1998,32(4):9~12/叶筲平等 中国兽药杂志 Comparison of the Selective Culture Mediums of Aeromonas Hydrophila LING Hongli, LU Chengping * CHEN Huaiqing, MA Xiangdong College of Veterinary Medicine, Naniing Agriculture University Nanjing 210095 Abstract Each of the 121 Aeromonas hydrophila strains were cultured on each of the three selective mediums. AHM ( Aeromonas hydrophila Medium ) APM Aeromonas Pyrazinamidase Activity Medium)and RS(Rimler-Shotts Medium). The rate of detection by the three mediums was 54.,. 33% and 83. 54% respectively. The strains whose xidase were positive in AhM or RS may be preliminaryly identified as Ah. AHM and Rs ere recommended for identification of Ah strains from clinic samples key words Aeromonas hydrophila, Selective cultures, Comparison 草鱼出血病细胞培养灭活疫苗生产工艺的比较 雪平杨广智。罗毅志曹铮 浙江省淡水水产研究所,翻州313001 收稿日期:1998-03-02 233, Iq 摘妟比较了方瓶静置培养、10×20oml转管培细胞疫苗工厂化生 这的.组过几 养和细胞生物反应器做载体培养3种方法增殖细胞种生产工艺的比较研究,认为细胞生物反应 和病毒的效率,以细胞生物反应器傲载体培养法的器微载体悬浮培养增殖细胞和病毒作为疫苗 效率最高,与静置培养法相比,单位培养液细胞堆生产工艺具有明显优势。现将研充方法和结 殖量提高20~25倍,病毒增殖量TCID2o测定增加果报道如下。 1.65时数值LD测定增加145对数值。经济效益 比较,疫苗削备的培养液成本,以细胞生物反应器激 1材料和方法 载体培养法最低。已研究出以细胞生物反应器嫩戴1.1细胞和病毒采用本所建立的草鱼吻 体培养法增殖细驰和瘸毒为基本生产工艺的工厂化端组织细胞株ZC-7901和草鱼胚胎细胞CP 生产草鱼出血病细胞疫苗工艺流程 细胞株由本所建株并保存)。草鱼出血病 关词草鱼出血细胞疫生产工艺 病毒株为本所筛选的ZV-8909(由本所鉴定 和保管)。以适应培养法培养和增殖病毒口 草鱼出血病是我国淡水渔业中危害严重1.2培养液和维持液细胞生长的培养液 的病毒性鱼病,我国从70年代开始,相继研为添加10%小牛血清的199培养液,内含 究成功草鱼出血病组织疫苗和细胞疫苗免疫100uU/ml青霉素和100g/m1链霉素,pH7 防治草鱼出血病,在生产上收到了较好的效4~7.6。微载体悬浮培养液的维持液为含 果全国各地普遍推广应用。我们在建立敏感2%~5%小牛血清的培养液,其余同静置培 细胞株和筛选出免变原性强的毒株以及实验养的维持液 室制备细胞疫黄获得成功的基础上进行了1.3方瓶静置培养采用200ml玻璃方
1998，32(4)：9～12／叶雪 平等 中国兽药杂志 ·9· Comparison oftheSelectiveCultureMediumsofAeromonasHydrophila LING Hongli．LU Chengping ，CHEN Huaiqing，M A Xiangdong C~llegeofVeteriaaryMedicine·NanjingAgricultureUniversity·Nanjing210095 Abstract Eachofthe 121Aeromonas drophila strainswere cuhured on each ofthethree selective mediums． AHM (Aeromonas hydrophila M edium ) ， APM (Aeromonas PyrazinamidaseActivityMedium)andRS(Rimler—ShottsM edium )．Therateofdetectionby the three mediums was 54．76 ，81．33 and 83．54 respectively．The strains whose oxidase were positive in AHM orRS may be preliminaryly identified as Ah．AH M and RS wererecom mended foridentification ofAh strainsfrom clinicsam ples． keY words Aeromonas^vdrophila，Selectivecultures，Comparison * Correspondk~ author 摘 草鱼出血病细胞培养灭活疫苗生产工艺的比较 养和 细胞生物反应器徽载体培 养 3种方 法增殖细 胞 和痛 毒 的效率 ，以细胞 生物反 应器徽 载体培 养法 的 效 率最高，与静 置培 养法相 比较 ，单位 培养液细 胞增 殖量 提 高 20～25倍 ，痛 毒增殖 量 TCID 测 定增 加 1．65对数值 ，LD 测定 增加 1．45对数值 。经济效益 比较 ．疫 苗制 备的培 养液咸丰 ，以细胞生物反应 器徽 载体 培养法最低。 已研 宽出以细胞 生物反应器馓 载 体培 养法增殖细胞和病毒为基丰 生产 工艺 的工厂化 草鱼出血病是我国淡水渔业中危害严重 的病毒性鱼病，我国从 70年代开始 ，相继研 究成功草鱼出血病组织疫苗和细胞疫苗免疫 防治草鱼出血病 ，在生产上收到 了较好的效 果 ，全国各地普遍推广应用。我们在建立敏感 细胞株和筛选 出免疫原性强的毒株以及实验 室制备细胞疫苗获得成功 的基础上 ，进行 了 I } 。 种 生产工艺的 比较研 究，认为细胞生物反应 器微载体悬浮培养增殖细胞和病毒作为疫苗 生产工艺具有明显优势。现将研究方法和结 果报道如下。 1 材料和方法 1．1 细胞和病毒 采用本所 建立的草鱼 吻 端组织细胞株 ZC一7901和草鱼胚胎细胞 CP一 80(细胞株由本所建株并保存 )。草鱼出血病 病毒株为本所筛选 的 zV一8909(由本所鉴定 和保管 )。以适应培养法培养和增殖病毒 ]。 1．2 培养液和维持液 细胞 生长的培养液 为 添加 l0 小牛 血清 的 199培养 液 ，内含 1001U／ml青霉索和 lO0~g／ml链霉紊，pH7． 4～7．6。微载体 悬浮培养液 的维持液 为含 2 ～5 小牛血清的培养液．其余同静置培 养的维持液。 1．3 方瓶 静置培养 采用 2000ml玻璃方 维普资讯 http://www.cqvip.com
中国兽药杂志 1998,32(4):9~12/叶雪平等 瓶,按常规法静置培养(以下称方瓶法) 表2几种病毒增殖方法的效率比较 1.4转管培养釆用200ml玻璃圆瓶,在 病毒滴度(以对数值表示) AD-1型单细胞旋转培养机上培养(以下称 培养 增殖量 方法 转管法 TClDse LDEa TCIDso LD5o TCIDso LDs 1.5细胞生物反应器微载体悬浮培养釆 方瓢法 75.32.62.3 用NBS细胞生物反应器,以GT2微载体为 转管法 载体(以下称反应器法),浓度为4~5mg/ 反应器法3,753.08.06.754.253.75 ml,细胞接入浓度为30~50万/m细胞吸 从表2可知,上述几种培养方法增殖病 附的后开始搅拌,搅拌速度为4rmn,空毒,以反应器最高与方瓶法相比较病毒滴 气饱和度为40%细胞培养液的pH为68度以 TCID法测定可增加1.65对数值, 70。细胞在微载体上长满单层后,以吸附LDn法测定可增加1.45对数值。 法接入病毒维持液的pH为74~76,第42.3几种疫苗生产工艺的经济效益比较 6d收获病毒。具体方法按文献进行。 以上几种培养方法增殖细胞和病毒后,在相 1.6疫苗的制备和敬价測定按文献所同条件下制备免疫保护率80%以上的细胞 述方法进行 2结果 疫苗,以生产周期、一次生产量、所需培养液 成本(199培养基、小牛血清、抗生素微载体 2.1纽胞增殖方法的效率比较在细胞和等)以及操作条件(包括加液进样、pH调节 培养液相同的条件下,我们比较了方瓶静置等)等指标进行分析比较结果详见表3 培养、旋转管培养和细胞生物反应器微载体 表3几种疫苗制备工艺的经济效益比较 悬浮培养增殖细胞的效率,结果详见表1。 生产1L疫苗所操作 制备工艺 生产量需培养液成本控 表1几种细胞增殖方法的效率比较 方瓶法14~180.3 76.00 人工 细胞生培养液 较静置 方法ym几100,10个)高(数 转管法14~181~1.516.48~23.92人工 反应器法14~1824~309.26~11.18自动 方瓶法002860.30.09512~1540~50 转管法.220 167~200 从表3可知,细胞生物反应器微载体培 反应器法281224960~120800~1000 养法制备疫苗,具有一次生产量大、单位产量 成本低、能自动控制、所化人力较少等优点 从表1可知反应器法增殖细胞,具有细本次实验只使用1,51L的细胞生物反应器 胞生长面积大、消耗的培养液少单位培养液若使用5L或以上的细胞反应器其一次性 细胞产量高的特点较方瓶法提高细胞产量产量可更高。因此以细胞生物反应器微载体 20~25倍。因此细胞生物反应器微载体悬浮培养法为基本生产工艺制备细胞疫苗完全 培养法增殖细胞是一种高效低耗的方法。 符合工厂化生产的要求 22病毒增殖方法的比较以这3种方法24细胞疫苗工厂化生产工艺流程在实 增殖细胞后将ZV8909毒株的病毒液接入验室制备细胞疫苗研究的基础上,应用细胞 细胞,经病毒增殖后,收获病毒培养液,以生物反应器微载体培养法增殖细胞和病毒为 TCIDSD和LD法测定接入前和病毒增殖后基本生产工艺制备细胞疫苗的工厂化生产工 的毒力测定结果列于表2(以对数值表示)。艺流程,以下图1表示
· 10· 中国兽药杂志 1998，32(4)9～12／叶雪平等 瓶 ，按常规法静置培养(以下称方瓶法)。 1．4 转 管培 养 采 用 200ml玻 璃 圆瓶 ，在 AD 1型单细胞旋 转培 养机上培养 (以下称 转管法)L2j。 1．5 细胞 生物 反 应 器微 载体 悬 浮 培 养 采 用 NBS细胞生物反应器 ，以 GT一2徽载体为 载体 (以下 称反应 器 法)，浓 度 为 4～5mg／ ml，细 胞接 入浓 度 为 3O～50万 ／ml。细 胞 吸 附 6h后开始搅拌 ，搅拌速度 为 40r／min，空 气饱和 度为 40 ，细胞培养液 的 pH 为 6．8 ～ 7．0。细 胞在 徽载 体上 长 满单 层后 ，以 吸附 法接入病毒 ．维持液的 pH 为 7．4～7．6，第 4 ～ 6d收获病毒。具体方法按文献“进行。 1．6 疫苗 的制备和数价测定 按文献 所 述 方 法进 行 2 结 果 2．1 细胞增殖方法 的效 率比较 在细胞和 培养液相同的条件下 ，我们比较了方瓶静置 培养、旋转管培养和细胞生物反应器 徽载体 悬浮培养增殖细胞的效率，结 果详见表 1。 表 1 几种细胞增殖方 法的效率 比较 (m)(mZ／L)颦(10十)oM'tl 从表 l可知反应器法增殖细胞 ，具 有细 胞生长面积太、消耗的培养液少 、单位培养液 细胞产量高的特点 ，较方瓶法提 高细胞产量 20~25倍 因此细胞生物反应器徽载体悬浮 培养法增殖细胞是一种高效低耗的方法 。 2．2 病 毒 增 殖 方 法 的 比较 以这 3种方 法 增殖细胞后，将 ZV一8909毒株的病毒液接入 细胞 ，经病 毒增 殖 后 ，收获 病毒 培 养液 ，以 TCIDs。和 LDo法测定接入前和病 毒增 殖后 的毒力，测定结果列于表 2(以对数值表示 )。 表 2 几种病毒 增殖 方法 的效牢 比较 病 毒滴 度(以对数值表示) _二 二_ TCID~0LDE0TCID5。L 0TCID50Lifo 方 瓶}击 31 3．O 5．7 5．3 2．6 23 转管法 31 30 6．5 58 3．4 2．8 反 应 器 法 3 75 3 0 8．0 675 4．25 3．75 从表 2可知，上述几种培养方法增殖病 毒 ，以反应器最高，与方瓶法相 比较 ，病毒滴 度 以 TCID。法 测定 可 增 加 1．65对 数 值 ， LD5。法测定可增加 1_45对数值。 2．3 几种疫苗 生产工艺的经济效 益比较 以上几种培养方 法增殖细胞和病毒后 ，在相 同条件下制 备免疫保 护率 8O 以上的细胞 疫苗 ，以生产周期 、一次生产量 、所需培养液 成本(199培养基、小牛血清、抗 生素、徽载体 等)以及操作 条件(包括 加液、进样、pH 调节 等)等指标进行分析比较 ，结果详见表 3。 表 3 几种疫苗制备工艺的经济效益比较 从表 3可知 ，细胞生物反应 器微载体培 养法制备疫苗 ，具有一次生产量大 、单位产量 成本 低、能 自动控制、所化人力较 少等优 点 本次实验只使 用 1．5L的细胞生物反应器 ， 若使 用 5L或以上的细胞反应 器，其一次性 产量可更高 。因此以细胞生物反应器微载体 培养法为基本 生产工艺制备细胞疫苗 ，完全 符合工厂化生产的要求。 2．4 细胞疫苗工厂化生产工 艺流程 在实 验室制备细胞疫苗研究的基础上，应用细胞 生物反应器微载体培养法增殖细胞和病毒为 基本生产工艺制备细胞疫苗的工 厂化生产工 艺流程 ，以下图 1表示 。 维普资讯 http://www.cqvip.com
199832(4):9~12/叶雪平等 中国兽药杂志 ·11 ZC-7901或CP80细胞病毒株ZV-8909 快、物质消耗低污染机会少,同时还具有容 量大、自动化程度高的将点,从而能满足工厂 细胞瓶静止传代培养 在ZC-7901或CP80 化生产的要求 细胞中吸附培养 通过3种生产草鱼出血病细胞疫苗的方 旋转管扩大培养细胞 在ZC-790或CP80 法比较,结果显示,细胞生物反应器微载体培 细胞中适应培养 养法不仅产量高,而且成本低,表现出其在草 鱼出血病细胞疫苗生产中的优越性。有资料 细胞生物反应器增殖细胞旋转管扩大培养病毒表明,在医学和兽医学方面国外应用细胞生 细胞生物反应器增殖病毒一收获病毒测定毒力 物反应器增殖动物细胞进行了较多的研究, 并已用于各类疫苗、干扰素、单克隆抗体等生 收获病毒并测定毒力 物制品的工厂化生产。国内这方面的研究和 应用也有了较快的发展,但尚无用于鱼类细 福尔马林灭活;加佐剂和增效剂 胞培养和疫苗生产的报道。目前,我国已有国 产的生物反应器和微载体因此应用细胞生 检验(无菌性、安全性、保护率测定 物反应器工厂化生产草鱼出血病细胞疫苗有 分装4C保存 着良好的发展前景 图1细胞疫苗工厂化生产工艺流程图 参考文献 张念慈,杨广智,草鱼出血病病毒在ZC-7901细胞株 讨论 中适应培养及其病毒培养物的某些生物特性,鱼病简 细胞疫苗制备工艺主要有方瓶静置培养 讯,1986(2) 2曹铮,沈锦玉,罗毅志等,鱼类细胞的旋转管培养法 法、旋转管培养法、多表面繁殖器、塑料螺旋 管转瓶法、毛细管繁殖器、悬浮培养法以及细3叶雪平杨广智,罗毅志等.细胞生物反应器大规櫚培 胞生物反应器微载体培养法。其中细胞生物 养草鱼细胞和病毒,水产学报、1992.第16卷第1期 反应器微载体培养法是近期发展起来的先进 杨广智张念慈,叶雪平等,草鱼出血病细胞疫苗制备 技术。由于该技术具有细胞生长面积大、速度 技术研究.鱼病简讯,199041 Studies on Technology of Grass Carp Haemorrhage Inactive Vaccine Production YE Xueping, YANG Guangzhi, LUO Yizhi, CHAO zhen Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries, Huzhou 313001 Abstract Studies had been conducted on comparing the efficiency of cell and virus multiplicaion by three culture methods, stationary culture in normal culture flasks, rotating culture in 200ml columned culture flasks and microcarrier suspension culture in bio-reactor Results showed that the last method was most eff Its cell multiplication per unit liquid ulture media was 20 to 25 times. virus reproduction assessed by TCIDso 1.65 common logarithm values and by LDso 1. 45 common logarithm values more than those of the first method. Economically, the cost of liquid culture media for the vaccine prepared by the third
1998，32(4)：9～12／叶雪平 等 中国兽 药杂志 zc一7901或 CP80细胞 t 细胞瓶静止 传代培 养 旋转管扩大 培养细胞 病毒株 zv 8909 在 ZC一7901或 CP 80 细胞中吸附培养 在 ZC 790或 CP一80 细胞 中适应培 养 细胞生物反应器增殖细胞 旋转管扩大培养病毒 ‘ 细胞生物反应器增殖病毒一—— 收获病 毒、测定毒力 ‘ 一收获病毒井测定毒力 福尔马林灭 活}加佐剂和增效荆 检验 (无菌性 、安全性 、保护率测 定) + 分装 4c保存 囝 1 细胞疫苗工厂化生产工艺流程囝 3 讨 论 细胞疫苗制备工艺主要有方瓶静置培养 法、旋转管培养法 、多表面繁殖器、塑料螺旋 管转瓶法、毛细管 繁殖器、悬浮培养法以及细 胞生物反应器微载体培养法 其中细胞生物 反应器微载体培养法是近期发展起来的先进 技术 由于该技术具有细胞生长面积太、速度 快 、物质消耗低 、污染机会少 ，同时还具 有容 量大、自动化程度高 的特点 ，从而能满足工厂 化生产的要求 通过 3种生产草鱼出血病细胞疫苗的方 法 比较 ，结果显示 ，细胞生物反应器微载体培 养法不仅产量高 ，而且成本低，表现出其在草 鱼 出血病细胞疫苗生产中的优越性 。有资料 表明，在医学和兽医学方面 ，国外应用细胞生 物 反应器增殖动物细胞进行了较多 的研究 ， 并 已用于各类疫苗 、干扰素、单克隆抗体等生 物制品的工厂化生产 。国内这方面的研究和 应用也有了较快 的发展 ，但 尚无用于鱼类细 胞培养和疫苗生产的报道 目前 ，我国 已有国 产的生物 反应器和微载体 ，因此应用细胞生 物反应器工 厂化生产草鱼出血病细胞疫苗有 着良好的发展前景。 参考 文献 1 张 忠慈，扬广智 草 鱼出血病病 毒在 ZC 7901细 胞株 中适 应培养及其病 毒培养物 的某些 生物特性．鱼病 简 讯 ，1986(2／ 2 曹 铮，沈锦 玉．罗毅志 等．鱼类 细胞 的旋 转管培 养 法． 鱼病简讯 、1988(1) 3 叶雪 平 ，扬广 智 ，罗毅志等 细胞生物 反应器 大规模培 养草鱼细胞和 病毒 水产学报．1992，第 l6卷 第 1期 4 扬广智 ，张念慈 ．叶雪 平等 ．草 鱼出血病 细胞 疫苗制备 技术研 究 鱼病简讯 ，1996(11 Studieson TechnologyofGrassCarp H aem orrhage Inactive Vaceine Production YE Xueping，YANG Guangzhi，LUO Yizhi，CHA0 zhen Z iang Institute ofFreshwaterFisheries．H uzhou 313001 Abstract Studies had been conducted on comparing the efficiency of eell and virus muhiplicaion bythreeculturemethods，stationarycultureinnormalcultureflasks，rotating culture in 200mlpolumned cultureflasksand microcarriersuspension culture in bio—reactor． Resuhsshowed thatthelastmethod Ⅳasmostefficient． Itscellmultiplication perunltliquid culture m edia was 20 to 25 times， virus reproduction assessed by TCID50 1．65 comm on logarithm values and by LD 1 45 comm on logarithm values m ore than those ofthe first m ethod．Econom ically，thecostofliquidculturemediaforthevaccinepreparedby thethird 维普资讯 http://www.cqvip.com
·12· 中国兽药杂志 1998,32(4):12~14/吴佩玲等 method was the least. The work proccess for Grass carp haemorrhage cell vaccine production in a big scale was developed based on the principle production technology of microcarrier suspention culture in bio-reacter to multiplicate cells and reproduct viruses. Key words Grass carp haemorrhage, Cell vaccine, Production technology 盐酸林可霉素-盐酸环丙沙星复方制剂含量测定方法研究 吴佩玲欧阳林山 中国善药监察所,北京100081 收稿日期:1998-05-04 摘要用高效液相色谱法及紫外分光光度法分别2测定方法及亲件 测定盐酸林可蓦素、盐酸环丙沙星的合量,结果表2.1盐酸林可霉素 明,线性关系良好,回收率满意,适用于该产品的含2.1.1条件C1柱(5μm,4.6m×150mm); 量測定。 硼砂液(0.05mol/L,用85%磷酸调pH值至 关鬟词盐酿林可素,茧晚环丙沙星+高效液相6.0)-甲醇=3:7为流动相检测波长 色港;紫外分光光度法 1 3/14m:分离度符合要求,理论塔板数林可 莓素峰计箅应不低于1500 盐酸林可霉素为大环内酯类抗生素,主21.2方法取样品适量精密称定,用流 要对革兰氏阳性菌有效:盐酸环丙沙星为动相制成每1ml约含林可霉素1mg的溶液, 代喹诺酮药物,对革兰氏阴性菌疗效较好该充分搅拌静置,精密量取上清液10山,注入 复方制剂经临床试验证明,对金黄色葡萄球液相色谱仅,记录色谱图;另取林可霉素标准 菌与大肠杆菌的抗菌力及抗菌谱均优于单方品适量同法测定。按外标法以峰面积计算, 制剂。 即得,见图1。盐酸林可霉素保留时间为 该制剂中两种原料的含量测定方法已收4.06mn。盐酸环丙沙星保留时间为 载于《中国兽药典》和《兽药质量标准》210.13min 中,而复方制剂的含量测定方法迄今未见报 道,本文介绍用高效液相色谱法测定盐酸林 可霉素(,用分光光度法测定盐酸环丙沙星 的方法 1仪器与材料 1.1仪器日本岛津UV300分光光度计; 日本岛津LC-6A高效液相色谱仪。 1.2材料盐酸环丙沙星对照品由研制单 图1高效液相色谱图 位提供盐酸林可霉素标准品由中国药品生 礁.盐酸环丙沙垦b.盐酸林可霉素 物制品检定所提供,盐酸林可霉素盐酸环丙 c.盐酸林可霉素-盐酸环丙沙星复方制剂 沙星可溶性粉及原料由研制单位提供,所用 试剂均为分析纯和光谱纯。 2.1.3标准曲线精密吸取标准品溶液6
·12· 中国兽药杂志 1998，32(4)：12～14／吴氟玲等 meth0dwastheleast．Thework proccessforGrasscarp haemorrhagecellvaccineproduction in a big scale was developed based on theprinciple production technology ofmicrocarrier suspention culturein bio—reacterto m ultiplicatecellsand reproductviTuses． Key wordsGrasscarp haemorrhage，Cellvaccine，Production technology 盐酸林可霉素一盐酸环丙沙星复方制剂含量测定方法研究 测定盐酸林可霉素、盐酸环丙沙星的含量，结果袭 2．1 盐酸林 可霉素 明，线性关系良好一回收率满意一适用于该产品的旨 2．1．1 条件 C1日柱 (5 m，4．6m ×150mm)} 量测定 。 硼砂液 (0．05mol／L，用 85 磷 酸调 pH值至 关键调 苎墼苎要茎重，苎壁!要 ·高效液相 6．0)一甲醇=3t7为流动相，检测波长 色谱，紫外分光光度法 磊 竹 7别吊 214nm；分离度符合要求；理论塔板数按林可 1 ， ／＼ 霉索峰计算应不低于1500。 盐 酸林可霉素为大环 内酯类抗生素：主 2． 1．2 方法 取样品适量 ，精 密称定 ，用流 要对革 兰氏阳性菌有效 ；盐酸环丙沙星为氟 动相制成每 lml约含林 可霉素 lrag的溶液 ， 代喹诺酮药物 ，对革兰氏阴性菌疗效较好 ·该 充分搅拌 ，静置 ，精密量取上 清液 1 l，注入 复方制剂经 临床试验证 明 ，对金黄色葡萄球 液相色谱仪． 记录色谱图 }另取林可霉紊标准 菌与大肠杆菌的抗菌力及抗菌谱均优于单方 品适量，同法测定。 按外标法以峰面积计算， 制剂。 即得 ，见 图 1。 盐 酸 林 可 霉 素 保 留时 间 为 该制剂 中两种原料的含量测定方法已收 4．06min。 盐 酸 环 丙 沙 星 保 留 时 间 为 载于《中国兽药典 》 和 《兽 药质 量标准 》 10．13mln 维普资讯 http://www.cqvip.com
