《草鱼出血病》草鱼出血病细胞培养灭活疫苗的研究：疫苗的稳定性及佐剂和加强...

2 第17卷第1期 水生生物学报 vo.17,Na.1 1993年3月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA 1993 草鱼出血病细胞培养灭活疫苗的研究: 疫苗的稳定性及佐剂和加强免疫 对草鱼免疫应答的影响* 杨先乐左文功 〔长江水产研充所沙43400) 74317 cFRⅴ疫苗具有较好的稳定性c4℃保存8个月其免疫保护力仍为83.6%、草鱼免疫后 的血清中和抗体效价为119.2土8.8(2),与保存开始时相比,没有显著的差别。28℃保存d,其 免疫原性也基本上保持在原来的水平。CFRⅤ疫苗在此两温度下的免疫有效期分别为8个月 和8d。不完全弗氏佐剂对cFRⅴ疫苗有明显的增效作用;用cFRⅤ疫苗对草鱼进行加强免 疫,可明显地增强草鱼对该疫苗的免疫应答由此证明草鱼具有免疫回忆反应。 关键询 细胞培养灭活疫苗·稳定性,佐剂,加强免疫 草鱼( Ctenopharyngodon idella C.etv.)出血病细胞培养灭活疫苗(以下简称 CFRⅴ疫苗)是预防草鱼出血病的途径之一,目前已对它的免疫原性、有效免疫剂量、灭活 方法、种株保藏及生产性试验的免疫效果进行了研究和探讨3,为其应用提供了一定的 理论和实践依据。 疫苗的稳定性是疫苗的一个重要特性,鱼用疫苗在这方面的研究、国内外鲜有报道。 佐剂对鱼类免疫应答的影响,至今尚有争议。加强免疫能否增强鱼类的免疫应答水平 也有不同的意见。CFRV疫苗与佐剂共同使用及CFRV疫苗加强免疫对草鱼免疫应 答的影响,国内外均未涉及。鉴此,作者对CFRⅴ疫苗4℃和28℃保存时的稳定性进行 了研究,对不完全弗氏佐剂与氢氧化铝凝胶佐剂能否增强CFRV疫苗的免疫效果进行了 探讨,并通过该疫苗对草鱼的加强免疫试验,对草鱼免疫应答水平的变化进行了初步的研 材料和方法 疫苗用疫苗株FR-854作为种株制备CFRV疫苗,其制备、检定和效价测定参 照报道的方法进行。 本文承卫生部上海生物制品研究所研宪员焦永真先生审阅并提出宝贵意见谨此致谢 1990年B月6日收到

[2^ ，一 第 17卷 第 l期 1993 年 3 月 水 生 生 物 学 报 A CTA H YDRO BIOLO G ICA SIN ICA 草鱼 出血病细胞培 养灭 活疫苗 的研 究 ： 疫 苗 的 稳定 性 及 佐 剂 和 加 强免 疫 对草 鱼免 疫 应 答 的 影响 ． 堑生堑 沙 ” ” 。 协3．ffz／ 提 要 一 CFKV 疫苗 具有 较好 的 稳定性 。 4℃ 保存 8十 月，其 免疫 保护 力 仍为 83．6％ ，草鱼 免疫 后 的 血清 中和抗 体 效价 为 l19．2士8．8(2)，与 保 存开 始 时相 比 ，没 有显 著的 差别 o28~(3保 存 8d，其 免 疫 原性 也基 本 上保 持在 原来 的水 平 。CFRV 疫 苗在 此 两温 度下 的 免疫 有教 期分别 为 8个 月 和 8d。不 完全 弗 氏佐剂对 CFKV 疫 苗有 明 显的 增教 作用 ；用 CFRV 疫 苗对 草鱼进 行 加 强免 疫 ，可 明 显地 增 强 草鱼对 该 疫苗 的 免疫应 答，由此 证明 草鱼 具有 免 疫 回忆 反应 。 关 键调 草 鱼 { ●细‘ 咆。 ’’培‘ ～ 荞灭● 。 。活。 ‘ 疫。 。’苗一 ，稳 定性 ，佐剂 ，加强免 疫 草 鱼 (c 0 Ⅱy P。d。 idellaC．etV．) 出 血 病 细 胞 培 养 灭 活 疫 苗 (以 下 简 称 CFRV 疫苗)是 预防草 鱼出血 病的 途径之一 ，目前 已对它的免疫原性 、有效 免疫剂量 、灭活 方 法、种株保 藏及生 产性 试验 的免疫效果进行了研究 和探 讨 ，为其 应用提供了一定的 理 论 和 实 践 依 据 。 。 疫苗的稳定性是疫 苗的一个重要特性 ，鱼 用疫 苗在这方面的 研究 ，国内外 鲜有报道。 佐 拊对鱼类免疫应答 的影响 ，至今 尚有争议“ 。加强免疫能 否增强鱼 类的免疫应答水平 ， 也有不同的意见 。 CFRV 疫苗与佐剂 共同使 用及 CFRV 疫 苗加 强免疫对草鱼 免疫应 答 的 影 响 ，国 内 外 均 未 涉 及 。 鉴 此 ，作 者 对 CFRV 疫 苗 4T：和 28℃ 保 存 时 的 稳 定 性 进 行 了 研 究 ，对 不 完 全 弗 氏佐 剂 与 氢 氧 化 铝 凝 胶 佐 剂能 否 增 强 CFRV 疫 苗 的 免 疫 效 果 进 行 了 探 讨 ，并 通 过 该 疫 苗 对 草鱼 的加 强 免 疫 试 验 ，对 草 鱼 免 疫 应 答 水 平 的变 化 进 行了 初 步 的 研 究 。 材 料 和 方 法 1．疫苗 用疫 苗株 FR一854作为种 株制备 CFRV 疫苗 ，其 制备、检定 和效 价测定参 照 报 道 的 方 法 进 行 。 +苯 文承卫 生 部上海 生物 制 品研究 所 研究 员焦 永真 先生 审阅 井 提出 宝贵意 见，谨此 致 谢。 199o年 B月 6 日收 到 ＼ ，／ 厶j—vM一 维普资讯 http://www.cqvip.com

極先乐等:草鱼出血病细胞培荞灭活疫茁的研究:疫茁的稳定性 及佐剂和加强免疫对草鱼免疫应答的影响 2.试验鱼、免疫接种及其免疫应答水平的测定10cm左右的草鱼在试验网箱中暂养 7d左右后进行免疫接种,每尾腹腔注射CFRV疫苗04m1。20d后测定免疫鱼的血清 中和抗体价和强毒攻击后的免疫保护力,以此衡量其免疫应答水平。 3疫苗的稳定性将同一批次的CFRV疫苗分成若干瓶置于4℃医用冰箱或28℃ 恒温箱保存。间隔一定时间,分别取出一瓶免疫草鱼种若干尾,并同时设立未免疫的草鱼 作对照。试验重复进行两次,第一次不仅测定血清中和抗体效价,还测定免疫保护力。比 较在各温度下一定保存期的CFRV疫苗的稳定性。 4佐剂对疫菌免疫效果的影响不完全弗氏佐剂(以下简称IFA)按石蜡油与羊毛 脂8:2的比例配制;20%氢氧化铝凝胶[以下简称A(OH)3]为南昌生物制药厂产品。使 用前将疫苗和佐剂(8:2)充分乳化。不加佐剂的CFRV疫苗免疫前用 Eagle'sMEM稀 释(疫苗:MEM=8:2)。每次试验设立使用IFA、A(OH)3和无佐剂的三个免疫组及 个不免疫的对照组,测定各组的免疫应答水平。试验重复两次,统计分析两次试验结 果,评价佐剂的作用。此外,1988年在本所试验场还进行了使用IFA和不使用佐剂的 CFRV疫苗免疫二蛰草鱼种的生产性对比试验,为进一步确定IFA在CFRⅤ疫苗免疫 应用中的作用 5.加强免疫对草鱼免疫应答的影响先后用CFRⅤ疫苗对草鱼进行两次免疫,每次 间隔一个月,并分别测定两次免疫一个月后的草鱼的免疫应答水平。试验重复两次,对结 果进行统计分析并比较一次免疫和两次免疫后的应答水平的差异。 结果 (一)疫苗的稳定性 效价(指灭活前病毒的滴度,以下同)为10TCID3/ml的CFR疫苗4℃保存2个 月后,免疫保护力只由保存开始时的936%下降到934%,基本维持在原来的水平上;免 疫后的草鱼血清中和抗体效价为1194±30.3(2),与保存开始时的状况171.9±26.6(2)柞 比,没有显著的差别(t测验,04>p>0.3)。第5、8个月后,免疫保护力虽有下降,但仍达 80%以上(分别为85.0%和83.6%),免疫后的草鱼血清中和抗体效价在保存2个月后的 水平上徘徊[分别为120I士77(2),1192士8.8(2)],与保存开始时相比无显著差别〔t测 验,0.3>p>0.2)。第11个月后,免疫保护力下降到72%,免疫后的草鱼血清中和抗体效 价下降到104.3±1.7(2),与保存开始吋相比差别比较显著(t测验,0.2>p>0.)。到第 13个月免疫保护力下降到60.8%,免疫后的草鱼血清中和抗体效价只达93.0±3.9(2),t测 验的结果表明,此时血清中和抗体水平和保存开始时相比有显著的差别(ppp>0.2),第10、15d后P值均小于01,差别显著(图2)

期 杨 先乐 等 ：草鱼 出血 病细 胞培 养 灭活 疫 苗的研 究 ：疫 苗的 稳 定性 及 佐 剂和 加 强免疫 对 草鱼 免疫 应答 的 影响 47 2．试验 鱼、免疫接种及 其免疫应答水平的测定 10cm左 右的 草鱼 在试 验网箱 中暂 养 7d左 右 后 进 行 免 疫 接 种 ，每 尾腹 腔 注 射 CFRV 疫 苗 0．4ml。 20d 后 测 定 免 疫 鱼 的 血 清 中 和 抗 体 效 价 和 强 毒 攻 击 后 的 免 疫 保 护 力 ，以 此 衡 量 其 免 疫应 答 水 平。 3．疫 苗 的 稳 定 性 将 同一 批 次 的 CFRV 疫 苗 分 成 若 干 瓶 置 于 4℃ 医 用 冰 箱 或 28℃ 恒 温 箱 保 存 。 间 隔 一 定 时 间 ，分 别 取 出 一 瓶 免疫 草 鱼 种若 干 尾 ，并 同 时 设 立 未 免 疫 的 草 鱼 怍 对照。 试验重复进行两次 ，第一次不仅测定血 清中和抗 体效 价 ，还测定 免疫保护 力。 比 较 在 各 温度 下 一 定 保 存 期 的 CFRV 疫 苗 的 稳 定 性 。 4．佐 剂 对 疫 苗 免 疫 效 果 的影 响 不 完 全 弗 氏 佐 剂 (以下 简 称 1FA)按 石 蜡 油与 羊 毛 自8：2的 比 例 配 制 ；20％氢 氧 化 铝 凝 胶 [以下 简 称 AKOH)]为 南 昌 生 物 制 药 厂产 品 。 使 用 前 将 疫 苗 和 佐 剂 (8：2)充 分 乳 化 。 不 加 佐 剂 的 CFRV 疫 苗 免 疫 前 用 EaglesMEM 稀 释 (疫 苗 ： MEM 一 8：2)。 每 次试 验 设 立 使 用 IFA、 AKOH) 和 无 佐 剂 的 三 个 免 疫 组 及 一 个 不 免 疫 的 对 照 组 ，测 定 各 组 的 免 疫 应答 水 平 。 试 验 重复 两 次 ，统 计 分 析 两 次 试 验 结 果 ，评 价 佐 剂 的 作 用 。 此 外 ，1988年 在本 所 试 验 场 还 进 行 了 使 用 IFA 和 不 使用 佐 剂的 CFRV 疫 苗 免 疫 二 龄 草 鱼 种的 生 产性 对 比 试 验 ，为 进一 步确 定 IFA 在 CFRV 疫 苗 免 疫 应 用 中 的 作 用 。 5．加强免疫对草鱼免疫应答 的影 响 先后用 CFRV 疫苗对草鱼 进行两次免疫 ，每次 间 隔 一个 月 ，并 分 别 测 定 两 次 免 疫 一 个 月后 的草 鱼的 免 疫 应 答 水 平 。 试 验 重 复 两 次 ，对 结 果 进 行 统 计 分 析 并 比较 一 次 免 疫 和 两 次 免 疫 后 的 应 答 水 平 的 差 异 。 结 果 (一 ) 疫 苗 的 稳 定 性 效价(指灭活前病毒的滴度 ，以下同 )Yo10 TCID ／ml的 CFRV 疫 苗 4屯保 存 2个 月后 ，免 疫保 护 力 只 由保 存 开 始 时 的 93．6％下 降 到 93：4％ ，基 本 维 持 在 原 来 的 水 平 上 ；免 疫 后 的 草 鱼 血 清 中 和抗 体 效 价 为 1194±303(2)，与 保 存 开始 时 的 状况 1719±266(2)相 比 ，没有 显著 的 差 别 (t测 验 ，04> p> 0．3)。第 5、8个 月后 ，免 疫保 护 力 虽 有下 降 ，但 仍 达 80％以上 (分 别为 85．0％和 836％)，免 疫后的草鱼血 清中和抗体效 价在保存 2个 月后的 水平上徘徊 【分别为 120．1±77(2)，1192±8．8(2)】，与保存 开始 时相 比无 显著 差别 (t测 验 ，0．3>p> 0．2)。第 l1个 月后 ，免疫保护 力下 降到 72％，免疫后的草鱼血清 中和 抗体 效 价 下 降 到 l04．3±1~7(2)，与 保 存 开 始 时 相 比差 别 比 较 显 著 (t测验 ，0．2> p> o．1)。 到 第 13个 月免 疫 保 护 力 下 降 到6O8％ ，免 疫 后的 草 鱼 血 清 中和 抗 体 效 价 只 达 93．0±3．9(2)，t测 验的结果表明 ，此时血清 中和抗体 水平 和保 存开始时相 比有显著的差别(p P P> 0．2)，第 10、l5d后 p值 均 小 于 01， 差 别 显 著 (图 2)。 维普资讯 http://www.cqvip.com

水生生物学报 卷 48 “王 保存时间 Storage time tdI 保存时间 Storage time(Months 图1CFRⅴ疫苗4℃保存时的稳定性 图2cFR疫苗28℃保存时的稳定性 Fig.1 The stability of vaccine CFRv at 4C Fig. 2 The stability 免丧保护力PRP(PRP: Percent Relative at28℃.图注同图1 Protection)3试验组成活率 Ps of test Surviva]);國对熙组成活率 PS of Contro 试验组Tet;· 对照组 Co nt rol (ANT: Antiserum Neut ralization Titre *各次试验样本数 The number of sample in each te st(mmunization grou (二)佐剂对CFRv疫苗免疫效果的影响 佐剂-CFR疫苗免疫草鱼的试验表明,使用IFA可使CFR疫苗的免疫保护力 由不使用佐剂的765土10.9(2)%提高到100±0(2)%,免疫后的草鱼血清中和抗体效价 由1635±43.5(2)提高到3192±627(2),t测验的结果表示它们的免疫效果有比较显著 的差别;用A(OH)2CFRⅴ疫苗免疫后的草鱼免疫保护力为76.8土992)%,血清中和 抗体效价为2289±972(2),与不使用佐剂的免疫组相比差别不明显(表1)。生产性试验 的结果进一步揭示,使用IFA-CFRV疫苗免疫,其成活率可达879%,比不使用佐剂的 免疫组提高124±23(2)%(表2 (三)加强免疫对草鱼免疫应答的影响 用CFRv疫苗对草鱼进行一次免疫和二次免疫后的结果如表3所示。加强免疫后 的草鱼的成活率、免疫保护力比一次免疫的要分别提高134±04(2)%,23.5±10.9(2)%, 免疫后的草鱼血清中和抗体效价前者比后者提高1628±107.3(2),t测验的结果也表明 加强免疫后的草鱼的成活率、免疫保护力及血清中和抗体水平和一次免疫者相比均有较 显著的差异

水 生 生 物 学 报 喜 萋 善 襄 l，_!面■●039／319堕／27i7甄U15 I、 ——七 ． ——8 吨～lln。I—、 ‘ ‘ 一 、 ‘一 一 ‘ ＼ ， 图 l cFRv 疫 保 存时 的靛 性 Fi 忆 2 ；FRVa疫bi茁lity耽of簖vac时cin的e稳C定FR性V — g．1 T … he st 七凸 ab r}T ility of ragcine CFRV at Fj ¨ s 札 tab 2 i B l ℃ ity 盈盈 免疫保 护力 PRP (PRP：Pcr~eD． t R~lati 札 蚰 l斟囝注 同圉田 L Protection)； 口 试验 组成 皤 率 PS ot Test rPS：PercentSurviva1)； 一 对 照组 成 活 率 (ANT：Antiserum Neutzalizatio~ Ticre) 各攻试验样本数(著器) T numSorofHmplejne4cb t(Immun…iza…tiongroup) (=)佐剂对 CFRV 疫苗免疫效 暴的彤响 佐剂 一CFRV 疫苗免疫草鱼 的试验表 明 ，使用 IFA 可使 CFRV 疫 苗的 免疫保护力 由不使 用佐剂的 76．5±10．9(2)％提 高到 100±O(2)西，免疫后的草鱼血 清 中和抗体 效价 由 163．5±43．5(2)提高到 319．2+62．7(2)，t测验的结果表示 它们 的免疫效果有 比较显 著 的 差别 ；用 AI(OH)，一CFRV 疫 苗免 疫后 的草鱼免 疫保 护力为 76．8±9．9( )％，血 中和 抗体效价为 228．9±97．2(2)，与不使用佐剂的免疫组相比差别不明显(表1)。生产性试验 的结果 进一步揭示 ，使用 IFA—CFRV 疫 苗免疫 ，其成 活率可述 87·9％，比不 使用佐剂 的 免疫组提 高 124±2．3(2)，刍(表 2)o (三)加 强免疫 对草鱼免疫应答 的影响 用 CFRV 疫苗对草鱼进行一次 免疫和 二次免 疫后的结果 如表 3所示。 加 强免疫后 的草鱼的成 活率、免疫保护 力比一 次免疫的要分 别提 高13·4±0-4(2)9，3·5±10．9( )瞄， 免疫后的草鱼 血请中和抗体效价前者 比后者提高 162．8±107·3(2)，t测验的结果 也表 明 加强 免疫后的 草鱼的成活率、免疫保护 力及血清 中和抗体水平 和一次免疫者相 比均有较 显著 的差异 。 维普资讯 http://www.cqvip.com

杨先乐等:草鱼出血病细胞培养灭活疫苗的研究:疫苗的稳定性 及佐剂和加强免疫对草鱼免疫应答的影响 neV oe日日 , 已g 新二 3n8 ⌒镢矩 目组

l 鞭 杨 先乐 等 ：草鱼 出 血病细 胞培 养 灭话 疫 苗的研 究 ：疫 苗的稳 定性 及 佐 剂和 加 强免疫 对 草鱼免 疫 应 答的 影响 l ； i l 量 耋 磊 鲎当 委 ；i 兽 @ 0 l 艇 《； 霉 三 羹! ： 0 氍e 旧 ； 龌 嘉 嚣 ! jIl； 0 a州 u 一’ll目 0。《 } = ； 日B州 0 口0 _ 日。0 毒 疆 韶苇lk 右 捌* 崔耕捆 崔 u 岬捆譬 葺‘u．幂 蛙 t啪惟 ■ 2 lI-L Dl；¨=! Z ga l1a《 ¨-LZ《 _ 0I]=0 山 1]三 lU 。 山 =：山 山 I1日 } ∞ 山 |s山 } ^ ^ 目 ^ ^ N V 0 R 0 0 ‘ V ^ 魏 露 褂 0 0 V ^ V 山 睾 辐 0 0 譬 《 +l 耋 m ^ R 黎 般 童 +n 宝 ∞ h h ^ 碍 ^ 魍 +l 壮 2 一 ∞ h 趸 神言一 I = 2 U 0 星 匪 卿 鼎 ： 按 踬 三 盐右 簟 蜘崔搬 ■*蓠蔫 _l■ 维普资讯 http://www.cqvip.com

水生生物学报 3cFRv疫苗一次免疫与二次免盛对草鱼应答水平的比较 Tab. 3 Comparison of immune response of g mmupized with CFRV 次试验样本 成活率 免疫保护力 t测验 %) 清中和 抗体效价 免孩组次角班109/1 86.4±0.4(2)765±10.9(1)1635±43.5〔2 56/46 100±0(2) 100±0(2)33±63.(2)P0.3 P≤0,05* ①均与一次免疫组进行比较 All Compared with the single immune group. ②同表1注②;*、冰冰表示同表1c 论 1.稳定性是疫苗的一个重要特性。人、兽用疫苗在对其稳定性的研究时,常以疫苗的 效价。免疫保护力及其免疫应答的变化作为衡量指标,而鱼用疫蓝目前国内外对此尚无 系统的研究,更无统一的规定。本文从免疫保护力和血清中和抗体的变化对CFRV疫苗 的稳定性进行了探讨。根据试验结果可以认为该疫苗在4保存时是比较稳定的,而在 室温(28℃)条件下,它的稳定性则较差,保存10d的cFRⅴ疫苗的免疫效果只相当于 4℃保存↓3个月的水平。由此看来,温度的升高对CFR疫苗的抗原性损失较大。 CFRⅴ疫苗适宜于4℃保存。 疫苗的有效期是根据它在某种保存条件下的稳定性和能保持它的免疫效力的最长期 限而定。根据当前国内防治草鱼出血病的情况和本试验的结果,我们认为CFRⅴ疫苗在 4℃保存时的有效期为8个月,室温下(28℃)有效期为8d。 2.一般认为佐剂能使抗原在鱼体内缀慢持续地释放,增强巨噬细胞和浆细胞的活性 加快抗体的生成,从而提高免疫效果,但有的学者却持反对意见,他们认为佐剂没有明 屜的增效作用,甚至还会产生佐剂病。本试验证明,不完全弗氏佐剂能比较明显地增强 CFRⅤ疫苗的免疫效果,它能使免疫后的草鱼获得较高的血清中和抗体,较大地提高 CFRⅴ疫苗的免疫保护力,生产性试验也证明了它的这种增效作用。本试验也表明氢氧 化铝凝胶佐剂的增效作用不明显,与 Denier(1983,1984),和 Horne et at.(1984)的 试验结果较吻合。我们认为CFRV疫苗对草鱼出血病的保护作用是刺激鱼体产生体液免 疫和细胞免疫综合作用的结果,细胞介导的致敏反应在草鱼免疫应答中占有一定的地位 FA不仅具有A(OH)3一样延缓免疫原在机体内存留的时间,使之持续缓慢释放刺激鱼 体产生体液免疫的机理,而且还能增强细胞介导的致敏反应能力,产生更有效的保护性免 疫作用。另一方面,氢氧化铝作为免疫吸附剂,它的免疫增效作用与其乳化状态、pH及 吸附活性等因素相关,本试验所使用的氢氧化铝佐剂只是一个生产厂家的产品,因此尚不

永 生 生 物 学 报 j蠹3 CFRV 瘦苗一 收 免疫与= 坎 免疫对 簟鱼应 警水 平的 比较 T ab． 3 Com parison of im m une response of grass carp im m unized with C FRV 。 between single and boo8ter． 各 次 试验样 丰数 成 活率 免疫 保护力 血 清中和 坷验 。 0 组 别 The㈣ berof PS PRP 抗 体 教 价 G roup ish in each (％ ) (％ ) ANT 成 活 率 免 疫 血 清 中 PS 保 护 力 抗 傩 效 PRP A N T ．m 免 m 疫 组 ~n1． 盎 1O9／I29 B6．土0．{(2) ．土10．9(z)163．土{3．5(2) “ Jl二Bo次os免tt疫r 56／46 100土O(2) 100土O(2) j26．3土63．4(2)pO．3 P< 0．05 0 均 与一 次 免疫组 进 行 比较 AllCompared with the singl~immunegroup @ 同 表 I注 0 ；术 、丰丰表示 同表 1 讨 论 i．稳定性是疫 苗的一个 重要 特性 。人 、兽 用疫 苗在对其稳定性的研 究时 ，常 以疫 苗的 效 价。 免疫保护力及其 免疫应答 的变 化作 为衡量指标 ，而鱼 用疫 苗 目前国内外对 此尚无 系 统的研究 ，更无统一的规定。本文从 免疫保护 力和血 清中和抗体的变化对 CFRV 疫 苗 l韵 稳 定 性 进 行 了探 讨。 根 据 试 验 结 果 可 以认 为 该 疫 苗在 4℃ 保 存 时 是 比 较 稳 定 的 ，而 在 室 温(28oc)条件下 ，它 的稳 定性 则较 差 ，保存 10d的 CFRV 疫苗的免疫效 果只相当于 4℃ 保 存 13个 月的 水 平 。 由 此 看 来 ，温 度 的 升 高 对 CFRV 疫 苗 的 抗 原 性 损 失 较 大 。 CFRV 疫 苗 适 宜 于 4℃ 保 存 。 疫 苗的有效期是 根据它在某种保存 条件下的稳定性 和能保持它 的免疫效力的最长期 限而 定。 根据 当前 国 内防 治草鱼 出血病的情况和本试验的结果 ，我们认为 CFRV 疫 苗在 4qC保存时 的有效期 为 8个 月，室温下(28℃)有效期为 8d。 2．一般认为 佐剂能使抗原在鱼体 内缓慢 持续 地释放 ，增强 巨噬细 胞和浆细胞 的活性 ， 加快抗体的 生成 ，从而握高 免疫效果 ，但有的学者却持反对 意见 ，他 们认为佐 剂没有明 昆的增效作用 ，甚至 还会 产生 佐剂病。 本试验证明 ．不完全弗氏佐剂 能比较 明显地 增强 CFRV 疫 苗的免疫效果 ，它能使免疫后的草鱼 获得较 高的血清中和抗体 ，较 大 地 提 高 CFRV 疫苗的免疫保护力 ，生产性 试验也证明了它 的这 种增效作 用。 本试验 也表明氢 氧 化铝凝 胶佐剂的增效作用不 明显 ，与 Dunier(1983，1984)’和 Horncflal (1984)的 试验结果较 吻台。 我们认为 CFRV疫 苗对草鱼出血病的保护作用是刺激鱼体产生 体液 免 疫 和细 胞 免疫 综台作 用的结 果 ，细 胞介 导的致敏反应在草 鱼免疫应答中 占有一 定的地位 ， IFA不仅 具有 AI(OH)一 样延缓免疫原在 机体内存 留的时间 ，使之 持续 缓慢释放刺激鱼 体产 生体 藏免疫的机理 ，而且还能增强细胞介导 的致敏 反应能力 ，产生更有效 的保 护性 免 疫作 用。另一方面 ，氢氧化铝作 为免疫吸附剂 ，它 的免疫增 效作用与其 乳化状态 、pH 及 吸附 活性 等因素相关 ，本试验 所使 用的氢氧化铝佐剂 只是一个生 产厂 家的产品 ，因此 尚不 维普资讯 http://www.cqvip.com

杨先乐等:草鱼出血病细胞培养灭活疫苗的研究:疫苗的稳定性 及佐剂和加强免疫对草鱼免疫应答的影响 能完全否定它的增效作用。关于这个问题还待进一步研究。 3.我们曾报告用CFRⅴ疫免疫草鱼后,第20d时其血清中和抗体水平达到峰值, 该峰值水平可持续10d左右,到第30d开始缓慢下降。从本试验的结果进一步看到,当草 鱼的免疫应答水平第30d开始下降时予以加强免疫,血清中和抗体水平则又明显地提高, 其免疫保护力也显著地高于一次免疫者。这一结果不仅证明了草鱼和其它一些鱼类 样,具有免疫回忆反应,而且也表明两次免疫能使草鱼获得比较牢固的免疫保护。这 样就提示了一条增强CFRⅤ疫苗免疫效果的途径。虽然在生产上进行两次注射的方法 是不可取的,但是我们亦可通过CFRⅤ疫苗的其它给予途径予以加强。 文獻 LI1杨先乐。草鱼出血病细胞培养天活疫苗研究初步报告。淡水渔业;1986(3);1-5。 〔2】杨先乐、夏春、左文功。草鱼出血病细胞培养灭活班苗的研究——疫苗株的免疫原性及其有效免疫剂量。水 学报,1989(2);I38-I4 3】杨先乐、左文功陈远新。草鱼出血病细胞灭活疫苗的研究——疫苗株的保藏。淡水渔业;I990(4)1-3 41 HorDe M T. The effect of the use of potassium alum adjuvant in vaccines against vibriosis in ralabow trout Salmo gaird Her: Richardson, J. Fish. Dis 1984. 712): 91-99 5〕 Krantz G E, Redcliff」M, Heist E. Develφ pment of antibodies against Aeromonas saimm。 netda in out,J. frayne,1963,91:757÷760 6] immunology of fish In Sy ish Vaccination (P, de Kiakelin Ed ) Paris, 1984:20-22.39-74 [7] Stephen G N, Jahn J M. Immunization of salmonid against Furunculosis. Fish, Path. 1985, 20(2/3):403- [8] Duoier M, La pridustioo d' anticor ps seriques chez I a truite Arc-en-Ciel (Salmo gairdneri Richardson) nce dn rappel et des adjuvants These presentee a L. Institut Nazronal Agronomique Partr-GrignoK f 91 Durier M. Absence of anamnestic )esponse 1D DNP-Heamocyanin and DNP-Ficoll in rainbow tI pur, im Proc ediogs of the Fish immunology Symposium, 1t---13 July 1984, Plymouth I ItI Anderson D P. et al. Investigations of immunological memoty in rainbow cout (Saime gardneri) to DNP conjugates. Dew Comp. Immuno, SuPplemen, 1983, 2:115--122 I 111 Larmers C H J. De Haas M J H. Van Muiswinkel W B. The reaction of the imntune system uf lisn t.dc citation. Developtneot of irumunologieal memory in catp, Cyprinus L, following dirre Immersion in Meronmomas hydrophila bacterin. J. Pisk, Dis. 1985, 8: 253--363

1期 杨先乐等：草鱼出血病细胞培养灭话疫苗的研究 ：疫苗的稳定性 及 佐剂和 加强 免疫 对草 鱼免 疫应 答 的 影响 能 完全 否 定 它 的 增 效 作 用 。 关 于 这 个 问题 还 待 进 一 步研 究。 3．我 们 曾报 告 用 CFRV 疫 苗 免 疫 草 鱼 后 ，第 20d时 其 血 清 中 和 抗 体 水 平 达 到 峰 值 ， 该 峰 值 水平 可 持 续 10d左 右 ，到 第 30d开 始 缓 慢 下 降 。 从 本 试 验 的 结 果 进一 步 看 到 ，当 草 鱼 的 免 疫 应 答 水 平 第 30d开 始 下 降 时 予 以加 强 免 疫 ，血 清 中 和 抗 体 水 平 则又 明 显 地 提 高 ． 其 免疫保护 力也显著地高 于一次免疫者。 这一结果不 仅证 明了草鱼和其它一些 鱼 类 一 样“ 具有 免疫回忆反应 ，而且也表 明两 次免疫能使草鱼 获得比较牢固的免疫保护。 这 样 就 提 示 了 一 条 增 强 CFRV 疫 苗 免 疫 效 果 的 途 径 。 虽 然在 生 产 上盎 行两 次 注 射 的 方 法 是不 可取的 ，但 是我们亦 可通 过 CFRV 疫苗的 其它 给予途径予以加强。 参 考 文 献 行先乐 。草 鱼 出血痛 细胞 培养 天活疫 苗 研究 初步报 告。棱 水 渔业 ，1986~(3)． 1— 5。 杨 先乐 、夏 春、左文 功。草 鱼 出血 病细 胞 培养灭 活疫 苗的研 究—— 疫 苗株 的免 疫原性 受其 有赦 免 疫 量。 水 产学报 ，1989，(2)： l38— 144。 杨 先乐 、左 文功、陈远 新。 草鱼 出血病 细胞 灭话疫 苗的 研 究— —疫 苗株 的 保藏。 缦水 渔业 ， 1990，(●)： 1- $。 H㈣ M T Theeffectofthe useofpotassium alum adiuvantin vaccines against vibriosisrn rainbow tfo~[． Salmo gairdnerlRichardson．， 1984．7f2)：91— 99 · Kr4D乜 G E Reddeclif J M Heist C E．Developm ent of antibodiEs agaibH … 』 salmo 4 in tt'ottt．，．Immunol， 1963，91： 757·-760， Dorson M ．Applied immunology of fish Ia Symp~sJ㈨ n Fish Vaccination (P de Kiahe ]Jn Ed，)．Parisr 1984： 20- 22 39— 7● Stephen G N，．Tohn J M．Ixumunlzatlon ofsalmonidsagainstFuruqcutosis Fish．Path．1985．2O(2／3)：●O3 4II￾Dunier M ．La priductioo d’anticorpsseriqueschezI．atruite Arc·n·CSel(Salmo gairdneriRichardson) influ 玳e du rappe[etdesadjuvants Thesepresentec 口 fl“ National Agronomiqu~ Paris·Grignon 19fl3． Duniet M Absence of 舳 nesh JesF．onse 1D DNP·Heamocyanin artd DN p-Ficolt in rainbow trJut ， Proc edings of the Fish imm unology Sym posium 1I— l3 July 】984． Plym outh Anderson D P eta1．Investigationsofimmunologicatmemory in rainbow t~OHt (Saimo galrdn~ri) to DNP cotti~gates． cb肼p tmm~not 排“ l 1982 2： 1l5 122． Larmets C H J De H nns M J H ，Van M uiswinkel W B T he reaction 0 the im mune system (Jf llsh to vac ~ivation Developm entofimmunological y in car口_ Cyprlnus earpio L following dir~ ! im merslo~ in ． 4eromona~^ roghillahacteriR ，．FJ's~． f， ；985，8 2 3 62 I 2 5 } 5 6 7 8 O L [ ● I { r f 维普资讯 http://www.cqvip.com

52 水生生物学报 17 INACTIVATED VACCINE OBTAINTED THROUGH CELL CUL TURE FOR HEMORRHAGE OF GRASS CARP (CTENOPH. ARYN GODON IDELLA): THE STABILITY OF VACCINE AND INFLUENCE OF ADJUVANTS AND BOOSTER IMMUNIATION ON THE IMMUNE RESPONSE Yang Xianle and Zuo Wengong (Yangtse Rie'sr Fisheries Reearch Intitute, Shashi 434000 Abstract The stability of the vaccine is relatively high. After 8 months'storage at 4C, the anise- rum neutralization titre(ANT) were 119.2+8.8(2), and was not significantly different from that at start of storage period the relative prorection of grass carp immunized with the vac cine was 83.6%. After a storage period of 8 days at 28C, the ANT and relative protection re- mained the same as those at start of the storage perind The incomplete Freunds adjuvant en- hanced the immune effect of the vaccine. Both relative and ant in the booster immunized grass carp were significantly different from those in the single immunized group Key words Hemorrahage of grass carP, Inactivated vaccine obtained through cell cul ture, Stabily, Adjuvant,Booster

水 生 生 物 学 报 INA CTIVATED VACCINE OBTAINTED THROUG H CELL CUL— TURE F0R HEM oRRHAGE 0F GRASS CARP (CTEⅣ oPH · A RyⅣ G0D 0Ⅳ 』Df LA )： THE STABILITY OF VACCINE A ND INFLU ENCE O F ADJUV AN TS A ND BO O STER IM M UNIATION ON THE IM M UNE RESP0NSE Yang X ianle and Zuo W engong (Ycngtze River FisherieJ ReJcareh lnJtitate， Slaashl 434000) A bstract The stability ofthe vaccine is relatively high After 8 months’storage at4。C，the antlse— rltR]neutralizationtitre(ANT)were119．2±8．8(2)，andwasnotsignificantly differentfrom thatat start of storage period； the relative protection of grass carp im m unized w ith the vac— cinewas83．6％．Afterastorageperiod of8 days8t28。C，theANT and relativeprotection re— mained thesameasthoseatstartofthestorageperiod The~ncompleteFreund’s adjuvanten— hanced theim[nune effectofthe vaccine． Both relative and ANT in the boosier immunlzed grasscarp weresignificantly differentfrom those in the singh immunized group． Key words Hemorrahageofgrasscarp， Inactivated vaccine obtained through cellcul ture，Stabily，Adjuvant，Booster 维普资讯 http://www.cqvip.com