维普资讯hpw htp/ww.cqvip.com 病毒学杂志3,189 315 Virologics Sinloe 草鱼出血病病毒的生长特性及高滴价培养 方勤柯丽华蔡宜权 (中国科学院武汉病毒研究所,武汉) 提要 草鱼出血病病毒感染鱼肾(C1k)单层细胞后,产生明显的细胞病变,其繁殖周期为 2一3天。病毒增殖的上升期在感染后的12—48小时。28°下,当感染复数(Multiplicity of Infection简称mo为0.05pfu/ce11时病毒滴价可达1.78×101PU/ml,不同 温度(25°℃、28°℃、30C)下通气培养,测定病毒滴价略有差异。感染病毒的细胞培养 液经 ELISA检测和电子显微镜观察均为阳性结果,并且能感染健康草鱼。 关键词:草鱼出血病病毒;生长特性,病毒效价 1983年我们首次从草鱼出血病病鱼组织中分离到一株病毒,通过形态结构的研究、 核酸分析等鉴定后,定名为鱼呼肠孤病毒(F),该病毒能够感染CIK细胞。近 年来,我们从湖南邵阳分离到另一毒株,编号为GCHV-873对其形态、基因组及理化 特性等已进行了研究(另文报道),同时成功地从组织培养中获得了高滴价病毒。这一 研究结果,对该病毒的深入研究及其应用等提供了物质基础和实验依据,现将HV 873在CIK细胞培养中的某些生物学特性及高滴价培养的结果报告如下 材料与方法 一、细胞及其培养实验选用CIK细胞株s】.细胞培养液含10%小牛血清的Eagle'smem 并加入谷氨酰胺(按300μg/m1)维持液含2小牛血清。7.5%的NaHCO3调整pH至7.2左 右,培养温度为28 二、原始病毒样品的制备从湖南阳地区草鱼出血病之草鱼中取其内脏,用0.01mol/L PBS(p7.2)洗三次,加入少量10mmol/L的 HEPES(pH7.0)缓冲液,用组织匀浆器磨碎 制成1:10的制悬液。悬液冻融三次,用普通滤纸过滤,滤液经8000r/m(Hitachi.rpr-20-2 转头,下同)离心30分钟,上清经 ELISAL测定为阳性后,加入青素(100u/m1)和链霉素 (100g/m1),过滤除菌,置4冰箱备用 三、病毒接种与传代取4C保存之病毒悬液,用无血清的Eagle'sMEM稀释成1:10接种 细胞28°C下吸附1小时,倾去未吸附的悬液,加入维持液置28°培养。三天后,取100μ1上清 作 ELISA检测,阳性结果的培养液作为继续传代的毒源。以后各代病毒的传代培养按上述方法 本文于1988年9月13日收到 本所电镜室的同志拍本文电镜照片,湖南阳地区水产科学研究所提供毒源及回接实验数据在 一并致谢!
霸毒 学杂 志 3， 1D89 V h ologic- Siai口· 3l5 草 鱼 出血病病毒 的生长特性及高滴 价培养 方 勤 柯丽华 蔡 宜权 (中 国科 学院 武汉 病毒 研究 所， 武 汉 ) 提 要 草 鱼 出 血 病 病 毒 感染 鱼 肾 (elk)单 层 细胞 后 ， 产 生 明 显 的 细 胞 病 变 ， 其 繁 殖 周 期 为 2- 3天 。 病 毒 增 殖的 上 升 期 在 感 染 后 的 12— 48小 时 。28。c下 ，当 瘟 染 复数 ( Multiplicity of Infection简 称 MOI)为 0．05PFU／ce11时 ， 病 毒 滴价 可 达 1．78×10¨PFU／ml， 不 同 温度 (25 、28一 、30。c)下 通 气 培 养 ， 铡定 病 毒 滴价 略 有 差 异 。 感 染 病 毒 的 细 胞培 养 液经 ELISA捡 测和 电子 显微镜观察均为 阳性 结果， 并且能感染健 康草鱼。 关键 调：草鱼 出血病病 毒|生长特性 J病 毒效价 1983年我们 首次从 草鱼 出血病 病鱼组 织 中分 离到 一 株病毒 ，通过形 态 结构 的研究 、 按酸分析 等鉴定 后，定 名为鱼呼 肠孤病 毒 (FRV)“】，该 病毒 能 够感染CIK细 胞 。近 年来 ，我 们从湖 南邵 阳分离到 另 一毒 榇， 编号为GCHV一873。 对 其形 态 、基因组 及理化 特性 等 已进 行 了研究 (另文 报道 )， 同时成功 地从组 织培 养 中获得 了高滴价病 毒 。这 一 研究 结果 ， 对该 病毒的 深入 研究 及其应 用等 提供 了物质 基础和 实验 依据， 现 将GCHV一 873在 CIK 细胞培 养 中的某 些生 物学 特 性及 高 滴价 培 养的 结果 报告 如下： 材 料 与 方 法 一 、 细囊 豆其 培养 实验 选用CIK细 胞株【。】。细胞培 养液含10嘶小 牛血 清的Eagle，sMEM， 并 加 入 谷 氨酰 胺 (按 300~g／m1)。维 持 液 含 2％ 小 牛 血 清。 用 7．5嘶 的 NaHCO3调 整 pH 至 7．2左 右 ，培 养温度为 28c。 = ．曩始病毒样品 的制备 从 湖南邵阳地 区患草鱼 出血病之草鱼 中取其 内脏 ，用0．01mol／L PBS(pH7．2)漂 洗 三 次 ，加 入 少 量 lOmmol／L的 HEPES(pH7．0)缓 冲 液 ， 用 组 织 匀 浆 器磨 碎 ， 制 成 1l10的 租 制 悬 液 。 悬 液 冻 融 三 次 ， 用 普 通 滤 纸 过 滤 ，滤 液经 8．O00r／m (Hitachi，RPR一20—2 转头，下同 )离心 30分钟 ，上清经 ELISA[‘ 铡定为 阳性后 ， 加入青 霉素 (100u／m1)和链霉素 (1OOp,g／m1)，过 滤 除 菌 ， 置 4。c冰 箱 备 用 。 三 、病毒 接种与传 代 取 4。c保存之病毒悬 液，用无 血清的 Eagle’sMEM稀释 成 1；10接种 细 胞 。 28。C下 吸 附 1小 时 ， 倾 去 未 吸 附 的 悬 液 ，加 入 维 持 液 置28~C培 养 。 三 天 后 ， 取 lOOpl上 清 作 ELISA检 测，阳性结果 的培 养 液作为 继续传代的毒源。 以后各代病毒 的传 代培养按上 述方 法 本 文 于 1988年 9月 13日收 到。 本所电镜室的同志拍摄本文电镜照片，湖南邵阳地 区水产科学研究所遐供毒源置回接窭验数蜡在屿 一 哥致谢! 维普资讯 http://www.cqvip.com
316 病毒学杂志3,1989 Vir●l·i·sfic 进行 四、病骞滴价测定培养于24孔培养板( Coster)的细胞长成单层后,用无血清的Egle MEM将待测病毒悬液作10倍稀释,每孔接0.1m1,每一稀释度3个孔,培养2-3天,观察细胞 病变,按Reed和 Muech6法计算出 TCIDno/m1。同时呆用空斑滴定法(方法另文报道)计算病毒 悬液的PFU。 五,病毒赣殖曲线的测定细胞在直径为60mm的平皿( Corning)中培养2-3天,每平 皿加入0.1m1的病毒悬液(感染复数分别为0.05,1,20PFU/cel1)。接种方法同上,不同时 取样测定病毒滴价。 六.细传代病毒的回试验用细胞传代第16代GCHV-873回接3.5-4.2寸草鱼,每尾 注射03—05m1的病毒培养液,28°C-31°C水温条件下观察发病情况。 七.病毒部分提施及电赣收集感染了病毒的细胞培养液,8,000/m离心30分钟,去 细眴片,然后再经16,00x/m离心4小时,去上清,沉淀用1×9c(0.15mo1/L氯化钠,0.015m01/L 柠檬酸三钠,PH7.4)级冲液溶解。上述过程重复一次,沉淀用少量双蒸水悬浮滴于铜网上,晾干, 用2%磷钨酸(PH6.9)负染,置JEM-100C型电子显微镜观察。 结果与讨论 病毒的复制与传代 从病鱼组织中分离、制备的病毒悬液感染细胞,病变出现在48小时以后。病变伊 始,单层细胞局部出现边缘不整齐的空洞(图1),未感染的细胞无此现象〔图2)。随 着CPE的发展,整个单层细胞拉成网状,最后大部分饔解的细胞离壁飘浮于液面。从 感染到收集病毒这一过程约需5天时间。感染后第三天,用 ELISA法检测细胞培养 液呈阳性反应,未感染的细胞培养液则为阴性反应。随着传代次数的增加,病毒的毒力 和产量都有所提高,繁殖周期相应缩短,当病毒传至3—4代,这些指标逐步趋于稳定, 结果见表1。 病毒传代次数与滴价的关系 Table 1 Relationship between serial Propagation and titer of GCAV-873 病毒传代次数稀释度 收获时间(天) 病毒滴价( TCID50/m1) EL1sA检测 原代 十 7.2x10L 1 104 2 原代一一从病鱼组织制备的病毒悬液 二、通气条件对病毒增殖的影响 接种于24孔培养板的归毒,分别置28℃普通培养箱和CO2培养箱〔含5%C02) 培养,48小时后检查培养液的pH和病毒滴价,发现前者的pH为7,8-8.0,后者的pH
316 蠹 篙 。 进 行。 四 、寰毒滴 债 定 培 养于 24孔培养板 (Coster)的细胞长成单层后 ，用无 血清的Eagle。s MEM 将 待 瓤病 毒 悬 蔽 作 l0倍 稀 释 ， 每 孔 接 0．1ml，每 一 稀 释 度 3个 孔 ，培 养 2— 3天 ， 观察 细 胞 病 变 ，按 Reed和 Mucch 法计 算 出 TCID5o／ml。同时 采 用 空 斑 清定 法 (方 法 另文 报 道 )计 算 病 毒 悬 液 的 PFU。 五 、寓毒 繁殖 曲壤 的霸 定 细胞在直 径为 60ram的 平皿 (Corn|ng)中培养 2—3天 ，每平 皿加 入 0．1ml的病 毒悬液 (感杂复数分 丑为 0．0s，l，20PFU／cel1)。 接种 方法同上 ．不 同时 同 取 样 测 定 病 毒 滴 价 。 六 ．细囊传 代寓●的 回接试验 用细胞传代第 16代GCH~-873回接 3．s一4．2寸 草鱼。每尾 注 射 0．3- 0．5ml的 病 毒培 养 液 ， 28。c一 3l。c水 温 条 件 下 观 察 发 病情 况 。 七 ．寓毒部分摄 纯殛皂鼍 曩寨 收集感染 了病毒 的细 胞培 养液 ，8，O00r／m离心 30分钟，去 细 强 碎 片 。 然 后 再 经 16．O00r／m离 心 4小 时 ，去 上 清 沉 淀 用 lx5Be(0．1Smo1／L氯 化钠 0．015mol／L 柠檬酸三钠 ，pH7．4)缓 冲液溶解 。上 述过程重复一次 ，沉淀用少 量双蒸水悬浮 滴于锕网上，晾干， 用 2嘶磷 钨 酸 (pH6．9)负 染 ， 置 JEM-IOOC型 电 子 显 微 镜 观 察 。 结 果 与 讨 论 一 ， 病 毒的复 制与传 代 从病 鱼 组织 中分离 ，制备 的病毒 悬液感 染细胞 ，病 变 出现 在 48小 时以后 。 病 变伊 始 ，单层 细胞局 部出现边 缘不 整齐 的空 洞 (图 1)，来 感染的 细胞无 此现 象 (图 2 )。随 着 CPE的发展 ，整 个单层 细胞 拉成网状 ， 最后大 部分裂 解 的细 胞离壁 飘 浮于 液 面。 从 感 染到收集病 毒这 一 过 程约 需 5天时 间。感 染后第 三天 ，用 ELISA法捡 测 细 胞 培 养 液呈 阳性 反应 ，来感 染的 细胞 培养 液则为 阴性反应 。随 着传 代次数 的增加 ，病 毒的 毒力 和产 量都 有所 提高，繁 殖周期 相应缩 短 ，当病 毒传 至 3— 4代，这 些指标逐 步趋 于稳定 ， 结果 见 表 1。 囊 1 卉 毒 传 代寝 敢与 囊 债的关 系 Tab1。 1 Reletloeship t tw咖 serla】prop4gatlon tⅡd titcr0f GCH V一873 ‘虏(代一一从病鱼组织箭备的病毒悬液 ¨ND一 一耒 测定 二 、 通 气 条 件 对 病 毒 增 殖 的 影 响 接 种于 24孔培 养板 的瘫 毒，分 别置 28℃ 普通 培养 箱和 CO 培 养箱 (含 5 CO ) 华养，48，卜时后检查培养液的pH和病毒滴价，发现前者的pHi7．8—8．0，后者的pH 维普资讯 http://www.cqvip.com
病彩学杂志3。10』9 317 为6.0-65,两者的病毒滴价较为接近,如表2所示。此结果表明:由于细胞代谢和 空气所导致的培养液PH之轻度变化,对病毒复制无大的影响。 通气条件对事增殖的影响 Tablo 2 Effect of atmosphere or partial pressures of COz n GCHV-873 rc 培养条件 病毒滴价(TcID50/m]) 空气 6x1012 、温度对病毒增殖的影响 比较了25℃、28℃、30℃三种温度对病毒增殖的影响,结果如表3。 豪3对宥毒却殖的影响 Table 3 The offcer of temparatare on GCHv-873 replication 28·c 滴价(TcID50/m 7.0x1011 5.6×1011 3.2X10L 这三种温度培养之病毒,滴价略有差异,25℃略高,30℃偏低,28℃介于二者之 间。因CIK细胞在28℃生长较快且比较稳定,故我们一般采用28℃作为细胞生长 和病毒增殖的温度。 四、不同感染复数对病毒产量的影响 同一条件下,用不同感染复数的病毒感染细胞,其病毒产量有显者差异,结果见 表4 褒4不同感染复做和病害产量的影响 of MOl c日v-873 y ie Id 感染复数(PFU/eel) 细胞数/m1 病毒滴价(TcID5/m1) 利定时间(天) 7.2×105 1.78×1011 xiC 在其他条件相同的情况下,感染复数与病毒的收获量存在着一定的关系 当MO为 20时,其病毒滴价为789×10°PFU/ml,Mo等于1时所获病毒滴价为52×1019PFU/ ml,而MOI减少到005时,滴价则上升到L78×101PFU/ml。由此不难看出感染复 数对病毒产量的影响,可能当感染复数较高时,细胞很快被破坏。感染复数较低时,细 胞可利用宿主细胞进行多次侵染,故病毒滴价较前者高。 五、病毒繁殖曲线 接种病毒的细胞,在28℃下,测定的病毒繁殖曲线如图3所示。病毒增殖从6小 时开始,12-48小时呈对数紫殖,48小时达到最高点,随着时间的推移,逐步趋向
府毒学杂志 3．1¨g 317 giroieliet Stmisl 为 6．0— 6．5，两者的病 毒滴价 较为接 近 ， 如表 2所示 。 此结果 表明， 由于 细胞 代谢和 空气所 导致的 培养液 pH之轻 度变 化，对 病毒 复制无大 的 影响 。 裹 2 叠 气条 件对 囊■ 增 矗 曲群 一 Table 2 Effect of etmosp~ete o partial presmures 0f C02 0n G CH V-873 r。PIin ti0n 三 、温 度 对 病 毒 增 殖 的 影 响 比 较7"25℃、28℃、30℃三 种温度对 病 毒增殖 的影 响 ，结果 如表 3。 裹 5 沮虞 对矗 ● 增 矗曲 群响 Table 3 Tho effect of tem paratRre 。n GCH V一873 replication 这 三 种温 度培 养之病 毒 ， 滴 价略有 差异 ，25℃ 略 高 ，30℃ 偏低 ，28℃ 介于 二者 之 间。 因 CIK细 胞在 28℃ 生 长较 快且 比较稳定 ， 故我 们一般 采用 28℃ 作为细 胞生 长 和 痛 毒 增 殖 的 温 度 。 四、不 同感染复 数对病 毒产量 的 影响 同 一条件下 ， 用不 同 感染复数 的 病 毒感染细 胞 ， 其病 毒 产量有 显著差异 ， 结果 见 表 4。 寝 4 不同 瞎染 复截 和病 毒产 量的 影响 Tabl~ 4 T he effect 。f M O1 0n G CHV 一873 ield 在 其他 条件相 同的 情况下，感染 复数 与病毒 的收 获量存 在着 一定 的关 系。当 MOI为 20时，其赢 毒滴价为 7．89×10PFU／m]， MOI等于 1时所获病 毒滴价 为 5．2X10~~PFU／ ml, 而 M0I减 少 到 0．05时 ， 滴 价 则 上 升 到 1．78×10“PFU／ml。 由此 不 难 看 出 感 染复 数对 病毒 产量的 影响 ，可能 当感染复数 较 高时 ，细 胞 很快被破 坏。 感染复 数较低 时 ， 细 胞可 利用宿 主细 胞进 行多次 侵 染，故病毒 谪价 较前者 高。 五、病毒 繁殖 曲线 接 种病毒 的 细胞 ，在 28℃ 下 ， 测定的病 毒繁 殖 曲线 如图 …所 示 。 病 毒增殖 从 6小 时开 始， 12～ 48小时呈对 数繁 殖 ， 48小 时达 到最 高点 ， 随着时 间的 推移 ， 逐 步 趋 向 维普资讯 http://www.cqvip.com
318 病毒学杂志3,19 YireI· gies Sini 平稳。 六、细胞传代病毒的回接试验 传代第16代GcHv-873回接鱼体,感染6天后,开始发病,第9天发病率高达 90%。实验结果表明:从组织培养中收获的病毒,不仅适应细胞培养,而且能够感染 鱼体。 七、电子显微镜观察 60ml感染病毒的细胞培养液,经部分提纯之祥品在电子显微镱下可见到成片的病 毒粒子(图4)。 图1感染病毒的CIK细胞 图2未感染病毒的cIK细胞 Fig 1 Micrograph of infected CIk cell Fig2 Control CIK cell MOI=t 1013 t014 224364860728496小时 图3ccHv-Hs的繁殖曲线 Fig 3 Representelive growth curve cf GCHV-873
318 病毒 学杂志 3．1¨§ Y irolo#i#l SLnl,oa 平 稳 。 六 、 细 胞 传 代病 毒 的 回 接 试 验 传代 第 16代 GCHV一873回 接 鱼体 ， 感 染 6天 后 ， 开始发 病 ， 第 9天发 病 率 高迭 90％。 实验 结果 表明- 从组织 培 养中收 获的病 毒 ， 不 仅适应 细胞培 养 ， 而 且能 够感染 鱼 体 。 七 、 电子 显 微 镜 观 察 60m 癔 染病毒 的细胞 培 养液， 经 部分 提纯之样 品在 电子 显微 镜下 可见 到成片前 病 毒 粒 子 (图 4 )。 匿 1 感染病毒 的 CIK细胞 Fis 1 M icfOEr‘ph of i_feeled CI ceIl 图 2 来感染病毒的 C[K细胞 Fig 2 Centrol CI e11B 囤 3 GCItV—It$ 的繁 殖 曲线 Fig 3 lLepre|B口t‘li e grow th Ⅲ ve 。f G CH V一873 ^一置 ＼：口_Iul工 v书挂■憔 维普资讯 http://www.cqvip.com
病毒学杂志3 319 Virologic sin 120 图4电子显做镜下负染的病毒粒子 Fig4 Ele 参亏文谳 〔1〕洪世雯等,1985年亚州淡水养殖学木讨论会论文集 〔2〕中国科学院武汉病毒研究所、中国水产科学院长江水产所沙市分所草鱼出血病研究协作组,1983,淡水 渔业,和3,P39 〔3〕左文功等,1984,淡水渔业,3,P38 〔4〕闵淑琴等,1986,水产学报,10:4,383-389 〔5〕識华生等,1983,新实验病毒学,P34 Growth Characteristics and High Titer Culture of Grass Carp Hemorrhage Virus(GCHV)-873 in Vitro F Qi Ke Li-hua Cai yi-quan (wuhan Institute of Viroloy Some biological properties of Gras ss Carp Hemorrhage virus GCHV)-873 have been studied in this report. This virus could make grass carp kidney cells (CIK)to produce a unique cytopathic effect. At 28C its logarithmic growth hase occured 12 to 48 hr after infection. The virus titer reached 1. 78 x 10 PFU/ml when the MOI was approximately 0.05PFU /cell, There were slight differences in virus titer under incubation of 25C, 28C and 30'C respectively, and the ilar results in 5% CO2 or in normal atmosphere. The virus particles in culture fluid of infected cells were further confirmed by using ELISA and electron microscopy, and it could infect healthy grass carp as well Key words, Grass Carp Hemorrhage Virus, Growth characteristic Virus titer
府毒学杂志 3，l0的 319 图 4 电 子显 檄 镜下 负染 的 病毒 粒 子 Fig 4 EIectr0Ⅱ m icrograph of ⅡeE^tiv~1Y sttined CCHV 一873 参 考 文 献 (i] 洪世 雯等 ， 1985年亚 州溲 水 养殖 学 术讨 论 会论 文 集 ． [2] 中国科学院武汉病毒研究所．中国术产科学院长江术产所 沙市分所草鱼出血病研究协 作蛆，lug8，淡水 渔 业 _№ 3，P39 (3) 左 文功 苷- l984，浚 水 渔 业， № 8，P38 (4) 阿 激琴 等 _1986_术 产学 报 _10：4， 383—389 (5) 戴华 生 等． 1983，新 实 验 病毒 学， P34 Growth Characteristics and High Titer Culture of GrassCarp Hemorrhage Virus (GCHV)一873inVitro Fang Qin Ke Li-hua Cai yl—quau (W uhan Institute0，ViraIogy， Academia Sinica，W uhan) Some biologicalproperties of Grass Carp Hemorrhage Virus (GCHV)一873 have been studied in this report． This virus could m ake grass carp kidney cells (CIK) to produce a unique cytopathic effect． At28℃ its logarithmic growth phaseoccurcd 12 to48 hrafter infection．Thevirustiterreached 1． 78×10”PFU／ml when the MO1wasapproximately0．05PFU／cel1． Therewereslightdifferences in virus titer under incubation of 25℃ ， 28℃ and 30℃ respectively 。 and the sim ilar results in 5 CO2 or in norm al atm osphere． The virus particles in culture fluid of infected cells were further confirm ed by using ELISA and electron m icroscopy， and it could infect healthy grass uarp as wel1． K ey w ordsl Grass Carp Hem orrhage VirusI Growth uharauteristiu， Virus titer 维普资讯 http://www.cqvip.com