59-62草,血病,分析,红洲 《珠江水产》总19期 1992.10. 珠江三角洲草鱼出血病病原的初步分析 兰邓国成李焕林许英 S943.112 提要 为了确定珠江三角洲地区草鱼出血病病毒的分表位置,我们利用自然发病 病鱼的组织、接种病毒的细胞及其培养液进行病毒提纯,以及感染病毒的细胞 超薄切片,均从电镜中观察到直径为60左右,近似球形的病毒颗粒,并对 其进行接酸电泳分析,其基因组由1011个RNA片段组成初步认为珠江三 角洲草鱼出血病病毒属呼肠孤病毒科的一员。此外,还从自然发病病鱼的显 症组织中分离到一种直径10m左右的病毒样颗粒。 主题词:草鱼出血病病毒,形态结构,基因组。 材料与方法 一、细胞及病鱼 草鱼吻端成纤维细胞系PSF(1)珠江三角洲息出血病的草鱼 二、实验方法 (一)细胞病毒的观察及提纯 1、超薄切片法 将已盲传至第六代。仍可复制出草鱼出血病症状的病毒毒种,接种长成致密单层的 细胞,置28℃培养,接种后第二天开始,逐日收集细胞,进行超薄切片,电镜观察。 2、差速离心法 对长势良好的正常细胞进行传代培养,在分装细胞的同时,以1:10的浓度加入已 在细胞中传至第二十三代的细胞病毒,然后置28℃静止培养,7~8天后回收细胞及培 养液,经冻融后,注射感染当年龄草鱼,可复制出典型的草鱼出血病症状。将该培养物 作为病毒原液。经差速离心(8000g,30分钟,130000,3.5小时)2,沉淀用少量 0.01MPH7.4的Tris—Hc1缓冲液悬浮,制成提纯的病毒样品,经常规负染后于透射电 镜下观察。 3、病毒核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳 将提纯的病毒样品,用氯仿一酚法提取病毒核酸,经浓缩后,将病毒核酸溶于缓冲 59
一 。 密 ，崩 岛， 牡稿卅⑧ 《珠江水 产 总 l9期 l902．10． 珠 江三 角洲草 鱼 出血病病 原 的初 步分析 姜 兰 邓国成乙／ 焕林 许淑其 提 耍 {吗t 为 了确 定珠 江三 角洲地 区草鱼 出血 病病毒 的分表 位置 ，我们 利用 自然发 病 病鱼 的组 毋：、接 种病毒 的细胞 及其培 养液进行 病毒 提 地， 以及感染病毒 的细 胞 起 薄切片，均从 电镜 申观 察到 直径 为6Ohm左右，近 似球 开j的病毒颗粒 ，并 才 其 进 行 核 馥 电泳 分 析 ， 其 基 因 组 由 10一 l1个 RNA~I段 组 成 。 初 步认 寿珠 江 三 角潮草鱼 出血 病病毒 属 呼肪孤 病毒 科 的一 员。此外 ，还从 自然发病 病 鱼 的 显 症组 织中分 离到一 种直径 lOnm左右 的病毒样 颗粒 。 主题词：草鱼 出血病病毒 ，形态结构 ，基 因组。 柠料与方法 一 、 细 胞 及 病鱼 草鱼 吻端成纤维 细胞系 PSF“ ，珠 江三 角 、洲患出血病的草鱼 二 、 实验 方 法 (一 )细胞病毒的观察 及提纯 1、超 薄 切 片 法 将 已盲传至第六代 。仍可复 制出草鱼 出血病症 状的病毒毒 种，接种长成致密 单层的 细胞，置 28℃培养，接 种后 第二天 开始， 逐 日收集细胞 ，进 行超 薄切片， 电镜观 察。 2、 差 速 离 心 法 对 长势 良好 的正 常细胞进行传代 培养，在 分装细胞的 同时， 以 l ：lO的 浓度 加入 已 在 细胞 中传 至第二十三代的细胞病毒 ，然 后置28℃静止 培养， 7～ 8天后 回收细胞及培 养 液，经冻 融后 ，注 射感染 当年龄草 鱼，可复制出典型的 草鱼 出血病症状 。将该 培养物 作为病 毒原液。 经差速离心 (8000g， 3O分 钟， 130000g，3．5小时 )(2]， 沉淀 用 少 量 0．o1MPH7．d的Tris— Hc1缓 冲液悬浮， 制成提纯的病毒 样 品，经 常规 负染后于 透 射 电 镜 下观察 。 3、病毒 核酸 聚丙 烯酰胺凝胶 电泳 将提纯的病毒 样 品，用氯仿 一酚法提取病毒核酸 ，经浓 缩后 ，将病毒核酸 溶于缓冲 59 维普资讯 http://www.cqvip.com
《珠江水产》总19 液中(006 MRis-Hcl,PH6,8),由10%聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离,电流60 mA,电压400V,电泳时间7小时;电泳后,用AgNO3染色,水漂洗后直接观察。 (二)自然发病病鱼组织材料病毒的提取 将森中步(肝、脾肾、肠)用电动捣碎机攙碎,按1:10(W/V)的比例加入预 冷的NE缓冲液〔Triz-He-EDTA-Nacl,PH7.4),制成组织匀长,再反复冻融 二次 1、蔗糖密度梯度离心法 将组织匀浆经8000rP离心30分钟,取上清,用8m140%蕺糖溶浓(PBs,PH7,2 配制)垫底,4800rpm离心2小时,将沉淀悬浮于少量NE缓冲液中,制成粗提纯病毒 样品;再经蔗糖不连续密度梯度(15%、30%45%60%)离心(36000pm,2小 时),分带收集,用NIE缓冲液洗糖(86000rpm,2小时),沉淀用少量NE级冲液制 成悬液,经常规负染后,于透射电镜下察。 2、PEG6000一Nac沉淀法 组织匀浆经00m离心30分钟,收集上清漳,加入等体积的预冷氯仿混和,剧烈 摇动10分钟,再经100m离心30分钟,吸取上清液,如此重复了~8次,将最终所得 上清夜,加入聚乙二醇(分子量600),使其终浓度为10%再加入M叫3%,搅 拌90分钟后置4℃过夜。第二天100pm离心30分钟,取沉淀用10倍NE缓冲液回 溶,4℃过液;再经1000pm离心30分钟,取上清液,用透析袋透析24小时,进行常规 负染,透射电镜观察。 结果 、从接毒培养的胞中提纯的病毒样品,在电镜下可观察到典型的病毒颗粒,大 小均一,近似球形,由双层衣壳组成,其直径为60nm左右(见图1);与收袋的接种 毒后第三日病变细胞的超薄切片中所见的存在于细跑质中的大量病毒颗粒(见图2 相似。病毒核酸电泳,观察到10条带,分四组(见图5) 二、从自然发病病鱼组织材料提纯的病毒样品,用蔗糖密度梯度离心及PEG6000沉 淀法,均分别在电镜下观察到一种直径为10mm左右的细小病毒样颗粒(见图3,图4)。 讨论 接毒细胞提纯病毒的核酸电泳结果,病毒基因组由10个片段组成,分四个组, 相近于已报导的鱼呼肠弧病毒(FRV)(6),与病毒所报道的草鱼出血病病毒基因组由
《璩 疆水 产 》 总 19期 l992．10． 液 中 (0．06MTris-Hcl， PH6．8)， 由 10 聚丙烯 酰胺凝胶 垂直 板 电泳分 离 ， 电流6O mA， 电压 4ooV， 电泳时 间 7小时 ；电泳后，用'AgNOs染色，水漂 洗 后直 接观察。 (二 )自然发病病鱼 组织 材料病 毒 的挺 取 牟 窀争 肝、脾、肾、肠)用电动捣碎机捣碎，按1；10(w／v)的比例加入预 冷的NI嘲 冲淹 (Tri一Hcl—EDTA—Nacl，PH7．4)，制威组织匀浆，再反复 冻融 二 次 。 I、蔗 糖密 度梯度离 心法 ． 。 将组织匀浆 ~8000rpm离心3口分 钟， 取上海 ’用 8mI40 蔗 糖溶液 。(PBS，PH7．2 配 制 )垫底，480Q~}rpm离 心 2小时， 将沉淀悬浮平 少量NLE~ +液 中，制成粗提 纯病毒 样品 ；再经蔗糖不连续 密度梯度 (15 、3O*／o、45 、6O％ )离 心 ( 36~00rpm ， 2小 时 )，分带收 集，用NIE缓冲液洗糖 (36000rpra~ 2小时 )， 沉淀甩少量Ni霉缓冲液制 成悬液 ，经常规负 染后 ，于透射 电镜下艨 。 。 2、PEG6000-NacI沉淀 法 · 组织匀浆经10oo0rpm离心3o分钝，蜈泉上清荤，加入等体积的预玲氯仿混和，剧烈 摇动1o分钟，再经l0∞orpn璃 心3o分钟，顿取上清液，如此重复7～8扶，将最终所得 上清 夜， 加入 聚 乙二醇 (分子量6000)，使 其终 浓度为 1O ，再加褂 I量 ali酾 ．； ，搅 拌9o分钟后置4℃过夜。第二 餐loqoOrp,-~b3o~-$t。，零沉率用1q倍 缓冲液回 溶 ，4℃过液 ；再 经10000rpm离心 30分钟 ，取上 清液 ，用 透析袋 透析24小肚 ，进行 常规 负染，透射 电镜 观察。 结 果 。 ， { Ir ． ． 一 ， 扶接毒培养的绸胞中提摊由缸病毒样品，在电镜下可观察到典型的病毒颗粒，本 小均 一，近似球 形， 由双层衣 壳组成 ，其直径 为60nm左右 (见 图 1)；与收 集的 接 种 病毒后第三 日病变细胞的超薄切片 中所见的存在予细胞质 中的大量病毒颗粒 (见图 2) 相似。病毒核酸电泳，观察到l0拳带’、分四组 ‘见图 5)。 =、从 自然发病病鱼组织材料提纯的病毒样品，用蔗糖密度梯度离心及pEGsoOO沉 淀法 ，均分别在 电镜下观 察到 一种直径 为 10ram左右的细 小病 毒样 颗粒(见 图 3 图 4> 讨 论 一 、 接毒细胞提纯病毒 的核 酸 电泳结 果， 相 近于已报 导的鱼 呼肠 弧病 毒 (FRV )(5)， 病毒基 因组 由10个片段 组成 ，分 四个 组， 与病毒 所报 避的草鱼出血病病毒 基 因组 卣 维普资讯 http://www.cqvip.com
《珠江水产》总19期 1992。10 11个片段组成(2有差异。但从电泳图谱直观看来,第一条电泳带染色比其它9条明显 粗些,所以我们怀疑第一条带是由两条带重叠而成,关于这一点,有待进一步实验证 明。从我们的实验中,无论是从自然发病的病鱼组织(),还是从接种了病毒的细胞及 其培养液中,均可提纯、观察到直径60m左右的病毒颗粒,病毒核酸型为RMA,4) 基因组由10~1个片段组成。因此,我们初步认为,珠江三角洲草鱼出血病病原与已报 道长江流域的草鱼出血病病原一样,属呼肠弧病毒科的成员 三、在用病鱼组织作材料提纯的病毒样品中,看到直径为10m左右的病毒样颗粒, 目前还未见有过报道。这种小颗粒是否是在提纯过程中由病毒降解出的亚单位,或是一 种尚未知的细小病毒?还有待进一步研究证明。 参考文献 (1)李焕林等;草鱼吻端成纤维细胞系PSF的建立及其生物学特征。中国水产科 学院学报,1:1~8,1988。 2)王炜等草鱼出血病病毒武汉南湖株的精细结构与基因组及多歇的研究。病毒 学报,1:44~48,199 3)陈江等;凝胶层析法分离提纯草鱼出血病病毒的研究。珠江水产,9:45 47,1987 4)李焕林等:草鱼出血病病毒主要理化生物学特性的研究。鱼病简讯,2:1 6。1986。 5)中国科学院武汉病毒研究所及中国水产科学院长江水产研究所草鱼出血病研究 协作组;草鱼出血病病原一鱼呼肠弧病毒(FRv)核酸特性的研究。淡水渔 业,4:7~9,1984
《珠 江水产 * 总 l9期 1992．10． 11个片段组 成 有差异。但从 电泳图谱直观看来 ，第一 条 电泳带 染色 比其它 9条 明 显 魍 些，所以我们忉：疑第一条带是由两条带重叠而成，关于逮一点，有苻进一 步 实 验证 明·从我们的实验 中， 无论 是从 自然 发病的瓶鱼 组织 ，还是 从接 种了病毒 的纽 胞 及 其 培养 液 中，均可提纯 、观 察到直径 6OⅡm左 右的病毒颗 粒，病毒棱酸 型为RNA一~4J， 基 因组 由lO～ n个片段组 成 因此，我 们初步 认为，珠江 兰角荸lf草鱼 出血病病 原与 已报 道 长 江流域的草鱼 出血病 病原一样，属 呼肠 弧病毒 辩的成员。 三 、在 甩病鱼组 织作材 料提纯的病毒 样 品中，看到直径为 lOⅡm左右的病毒 样颗 粒， 目啻还未见有 过报 道。 这种 小颗 粒是 否是 在提 纯过程 中由病 毒髀解出的亚单位， 或是 一 种 尚未知的 细小病 毒t还有待进 一步 研究 证明。 参 考 文 献 (1) 李焕林等。草鱼吻端成纤维细胞系PSF的建立及其生物学特征。中国水 产 科 学院学 报， l：1～ 8， l988。 (2) 王玮等，草鱼 出血病病毒武汉南期株的精细结构与基嗣组藏多肚的研究。病毒 掣 报， 1 ：44~48，1990o <3) 陈江等；凝胶层柝法分离提纯草鱼出血病病毒的研究。珠江 水 产 ， 9 ：t5～ 47， 19B7。 <4 ) 李焕 林等 ：草鱼 出血病病毒 主要理 化生物学特性 的研究 。鱼病 筒矾， 2 ：1～ 6- 1986。 《5) 中国科学院武汉病毒研究所及 中国水产科学院长江水产研究所草鱼l出血病研究 协作组；草鱼出血病病原——鱼呼腑弧病毒 <FRV)核馥特性的研究。嵌永渔 业 ， 4 ：7～ 9， 198L 维普资讯 http://www.cqvip.com
内 图1完蓬时毒颗粒病毒空衣壳(ⅹ100,000) 图2.细胞质中的病毒粒(×120,000) 簿:御:素 兴去群 ;例御 蛰贬犟(.E 警強 六禁 然:套关 图3细小病毒样颗粒(×560,000) 图6彭电泳积式L计 珠江所电泳结 A、草鱼出血痳疖毒B、正常绯〗 C、HRV(小几轮状病毒) b、病毒所与长江所协作组电泳结m(5 HFv(昆虫呼肠孤病毒一蝇病毒 草鱼出血病病 毒 所电泳结果 图4细小病毒样颗粒〔×400,000) F、草鱼出血病病毒 G、入DNA→ Hind一ECOR 62
图l 完整倒婀毒顺粒盘病毒量衣尧 t 0，000) 图 4 细小病 毒样颗粒 (X400，000) 62 图 5 耘酝 宅珏=校丑 k讯 a、珠 江 所 电 泳 结 果 A 、草鱼d’血疖疖 毒 B、正 常 E 浓 C、HRV (／bJL轮状病 毒 ) b，病毒 所与长 江所擤作 组电流 0 D、HFV (昆虫呼肠 孤病毒 一蝇病毒 E、草鱼 出血 病病 毒 c、病毒所 电泳 结果 F、草 鱼 出血病病毒 G 、 入 D NA— H jⅡd I— ECOR 维普资讯 http://www.cqvip.com