 十 『 + 十 + ++ + 未传 代 ， 即同检测 到病 毒 ， + + 第 一扶盲 传后 ， 检测 到病 毒， + 第二 次盲传 后 ，检 测到病 毒， 一 三 次传 代 均束 发现病 毒。 下 各表 同。 二、灭 活病 毒的免疫原性 用 滴度为10 TCID 。／ml的FR一854病毒按 以上能 使病毒感染性失 活的 8种灭话方法 制备细胞培养灭活疫苗后免疫草鱼的结果 表明t41017(0．1 的福尔马 林4℃灭活l7天，见 表 4， 以下 同 )能 使草鱼获得较 高的免 疫保护力 E91．6士11．8(2)％]※，其次是20203，4209， 维普资讯 http://www.cqvip.com
饔2.20℃育时福尔马林对FRV惑染性的灭活 福尔马林最终 温育时间(天) 浓度(%) 组别 3 5 0.075 ++|+++|+++ 1+++++++++|+ +十+|+++ +++|+++ 0.15 0.2 4℃温育时福尔马林对FRⅤ感性的灭活 尔马林最 温育时间(天) 终浓度(%)别1 4587|8|。101212656 +-!++十+++++++++|++ +1+十++十 0,1521 0.2 2 十++十 32754,41512,20154,321042,2010641017的血清中和抗体效价也相应较高[1497士0(2)1派 ※;其次是32754,41512,20203,4209,20154,321042,20106。 Fuzzy综合评判的结果揭 示,能较好地保护灭活病蒜免疫原性的灭活方法为41017,再依次为3275420203,41512等 (表4)。 按表4中D(x1)值排列最前的四种灭活方法制备的细胞培养灭活疫苗后(病毒灭活前滴 度为103.TCID/m1)同时免疫一龄草鱼,试验结果进一步表明,41017和35754,制备的 疫苗免疫原性较坏,它们的免疫保护力和血清中和抗体效价分别为92.9%,93.3%和2517, ※免疫保护力=(1-试验组死亡率 亡率x10 米米血清中和抗体提价:能保护50%的细胞不产生病变的最终血清稀释旷的倒数
囊2． 2O℃薯育时幅尔马林对FRV感豢性的灭活 福 尔马 林最终 浓度 {％) 组剐 I 一 一 l 1 2 温育 时问 (天) 囊5． 4℃沮育时辐尔马嚣对FRV感染性的灭活 终浓度(％) l 2 8I4 5 6 7 8 9l1011I1212[1415i1ol71 1一 + + + + + ’+ + + + + + + + ++ ++ +{ + + 一 。．1 正 +++一+++’小 +++++++l++++++一+++1+十 T lj ++ + + +I+ 一．一一I l I 0．I5 2I I ++{+ + +l+I一一I l 1 1 + + 一 一 l_一— 1— I l 0．2 2 —1一 一 一 一i 32754， 41512，20154，321042，20106‘41O17的 血 清 中 和 抗 体效 价 也 相 应 较 高 [149·7士 0(2)J ※{其次是3274，41512．20203，4209，20154，321042，20106 Fuzzy综台评 判的结果 揭 示，能较好地保护灭活病毒 免疫 晤性的 灭活方法为41017,再依次为32754，20203，41512寻 (表 4 )。 按表 4OD(x，)值排列最前的四种灭活方法制备的细胞培养灭活疫 苗后 (病毒灭活前滴 度为10．sTcID 。／m1)同时免疫一龄 草鱼 ，试 验结果 进一步表明 ，41017和 35754，制备的 疫 苗 免疫 原性 较 坏 ， 它 们 的 免 疫 保 护 力 和 血 清 中 和 抗 体 效 价 分 别 为 92．9％ ，93．3 和 251．7， ※免疫保护力=(一专 曩嚣 ) 。 ※ ※血 清 中和抗 体提 价， 能保护50 的细 胞不产 生病 变 的最终 血 清稀释 的倒数 。 j 一 二小一 维普资讯 http://www.cqvip.com
衰4.各种灭活方法灭活的FR免疫原性的比敦 灭括方法 每组试 血清中和合评价 代号温度桶尔马树温育时 存活率(%)免疫保护力(%) D(xtH t)浓度(%)间(天 验尾数 抗体效阶 序 4101 40,10 413240.15121150010.3:1.90090.6 4209 40.20942/15085.1±5.4(2)82.9±7.,(,170.±95.6(2)|0.634 20106 200.10 6100/45 500土71(2)33.5土13,2(2) 14。1 0.2748 20|0。15 78/50 80.7±0,9(2)67.9±0,8(2)699±11,0(2)0.6036 202032800.01.368/50195,0±71(2):91,4±1,6(2)|8:,6±9,2(2)'0.,734'8 32754 100/3080.0±14.I(2)76.0=10,1(2)143,4=24,8(2),0,7912 31042320.07542(小58/3056.1±22.8(2):52.1=20.5(2)66.8±6.9(2)104577 100/91/80/ 对照 7.8±17.9(6 16.2土I4.2(6) 100/116/150 ※偵均±标准差(试验组数 2299:而20203与41512则稍差,二者分别只有8,7%799%和111.0。通过 Fuzzy综合评 判、它们的D(x)值分别为0.96,0,92,0,67、0,64.其顺序仍与上面的结总相同 讨论 1.鱼类病毒灭活疼苗常用福尔马林和B一丙酰内酯作为灭活剂。但因B一丙酰内熙对人 有致癌作用( Nishimura ct a11985),故福尔马林使用更普遍福尔马林能通过还原作 用,使病毒感染性蛋白失活,而又能在一定程度上保护它的抗原性。影响福尔马林灭活效率 的主要因素有浓度,温度及灭活的时间。从我们的试验可以看出:在同一温度下,福尔马林 的浓度较高、使病毒完全灭活所需时间就较短:而在同一福尔马林浓度下,要完全灭活病毒, 较高的温度则只需较短灭活时间,这一结果与对传染性胰脏坏死病病毒(IP丶1的灭活情 况基本相同,用1:4000(0.025%)的福尔马林4℃,14天未能使IPN灭活( Mackelvie& Desautels,1975),而用1:200(0,5%)福尔马林在同一温度下使其完全失活只需24小时 ( Hill et al.,1981),在35℃温育时用0.3%的福尔马林使IPN失活却只要2小时(Sar etal.,1981)。由此孴来,要缩短病毒灭活的时间,可以当地提髙福尔马林的浓度或灭活 的温度;相反,要想通过降低捅尔马林的浓度或灭活的温度减少病保护性抗原的损失也 可适当延长病毒灭活的时间而达到灭活病毒的目的。 国内在研究草鱼出血病组织浆灭活疫苗付,有的学者指出采用.073.0和010的福尔马 林32℃经72小时的灭活均能使病原失去感染的能力(高汉姣等,1980),这与我们研究的结 果有所区别。我们的试验结果指出、在32“C时采用0,075%的福尔马林要纯FRV完全灭活需
代 号 裹4． 各种灭活方法灭活的FRV免疫最性的比较 93．5±9．8(2)※91．6l】-8(2)l1～49．—；0f l0：五il 76．3±19,4(2)I69,3~20．2(2)。120．410．8(2)ro．699]4 85．1~!4(2) -+7 ) 20l5l{ — 0．1 20203 20 0．20 32754 32i0．10 323042 3210．075 4 78／50 8 f 6&／50 4 1 ]oo／3o 4 时 2 ) (小 58／so 80．7±0．9(2)I67．9±0．8(2) 69．9±11．0(2’ 0．274 8 0．603 6 95．0± 7．1{2) 91．4± l1．6(2) 82．6± 9．2(2) 0．734 3 +14．1f2)l7—6．0~10． z ： i 一 ．1～22．8( i 20．5 1—66．836 ，0．457。 i100／91／80／I 1 I I I ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ．对． ． ． ． ． ． ． ． 照． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． j l．．1．0．．0。／．．1．．16．．／．．】．5．0．．．1．．7．．．8．．~．．．1．7．．．．．9．(．．6．)．．1．．．．．．．．．．．．。．．．．．．．．．．1．．6．．．2一~1,—1．．2—(—6．)．J l．．．．．．-I_ ※ 值均 ±标 准差 (试 验组敬 )。 229．9；而2帕03与41512则稍差 ，二 者分别只有8 ．7 ，79．g 和111．0 通过 F1Izzy综台评 判，它们的D(x)值分别为O．96，0．92，0．67， 0．64，其 顺序仍 与上 面的结 总相 同。 讨 论 1．鱼类病毒灭活疫苗 常用福尔 马林 和B一丙酰 内酯 作为灭活 剂。 但因B一丙酰内酿对人 有致癌作用 (Nishimuracta1．，1985)，故福尔 马林 睫喟更普 遍。福尔 马林能通过还 原作 用，使病毒感染性 蛋 白失活 ，而 又能 在一 定程度上 保护它的抗原性。影响福尔 马林灭活 效率 的主要因素有浓度，温度 及灭 活的时间。从我们的试验 可 看 出；在 同一温度下，福尔 马林 的浓度较 高， 使病毒 完全灭 话所 需时 间就较短 t而在 同一福尔马 林浓度下 ，要完 全灭 活病 毒， 较高的温度则只需较短灭活时间，这一结果 与对传染性胰脏坏死病病 毒 (1Pl＼V1的灭活情 况 基本 相 同 ， 用 1：4000(0．025％)的福 尔 马 林 4oC， 14天 未 能 使 IPNV灭 活 (M ackeivie & Desautels，I975)，而 用1：200(0．5 )的福尔马林在 同一温 度下 使 其完 全先 活只需24／b~,J" (I{jIIeta1．，198I)，在35oC温育 时用0．3％的福尔 马林使IPNV失活却只 要2小时 (SatO eta1．，1981)。 由此看 来，要缩短病毒灭活 的时间，可 适 当地提高福尔马# 的浓度或灭 活 的温度 ；相反，要想通过降低福尔 马林的浓度或灭活的温 度减少病毒 保护性 抗原的损失 ，也 可适 当延长病毒 灭活的时间而 达到灭活 病毒的 目的。 国内在 研究草鱼出血 病组织浆灭活疫苗 有的学 昔指 出采 用0．075 和0。] 的福尔马 林32℃经72,'Nt~的灭 活均能 使病原失 去感染 的能力 (高汉 姣等 ，1980)，这 与我们研究的结 果有所区别。我们的试验结果指 出，在32。C时采用0．075 的福尔 马林 要使FRV完 全灭活 需 14 维普资讯 http://www.cqvip.com
小时,而n1°的福尔马林则只要12小时。出现这种差异的原因是二者检定是否灭活方法 不同ⅲ致:前通过鱼体,后者采们敏感细胞,并通过二次盲传来排除病对细胞隐性感染 的可能,我们认为通过鱼体感染试验半检定病毒是否灭活是不够准确的。因为尚未完全灭活 的残余病毒能仅可能导致鱼体的隐性感染而不显症状,丽且还可能被鱼体内存在的少量的相 应抗体所中和、因而会造成尚未完全灭活的病毒当成已完全灭活的假象。如果片面强调安 全,又会产生因灭活时间太长而使病毒的免疫原性损失太大,从而降招寝苗效价的后果。我 们认为通过敏感细胞来捡定病毒是弱灭活可以避兔以上痹病,获得比在准确的结果。国外学 者在研究IN和HN灭活疫苗时也基本上采用这种检定方法( Dixon&Hi1983: Nishimura 2.最佳的灭活∫法,应该既能使病毒的感染性蛋白完全失活,又能使它的免疫愿性损 失最小,从而使疢苗达到安全和高效的目的( Dixon&Hi,1983)。因此注重免原性 在灭活过程中的损失程度是决定最佳灭活方法的一个不容忽视的方面,我们用鱼体免疫试验 来测定灭活疫苗的免疫原性,并且选用了免疫保护力和血清中和抗体效价两个衡量疫苗兔疫 原性大小的指标,同时我们通过 Fuzzy综合评判法对二者统等考虑,并使前者的重要性稍大 于后者(给二者平均数的权值分别为0.5和04)。根据试验结果,我们认为采用0.1%的福 尔马林4“℃温育1了天是最佳的灭活方法,用075%的福尔马林32°C温育4天效果也较好,此 外,若采用的0,29福尔马林20°C温育3天或者015%的福尔马林4°C温育12天也能使灭活 疫苗的兔疫原性损失较小。在生产过程中,我们可根据实际情况对以上灭活方法进行造择。 3.根据表4的结果,我们发现温育温度为4°C时,福尔马林的浓度较高,D4x1)值競 较小,这告诉我们在此温育温度下温度对免疫原性的影响小:温育温度为20°C,温育时间较 长。D(x1)值则较小,这表明此时温度较福尔马林浓度对免疫原性的损失大,在该温度下温 育时间的长短就成了影响免疫原性的主要因素;温育温度为32°C,则出现了用0,19的福尔写 林温育42小时的FRV的免疫原性招F0.75%的福尔马汴温育4天的现象。由此,我们认为 福尔马沐的浓度与温育温度之间的关系对灭活疫苗的免疫原性的影响是很复杂的,低温灭活 或低浓度福尔马林灭活的方法并非都是能使免疫原性损失较少的最佳灭活方法,因此进一步 研究它们之间的关系,则有曲指导各种灭活疫苗灭活方法的研完,为制造出效价较高的灭 活疫苗提供理论依据。 4.从表4我们可以看到,各种灭活方法所制备的细胞培养灭活疫苗对草鱼均育免疫保 护作用,其存舌率和血清中和抗体效价均显著高于对照组(P均小于0U1J,这筑进一步说 明用草鱼出血病细胞培养灭疫苗预防草鱼出血病是很有希望的
96小!l，而 0。1 的 樯尔 马林 则只 要42小时。出 现这 种差 异 的 原因是二者 检 定是否灭活方法 不 同而 致：前 者通过鱼体，后者采 lffj敏感细胞 ，井通 过二次盲传 来排 除病 毒对细胞隐性 感染 的 可能 ，我们认为通过鱼体感染试验来检 定病毒是 否灭活是不够 准确的。因为尚未完全灭活 的 残 余 病 毒能 仅 可能 导 致 鱼 体 的 隐性 感 染 而 不 显 症 状 ，而 且还 可能 被 鱼 体 内 存在 的少 量 的 相 应抗 体所 中和，因而 会造成 尚未完 全灭活的病毒 当成 已完全灭 活的假 象。如果 片面 强调 安 全，又会产 生 固灭活时间太长而 使病毒 的免疫原性损 失太大，从而 降招疫 苗效价的后果。我 们认为通过敏感细胞 来检 窟病毒是弱灭活 可蹦避免 以上痹 病，获得 比在准 确的结果 。国外学 者在 研究IIN和IHN灭活疫苗时 也基本 上采 用这 种检 定方法(Dixon＆ Hill，1983；Nishrnkl1-a et a1．， jg85) 2．昂佳的灭 活方法，应该 既能受病毒的感染性 蛋 白完全 失活，又能使它的 免疫 原性 损 失 最 小 ， 从 而 使疫 苗 达 到 安 全 和 高 效 的 目 的 (Dixon ＆ Hill， 1983)。 因此 注重 免 疫 原性 在灭活过程中的损失程度 是决 定最佳 灭活方 法的一个 不容忽视的方面 ，我 们用鱼体 免疫 试验 来 i剽定灭 活疫 苗的 免疫 碌性 ，并 选 用 了 免疫 保护 力 和 血 清 中 和 抗 体 效 价 两 个 衡 量疫 苗 免 疫 原性大 小的指标， 同时我 们通过Fazzy综 合评判法对二 者统筹考虑 ，井 捷前者的重要 性稍大 于后 者 (给 =者平均 数的 权值分别 为0．5和0．4)。根据试 验结 果 ，我们认为 采用0．1 的福 尔马林4。c温育 17天是 最佳 的灭活方法，用0．75 的福尔 马林32。c温 育 4天效果也较好，此 外，若采 用的o．2 福尔马林20c温育 3天或者o．15 的福 尔马 林4。C温育12天也能使灭 活 疫苗 的免疫原性 损失较 小。在生产过程 中，我 们可根 据实际情 况对 以上灭 活方法 进行选择。 3． 根据表 4的结果，我们 发现温育温度为4。C时，福尔马林 的 浓 度较 高，D(x，)值就 较 小， 这 告 诉 我 们f隹 此温 育 温 度下 温 度 对免 疫 原性 的 影 响小 ；温 育 温 度 为 2O。C，温 育 时 间较 长。D(xr)值则较小 ．这 表明此 时温度较福尔 马林浓度 对免疫 原性 的损 失 大 ，在该 温度下温 育时 闯的 长短 就成 了影响免疫原性的主 要因素 ；温育 温度为32。C，则出 现了用0．1 的福尔 马 林 温育42小 时的FRV的免疫 嗄性招 于0．75 的福 尔马林 温 育 4天的现 象。 由此，我 们认为 福尔 马捌：的浓度 与温 育温度之间的关系 对灭 活疫苗的 免疫 原性 的影响是很复杂 的，低温灭活 或低浓度福尔马林灭 活的方 法并非都是拖 艇免疫原性损 失较 少的最佳灭 活方法， 因此 进一步 研究 它 ll'1之间 的关 系 ，则 有 指导 各 种灭 活疫 苗 灭 晒方 法的 研究 ，为 铷造 出 效 价 较 高的 灭 活疫苗提供理论依据 。 4．从 表 4我 们可以看到． 各种灭 活方法所 捌 备盼细胞 培养灭 活疫苗对草鱼均 有免疫缳 护 怍甩，其存 墙率 和血 青中 和抗体效价均显著 高于对照组 (P均 小于0．01'，这就 进 一步说 明用 唪鱼出 血病细胞培养灭 ．疫苗预防草鱼 出 病是 很有希 望的。 15 维普资讯 http://www.cqvip.com