维资讯pww. http:/www.cqvip.com 3-引草鱼,出血病,研究 《珠江水产》总19期 1992.10 草鱼出血病细胞弱毒疫苗的研究S93.2 李焕林淑英邓国成姜兰 提要 自1986年草鱼吻端成纤维细胞系PSF建立以来,作者应用此细胞系进行 了草鱼出血病病毒的接种分离、适应性培养馴化和制备细胞疫苗等一系列试 验。本文报导841号毒株的筛选、弱毒副化细胞弱毒湿疫苗和冻干疫苗制 备、稀释度、剂量以及保存期测定的试验;细胞弱毒疫苗中间试验与生产表证 的初步结果.84-1号毒株在PSF细胞中继代化至53代达到减毒目的,用筛选 代53~59代作毒种制备的细胞弱毒疫苗使用安全,以10-2~10-3浓度0.1-0.2 毫升/尾剂量注射免疫草鱼,免疫保护率达到85%以上。 主题词:草鱼出血病,毒株,种毒,细胞弱毒苗,湿苗,冻干苗。 前言 人类和动物免疫使用的疫苗制品,从发展上经历了三个阶段:(1)灭活疫苗; (2)弱毒疫苗(3)基因工程亚单位疫苗。目前医学和畜医学预防病毒病使用的普 遍为弱毒活疫苗,灭活疫苗已很少应用。基因工程亚单位疫苗刚在世界兴起,只在医学 上少数病毒病中试用 鱼用疫苗制品研制在我国起步较晚。但自1969珠江水产研究所李焕林等首次研制 试用获得成功以来,鱼类免疫防病二十年来有了很大发展,在生产上的应用规模,我国 已届于世界前列目前主要疫苗种类为灭活组织疫苗,包括珠江水产研究所的“三病” 组织疫苗1和中科院水生所的草鱼出血病灭活苗2草鱼经免疫后成活率达80%以 上。然而组织疫苗取材来源于病鱼肝、脾、肾和显症组织,要在流行季节从自然界收集, 或靠鱼体在适温条件下感染扩大,使大批量生产几乎不可能,往往冬末春初放种时因缺 乏疫苗而错过了预防免疫的时机。 我国自从鱼类细胞建株(系)获得成功以后,浙江淡水水产研究所杨广智等32 长江水产研究所杨先乐等4中科院水生生物研究所邓初夏等先后利用草鱼出血病病 毒敏感细胞株(系)室内离体培养病毒,研制草鱼出血病灭活细胞疫苗,获得一定效 果。但迄今尚未有关于草鱼出血病细胞弱毒疫苗研究的报导。 23
7j一 《珠 江 水 产 》 总 19期 薇 l 1992．10． 草鱼 出血病细胞弱毒疫苗 李焕林 许淑 、 国成 姜 兰 提 要 的研宄 S9移tH 自1986年草 鱼吻端成纤维细 胞 系PSF建立 以来，作者应 用此细 胞 ．罨 进 行 T草 鱼 出血病 病毒 的接 种分 离， 适应性培 养驯化和 制备细胞 疫苗等一 系 列 试 验。 本文报 导84— 1号毒 株的 筛选、弱毒 制化 ；细胞弱毒 湿疫 苗和 冻干疫 苗制 备 、稀 释度 、 剂量 以厦保存 期测 定的试验 ；细 胞弱毒 疫苗 中问试验与 生产 表证 的初 步结果 。84一 l号毒株在PSF细胞 中继代驯化 至53代连到 减毒 目的 ，用筛选 代53~59代作毒 种制备 的细 胞弱毒 疫 苗使 用安 奎，以10 ～10。 浓度9．1— 0．2 毫 尾 剂量 注射 免疫草鱼， 免疫保护率达到85 以上。 主题 词 ：草 鱼 出血 病，毒 株，种毒 ，细胞 弱毒 疫苗，湿 苗， 冻干 苗。 前 言 人类和 动物免疫使用 的疫 苗制 品，从 发展 上经历 了 三 个 阶段 ； ( 1)灭 活疫苗 ； (2 )弱毒疫苗 j (3 )基因工程 亚单位疫苗。 目前医学 和畜 医学预 防病毒病使用 的普 遍 为弱毒活疫苗，灭 活疫苗 已很少应用 。基 因工程亚单位疫 苗刚在世界兴 起，只 在医学 上少数病 毒病 中试用 。 鱼用疫苗 制 品研 制在我国起步较晚 。但 自1969年珠 江水 产研究 所李 焕林 等首次研 制 试用 获得成功 以来 ，鱼 类免疫 防病二十 年来有 了很 大发展， 在生 产上 的应用规模 ，我 国 已届于世界前 列 目前 主要疫苗种类 为灭活组织 疫苗， 包括珠江水 产研究 所的 “三病 ” r ● 、 … 组 织疫 苗“ 和 中科院水生 所的草鱼 出血病灭活疫苗 j。草鱼经免疫后 成活率达80％以 上 。然而 组织疫苗取材来源 于病 鱼肝 、脾 、肾和显症组 织，要在 流行季节 从 自然界收集， 或靠鱼体在 适温条件 下感 染扩大，使大批量生 产几乎不 可能，往 往冬 末春初放种 时因缺 乏疫苗而 错过 了预防免疫 的时机。 我 国 自从鱼 类 细胞 建株 (系 )获得成功 以后，浙 江淡 水水 产研究 所杨 广智等 ， 长江水产研究 所杨先 乐等L4J中科 院水 生生物研究 所邓 初夏 等 先后 利用 草鱼 出血病病 毒 敏感细胞株 (系 )室 内离 体培养病毒，研 制草鱼 出血病灭 活 细胞 疫苗，获 得 一 定 效 果 。但迄 今尚未有关 于草鱼 出血病细胞 弱毒 疫苗研究 的报 导。 23 旖 v红 牲 维普资讯 http://www.cqvip.com
《珠江水产》总19期 t892。10 作者应用草鱼吻端成纤维细胞系PSF1988年首先完成了草鱼出血病高滴度强毒株弱 毒化驯化,制备了草鱼出血病细胞弱毒疫苗〔湿苗和冻干苗),进行了小型实验、中间 产表证,获得良好效果。本文报告这一工作。 村料与方法 毒种驯化 1、病毒提取 从珠江三角洲地区池塘采集具有典型草鱼出血病症状的病鱼,取其肝丶脾、肾组 织,称重、剪碎后,用玻璃研磨器匀浆然后加入不含血清的199培养液使成10-浓度, 置冰箱预冷至4℃,经10000°m离心20分钟,吸取上清液,加入1000单位/毫升青霉素 和100微克/毫升链霉素,放4℃冰箱过液,即为除菌组织病毒液。 2、毒株筛选 用采自珠江三角洲不同地区的野毒材料,分别制备除菌组织病毒液。通过鱼体感染 扩大或接种PSF细胞增殖,回归感染草鱼,从中篼选出毒力强的毒株,作为弱毒驯化的 种毒 8丶种毒弱毒化驯化 取长成致密单层的PSF细胞,用0,25%胰蛋白酶和0,02%乙二胺四乙酸二钠 (EDTA)消液消化一分钟左右,加入含10%小牛血清pH72左右的199培养液,吹打 分散细胞,然后以1:100的比例加入种毒,一分为四分装细胞瓶内(细胞浓度约1·5 104个/毫升)。在一定条件下静止培养,7~10天收获。-20℃冰结。冻融后收获细胞 病毒液,即为某一代的种毒。按上述方法在PSF细胞中连续继代驯化。与此同时,每代 种毒以10°~10-浓度03毫升/尾剂量注射接种全长9~12厘米的草鱼,作毒力检查。接 种15天后以100LD50的强毒02毫升/尾的剂量攻击,观察15~20天,检查其免疫保护力 、细胞弱毒疫苗制备 1、细胞培养弱毒湿苗 采用静止和旋转两种培养方法制备 静止培养方法同“种毒弱毒化驯化”的继代培养。用10°浓度03毫升/尾剂量感染 全长9~12厘米草鱼,安全、免疫原性强的84~1号弱毒株缩选代作毒种 旋转培养用每小时15转的转鼓带动大容量的小口旋转培养瓶。接种毒种代数及其浓 度、接种方法、培养液成份、培养条件及时间同静止培养。但接种的细胞浓度比静止培 养大一培
《珠 江水 产 》 总19期 l明2．10． ＼ ．作者应用草鱼吻端成纤维细胞系PSF1988~首先完成了草龟出血病高滴度强l篓毋 r ，‘■■■ 毒化驯 化，制备 了草鱼 出血病 细胞 弱毒疫苗 (湿 苗和冻千苗 )，进行 了小型 实验 、中间 等 。 一 、 毒 种 驯 化 1、病 毒提取 从珠江三 角洲地 区池塘采集具有典 型草鱼 出血病症状 的 病 鱼 ，取其肝 、脾 、肾组 织。称重 、剪 碎后 ，用 玻璃 研磨器匀浆 ，然后加入不含血清 的199培养液使成 10I1浓度 ， 置冰 箱预 冷至 4℃，经 10000rpm离心20分钟 ，吸取上 清液 ，加．x．1000单位／毫升青 霉 素 和 1000微克／毫升链霉素 ，放 4℃冰箱过液， 即为 除菌 组织 病毒 液。 2 、毒株 筛选 用采 自珠 江三 角洲不 同地 区的野 毒材料，分 别制备除 菌组 织病毒液。通过鱼体 感染 扩大或接 种PSF细胞增 殖，回归感染 草鱼， 从中筛选 出毒力强 的毒株， 作为弱毒驯化 的 种毒 。 3、种毒 弱毒化驯化 取长成致密单 层 的PSF细胞 ，用0．25％胰蛋 白酶 和0．02％ 乙 二 胺 四 乙 酸 二 铺 (EDTA )消液消化一分钟左 右，加入含 10％小 牛血 清、pH7．2左右 的199培养 液 ，吹打 分 散细胞 ，然 后 以 1t100的比例加入种 毒，一分 为 四分装 细胞瓶 内 (细胞 浓度 约 1．5× lO个／毫升 )。在 一定 条件下静止培 养， 7～ l0天收获。 一20℃冰 结。冻融后 收获 细胞 病 毒液，即为某一代 的种毒 。按 上述方 法在PSF细胞 中连 续继代驯化。 与此 同时，每代 种毒以10。～l0 浓度0．3毫升／尾剂量注射接种全长 9～l2厘米的草鱼，作毒力检查。接 种 l5天后 以100LD5o的强毒 0．2毫升／尾的剂量攻击 ，观 察15~2o天 ，检查 其免疫保护力。 二、 细胞 弱毒 疫 苗 制备 l、细 胞培养 弱毒湿苗 采用静止和旋转两 种培养方法制备 。 静止培养方法同 种毒弱毒化驯化”的继代培养 。用l0。浓度o．3毫升／尾剂量感染 全 长 9～l2厘米草鱼 ，安全 、免 疫原性强 的84～ l号弱毒株筛 选代 作 毒种。 旋转 培养用 每小时 l5转的转 鼓带动大 容量的小 71旋转培养瓶 。接种毒种代数 及其 浓 度、接种方 法、培养液成份、培 养条件及时 间同静止培养。但 接种的细胞浓度 比静止 培 养大 一培。 24 维普资讯 http://www.cqvip.com
《珠江水产》总19朝 199210 细胞培养弱毒冻于 将收获后经安全性和抗原性检验合格,置-20℃保存的各批细胞培养弱毒湿苗,无 菌操作倒入大容量的玻璃瓶混合,然后按1:1的比例加入含5%蔗糖的脱脂牛奶作保 护剂、再按总量加入500单位/亳升青霉素和500微克/毫升链霉素,充分抵匀后,在无菌 室分装冻于瓶,每瓶5毫升,最后置真空冷冻干燥机进行冻干处理,出柜后在无菌室加 塞、抽真空、封腊。 三、细胞弱毒疫苗稀释度,剂量和保存期测定 1、稀释度 取84—1号弱毒株55、56、57代作毒种,分别制备细胞培养弱毒湿苗,以10-1 10-‘各种稀释度0,2毫升/尼剂量注射免安全长9~12厘米的当年草鱼,同时设空白对照 组。兔疫15天后以100LD50的强毒02毫升/尾的剂量攻击,观察15~20天,记录和统计 免疫鱼和对照鱼的显症死亡率,计算出各种稀释度的免疫保拉力。 2、剂量 用同一批细胞培养弱毒冻干苗10-~104各稀释度的三种不同剂量(010.2、 0,3升/尾)注射免疫全长9~12厘米的当年草鱼,同时设空白对照组。免疫15天后以 100LD50的强毒02毫升/尾的剂量攻击,观察15~20天,记录和计算比较各种稀释度不 同剂量的免疫保护力。 3、保存期 将同一批细胞培养弱毒冻干苗分别存放于室温、4℃、-20℃三种不同温度,经两个 月后间隔一定时间从各个保存温度随机取出一瓶,用065%生理盐水稀释成10-1~104 儿种浓度,以02毫升/尾注射免疫全长9~12厘米的当年草鱼。同时设空白对照组。免 疫15天后以100LD50的强毒02毫升/尾的剂量攻击,现察15天,检查其免疫保护力。 试验结果 弱毒株84-1号的安全性与免疫原性 1984~1989年,通过数十个野毒村料筛选出84-1号和89-2号两个毒力强的毒 株。84-1号毒株LD50为314,2号毒株LD50为382。其中84—1号毒株作为弱毒驯 化的种毒,几年来在PSF细胞中进行适应性培养,一直保持较强毒力。但在一定培养条 件下传至50代毒力显著减弱,回归感染死亡率仅30%;传至50代降至10%;传至53代毒 力更弱,注射接种草鱼不出现显症、死亡或其它异常现象,而且连续传至59代,均能保 持这种弱化性状(表1)。用这些筛选代作毒种制备的湿苗或冻干苗,均能达到安全
《珠 江 水 产 》 总 19期 1992．10． 2、细胞 培养弱 毒冻 干苗 将 收获后 经安全性和抗 原性检验合 格，置 一20℃保存 的各批细胞培 养弱毒湿苗，无 菌操 作倒入 大容量 的玻璃 瓶混合 ，然 后按 l ·l的 比例加入含 5 蔗糖 的脱晴牛奶 作保 护剂 ，再 按总量加入 500单位／毫升 青霉 索和500微克／毫 升链 霉索 ，充分摇匀后，在无菌 室分装 冻干瓶 ， 每瓶 5毫升 ，最后置真 空冷冻干燥机进 行冻干处理 ，出柜后在无菌 室加 塞 抽真 空、封 腊。 三、细胞弱 毒疫苗稀 释度 ，剂量 和保存 期测 定 l、稀 释 度 取 84一 l号弱毒株 55、56、57代 作毒种，分别 制备 细胞 培养弱 毒 湿 苗， 以l0～～ 1O 各种稀释 度0．2毫升／尾剂量注 射免 疫全长 9～ 】2厘 米 的当年草鱼 ，同时设 空白对照 组 。免 疫l5天后 100LD50的强毒O．2毫升／尾的剂量攻 击，观 察 15～ 20天 ，记录和统讣 免疫鱼和 对照鱼的显症 死亡率，计算 出 各种稀释 度 的免 疫保 护力 。 2、 剂 量 用 同一批 细胞 培养 弱毒冻干茁 10-～ lo 各稀释度 的 三 种不 同剂量 (0．1、0．2、 0．3毫升／尾 )注射 免疫全 长 9～ 12厘 米的当年草鱼， 同时设 空 自对照 组。免疫 15天后 以 1001D50的强毒0．2毫升／尾 的剂量攻 击，观 察 15~20天，记录 和计算 比较 各种稀释度不 同剂量 的免 疫保 护力 。 S、 保 存 期 将同一批 细胞培 养弱毒冻干 苗分 别存放于室温 、4℃、一20℃三 种不 同温度 ，经两 个 月 后间隔一定时 间从 各个 保存 温度 随机 取出一瓶，用 0．65 生理盐水稀释成 1O ～ l0’t 几 种浓度， 以0．2毫升／尾注射 免疫 全长 9～l2厘米的当 年草 鱼。同时设 空白对照 组。 免 疫 l5天后 以100LD50的强毒0．2毫升／尾 的剂量 攻 击 ，观察 15天，检查 其免疫保 护力 。 试 验 结 果 一 、 弱毒株84一 l号 的安全性 与免疫原’巨 1984~ 1989年，通过数 十个野 毒材料筛 选出84～ l号和89～ 2号两 个 毒 力强 的毒 株。84一 l号 毒株LD50为3．14， 2号 毒株LDs0为 3．82。其 中84一 l号毒栋 作为 弱毒 驯 化 的种 毒， 几年来在 PSF细胞 中进行 适应 性培养，一直 保持较 强毒力 。但在一定培 养条 件下抟至 5O代毒力 显著减弱， 回归感染 死 亡率仅3O i传至 50代 降至 10 j传 至53代 毒 力更 弱，注射接种草鱼不出现显症、死亡或其它异常现象，而且连续传至59代，均能保 持 这种 弱毒 化性状 (表 1)。用 这些 筛选代作 毒种制备 的湿苗或冻 干苗 ，均能 达到安全 25 维普资讯 http://www.cqvip.com
《珠江水产》总19期 检验的要求(表2)。 53~59各代弱毒接种兔疫的草鱼,其兔疫保护力均在50%以上(表I)。而用这些 选代作毒种制备的湿苗或冻干苗,稀释成10浓度,兔疫保护力仍可达100%(表3 表4)。 表1 84-1号毒株49~69代毒力变化及弱毒化后的兔疫原性 疫 攻 代浓剂量显症试验组对照组对照组显|兔疫 死亡率成活率成活率症死亡率保护力 (毫升/尾 (%)(%)(%) (%)(%) 03 30 5010-103 30 5210-1 03 100 03 0 85。7 G,3 0 l00 30 100 56 50 03 0 100 100 10n 03 100 30 70 100 细胞弱毒疫苗的稀释度、剂量和保存期 1、稀释度 以84一1号弱毒株55、56、57各代分别作毒种制备的湿苗,稀释度103免疫保护力 均达100%,10-4兔疫保护力亦可达50%(表3)。 2,剂量 同一批细胞培养弱毒冻干苗对全长9~12厘米草鱼免疫后攻击试验表明,用01毫 升/尾剂量注射免疫引起的保护力效应与03毫升尾相同。10浓度03毫升/尾剂量与
《珠江 水产 》 总19期 1992．10． 检 验 的要 求 (表 2 )。 53～ 59各代 弱毒梭种 免疫的草鱼，其免疫保 护力 均在5O 以上 (表 1)。而用这 些 筛 选代作毒 种制备 的湿苗或冻干 苗，稀 释成10。。浓度 ，免 疫保 护力 仍可达 i00 (表 3、 表 4 )。 表 l 84一 I号 毒株伯～69代毒 力变化 殛弱毒化后 的兔疫屎性 免 疫 攻 击 数 剂 量 显 症 试 验 组 对 照 组 对照 组显 免 疫 代 浓度 死亡 率 成 活 率 成 活 率 症死 亡率 保 护力 (毫升／尾 ) (％ ) ( ) (％ ) ( ) (％ ) 49 10一 0．3 3O 一 50 l0一 0．3 30 5l 10— 0．3 0 52 10— O．3 10 53 l0一’ O．3 O 1O0 30 70 100 — — — — — 54 1O一 0．3 0 9O 30 70 85．7 — — 55 10一i O。3 0 100 30 7O lO0 56 1O0 O．3 0 TO0 6O 5O lOO — — — 57 10— 0．3 0 100 30 70 l00 58 lO0 0．3 0 i00 20 80 10n — — 1 59 10。 j 0．3 0 100 30 7O IOO J { 二 、细胞 弱毒 疫苗的稀释度 、剂量 和保存 期 l、 稀 释 度 以84～ l号 弱毒椿55、56、57各代分 别作毒种 制备 的湿苗，稀释度1O 免疫 保护力 均达 i00％， 10 免疫保护力亦 可达 5O％ (表 3 ) 2 剂量 同一批细胞培养 弱毒冻 干苗 对全长 9～l2厘米草鱼免疫后攻 击 试验 表明，用 0·1毫 升／尾 剂量注射免 疫引起 的保护力 效应与 0．3毫升／尾相 同。 10 浓 度O．3毫升／尾剂量 与 26 维普资讯 http://www.cqvip.com
《珠江水产》总19期 i99210 表2 温苗和冻干苗的安全性试验 疫苗批号疫苗浓度 试验鱼/居数显症鱼成活率 尾 (%) 10 0 湿苗1号10 10 0 100 10 100 10 0 湿苗2号10- 10 100 10 10 0 湿苗3号 10 100 10 0 10-1 10 0 冻干苗89—1号 10 100 10-a 10 0 100 100 100 冻干苗89—2号 10 0 10 103浓度01毫升/尾剂量免疫保护力均为100%(表4)。 3、保存期 同一批细胞培养弱毒冻干苗保存于室温、4℃和-20℃三种不同温度半年后的试验 结果初步显示,细胞培养弱毒冻干苗保存于一20℃和4℃6个月,效价不变。10-1 10-4浓度注射免疫草鱼,免疫保护力均保持100%。但4℃组10浓度兔疫保护力降为 88,9%,是效价开始下降的标志还是偶然现象?有待进一步试验证明。保存于室温的冻 于苗效价下降较快,保存两个月(春季),效价即呈下降趋势,10-3浓度兔疫保护力下 降为80%,保存6个月(春、夏季)效价明显下降,10-度免疫保护力只剩333% 27
《珠 江水产 》 总 l9期 1995．10． 表 2 温 苗 和珠 千苗 的 安 全 性 试 验 显 症 鱼 成 活 率 疫 苗 批 号 疫苗浓 度 试验 鱼／ 尾数 尾 数 ( ) — — l00 lO O l0O 湿 哲 1 号 10一‘ i0 O 1O0 l0—0 10 O 100 100 10 O 1O0 湿 苗 2 号 10—0 10 0 1O0 l0—0 10 O 10O 100 10 O 100 湿 苗 3 号 10— l0 O 100 — lO0 10 O 100 10—1 l0 O 1O0 冻 干 苗89— 1号 10— l0 O 10O 10—0 10 O 100 100 10 O 1O0 冻 千苗 89— 2号 10—0 l0 O 1O0 1O 浓度O．1毫升／尾剂 量免 疫保护力 均 为100 (表 4 )。 3、保存 期 同一批细胞 培养弱毒冻干苗 保存于室温 、 4℃和一20℃三种不 同温度 半年后 的试验 结 初步 显示，细 胞培养 弱毒 冻千苗保 存于一 2O℃和 4℃6／卜月 ，效价不变 10" ～ lO 浓度 注射免 疫草鱼，免 疫保 护力 均保 持 100 但 4℃组 10 浓度 免 疫保护力 降为 88．9 ，是 效价开始下 降的标志还是 偶然 现象?有 待进 一步 试验证 明。保存于室温 的冻 千 苗效价 下降较快，保存两个月 (春季 )，效价即呈下降趋 势，10 浓度 免疫保 护力 下 降 为8O ，保 存 6个月 (春、夏季 )效价 明显 下 降 ， 10 浓度 免疫 保 护力 只 剩33．3 <袭 5 )。 27 维普资讯 http://www.cqvip.com
《珠江水产》总19期 199210。 表 细胞培养期壽湿首不同稀释度保护力试验 制备疫|疫苗剂量.免疫组对照组对照组免疫 苗的病 成活率成活率死亡率保护力 种代数浓度(毫升/尾)(%)(%)(%)(%) 10 100 10 0。2 10 100 100 55 0.2 100 0 100 10-3 02 100 100 10-4 0。2 50 0 100 10 0。2 100 90 100 10-2 0.2 IO 100 100 10 90 0。2 100 10 57 10 0。2 10 100 10-3 0。2 10 10 三、细胞弱毒疫苗中间试验与生产表证 在1988年室内小型试验基础上,1989年通过静止培养和旋转培养,制备了一些稀释 度10-3免疫保护力80~100%的细胞培养弱毒湿苗,在本所试验场进行小型中间试验和 在珠江三角洲塘鱼主产区进行生产表证与示范推广。 1、中间试验 利用本所实验小土池5口,1989年3月在鱼病流行季节之前,三口以102浓度02 毫升/尾剂量注射免疫全长9~12厘米的1冬龄草鱼共221尾,两口放入未经免疫的同规 格对照草鱼145尾,两种池塘同池均混养花鲢、白鲢、野鲮等鱼类,以控制水质。养殖 期间不加任何防治措施。同年12月份清塘收获,免疫鱼池收获204尾,成活率92.3%; 对照鱼池收获46尾,成活率319%对比效果显著。 2、生产表证和示范推广 共设4个表证示范点。免疫放养的草鱼为1冬龄,大小从全长9厘米至075公斤/尾
《珠江 水产 》 总 19期 1992．10． 表 3 细胞培养嗣 毒温巷 不蕊稀释度保 护力试验 制 备 疫 疫 苗 剂 量 ． 免 疫 组 对 照 组 对 照 组 免 疫 苗 的 病 成 活 率 成 活 率 死 亡 率 保 护 力 种 代 数 浓 度 (毫升／尾) ( ) ( ) ( ) (％ ) j 10。 0．Z 100 O 100 10O l0 0 0．2 lOO O lOO 100 55 lO一0 O．2 100 O 1O0 100 _ — — lO一0 0．2 1OO O ． 1O0 l0O lO一4 0．2 50 O lO0 50 100 0．2 100 lO 90 100 56 1O一 O．2 1O0 10 90 lOO — lO一0 0．2 lOO lO 9O lOO 】O0 0．2 100 10 90 lOO — — 57 10一 O．2 1O0 10 90 1OO — 10—0 O．2 l00 l0 90 10O l 三 、细胞 弱毒疫苗 中间试验与生产表证 在 1988年室 内小型试 验基 础上， 1989年通过静止培 养和旋 转培养，制备 了一些 稀 释 度 l0一免疫保护力 80~ 100 的 细胞 培养弱毒湿苗，在本 所试 验场 进行 小型中 间 试验 和 在 珠江三角 洲塘 鱼主产 区进行 生产表证与示范 推广 。 1、中 间试验 利用 本所实验小 土池 5口，1989年 3月在 鱼病流行季节之 前 ，三 口 IO 浓度O·2 毫升／尾剂 量注 射免 疫垒长 9～ 12厘米韵 1冬龄草 鱼共221尾 ，两 口放入未 经免疫 的同规 格 对照草鱼 145尾，两种 池塘 同池均混养花鲢 、白鲢 、野鲮等鱼类 ， 以控 制水质 。养殖 期间不加任何防治措 施。 同年12月份清塘 收获，免疫鱼 池收获204尾 ，成 活率92．3 } 对照鱼 池收获46尾， 啦活率31．9 }对 比效果 显著 。 2，生产表 证和示 范推广 。 共设 4个 表证示范点 。免 疫放 养的草鱼为 l冬 龄，大小从垒长 9厘 米至 0．75公斤／尾 28 维普资讯 http://www.cqvip.com
《珠江水产》总19期 1992。10 袅4 纽胞培勃乳毒子蓄不同握量保护知试验 免疫剂 免疫 免疫组对照组对 组,免 疫 〔毫升/尾)浓度 成活率|成活率死亡率|保护力 (%) %) ( (%) 100 100 100 2 10 10 100 100 10 100 10 10 100 100 100 100 10 100 10 100 10 100 100 10 100 0 100 100 100 不等。采用鱼体注射免疫法。疫苗浓度10-,剂量0.1~02毫升/尾。一次或多次放 种,但放种时均进行兔疫注射。养殖期间都经历了草鱼传染性疾病流行季节,一次注射 免疫后不作其它防治指施和药物处理。一般为多次收获,每次收获均记录草鱼尾数,年 终清塘计算成活率。4个表证示范点用细胞弱毒免疫的池塘共21口,总面积121.03亩, 结果每成活率均在95%以上。总计放养免疫草鱼2406尾,收获23489尾,平均成活率 达976%同时设立的3口“四病”组织苗免疫对照塘,总面积246亩,放养免疫草鱼 1586尾,收获1430尾,平均成活率亦达902%而设立的3口空白对照塘,总面积15 亩,放养草鱼4327尾,收获3182尾,成活率73.5%。 讨论 、要制备一种安全、可案、效价高的细胞弱毒疫苗,关键是驯化一种低毒、毒性
《珠江 水产 》 总19期 持92．10． 寰4 缉疆避井毋毒凑予苦 删 t器担帝城验 不 等。采用鱼体 注射免疫 法。 疫苗 浓 度 10～，剂量0．1～0t2毫升 ／尾。一次或 多 次 放 种，但放种时均进行免疫注射。养殖期间酃经历了草鱼传染性疾病流行季节，一次注射 免疫后不 作其它防治措施和 药物处理 。一般 为多次收获，每 次收获均记录草 鱼尾数，年 终清塘计算成活率。 4个表证示范点用细胞弱毒免疫的池塘共21日，总面积121．03亩， 结果 每 口成活 牢均 在95％以上 。总 计放 养免 疫草 鱼24065尾， 收获23489尾，平均成活率 迭97．6 。同时设立的3口 “四病 ”组织苗免疫对照塘，总面积24．《亩，放养免疫草鱼 1586尾，收获1430尾，平均成活率亦达90．2 ，而设立的 3，日 空 白对照塘，总面积15 亩 ，放养草鱼 4327尾， 收获3182尾，成活率73．5 。 讨r 论 一 、 要制备一种安垒、可靠、效侨高的细胞弱毒疫苗，关键是驯化一种低毒 毒性 维普资讯 http://www.cqvip.com
《珠江水产》总19期 199210。 罐把养毒冻干图不同裸存饯验 保存保存期疫苗免免疫组对照組对照组兔疫 成活率成活率死亡率保护力 温度(月);斑浓度 %) (%) 10-1 100 44.4 55。6 100 10-2 100 44.4 100 44。4 55。6 80 10 88.9 556 10° 100 100 10 80 0 100 室温 10 11。1 0 100 11。1 10 0 100 10 0 0 100 0 10° 100 100 100 10 100 0 100 100 4C 10 100 10-3 100 100 100 ID 889 100 88。9 100 10-1 100 100 100 20℃ 10-3 100 100 100 稳定、免疫原性强、适应细胞培养的弱毒株。84—1号毒株几年来在PSF细胞中经过 长期的适应性培养,在一定的培养条件下,传至53代达到了弱毒毒化的目的,注射接种
《珠 水产 》 总19期 保 存 。 保存 期 疫 苗 免 免 疫 组 对 ．照 组 对 照 组 免 疫 成 活 率 成 活 率 死 亡 率 保 护力 温 度 (月 ) 疫 敬 度 ) (％ ) ( ) (％ ) ● J l0一 lO0 44．4 55．6 lO0 ～ 】O一 1O0 {4．4 55．6 100 室 温 2 ‘ E l0—0 。 88．9 44． 4 55．6 80 — l0一‘ 88．9 44．4 55． 6 80 r lO0 10O 0 1O0 100 r 一 ‘ 10— 8O 0 lOO 80 室 6 10— 11．1 O l0O 11．1 10一。 33．3 0 10O 33．3 r - lO。‘ O 0 1O0 O J l00 l00 0 1OO 10O l0一 1O0 0 1O0 100 — — 4 6 1O一 l0O 0 10O 100 — — ’ l0—0 100 0 1OO 10O ' 10一‘ 88．9 J 一 { 0 1 0 88．9 10。 1JO0 0 100 100 _ t r 一 10一 1OD 0 10O l0O — 20℃ 6 - 10— 1O0 0。 1 1OO lOG ． J ’ r 10‘。 1O0 0 1OO 10O 】 - 10一‘ 。 。 1O0 0 1O0 l00 J 稳 定、免疫 原性 强、适应细胞 培养的弱毒株。 84— 1号毒株 几年来在PSF细胞 中 经 过 长期的适痘性培养l在 定的培养杂栉下，传至53楷达到了弱毒毒化的目的，注射接种 维普资讯 http://www.cqvip.com
《珠江水产》总19期 1992。10 草鱼不出现出血病症状、死亡或其它异常现象,而且免疫原性强,10-3浓度免疫保护力 均在85%以上。但传至60代以后,一些代数曾出现返祖现象,10°浓度注射接种出现10 ~30%显症死亡率,持续1~2代,又回复弱毒化。这是84-1号弱毒株还不够纯,或 减毒不够所致。因此,拟通过毒株克隆和异种细胞与动物强化驯化等途径,进一步纯化 和毒在尚未驯化出稳定的弱毒株以前,用篼选代作毒种,生产出的弱毒疫苗还是安 全可靠的,抗原性也较稳定。 细胞弱毒疫苗在保存和运输过程中,常因各种客观条件限制而不能全部满足所 需的要求,从而使疫苗的效价有不同程度的降低。我们研制的草鱼出血病细胞弱毒疫 苗,小型试验稀释度10兔疫保护力均达100%,14免疫保护力亦可达50%。因此在 生产上,我们认为以10-浓度使用是适宜的,可以有10倍以上的保险系数。1989年生产 表证较大面积使用的结果也证明了这一点。 、在同一浓度下注射疫苗剂量多少,其实是一个接种病毒量的问题。冻干细胞弱 毒疫苗10~浓度01毫升/尾与0,3毫升/尾免疫量引起免疫保护效应相同,免疫保护 力均达100%因此,我们在生产上使用02毫升/尾的剂量,亦有10倍以上的保险系数 四、冻干细胞弱毒疫苗不同温度的保存试验,本文报导的仅是初步试验结果。根据 畜医生物制品(6)和我们过去对组织苗的保存试验(1),冻干蓝在低温条件下保存 期一般在1年以上。草鱼出血病冻干细胞弱毒疫苗的保存期试验仍要继续下去 参考文献 (1)李焕林等,1979。草鱼传染性烂鳃、肠炎、赤皮病组织苗免疫技术的研究。 全国鱼病防止技术总结暨经验交流总资料汇绵,27~33 (2)高汉姣等,1980。草鱼出血病灭活疫苗的研究。鱼病简讯,1980( 8 (3)杨广智等,1986。草鱼出血病细胞疫苗制备方法及其免疫效果的初步研究 鱼病简讯1986(2)9~10。 (4)扬先乐等,1986。草鱼出血病细胞培养灭活疫苗研究初步报告。淡水渔业 1986(8),1~5。 (5)邓初夏等,草鱼出血病细胞培养灭活疫苗的研究及其初报。(油印材料 6)王明俊等,1983。兽医生物药品基本知识,57~64。农业出版社
《珠江 水产 》 总 I9期 草 鱼不 出现 出血 病症 状 、死 亡或 其它异常 现象，而且免疫 原性 强， l0 浓度免疫保 护力 均 在85 以上。 但传至 80代以后 ，一些 代 数 曾出现返祖现象 ，1O。浓度 注射接种 出现 1O ～ 30％显症死 亡率，持续 1～ 2代 ，又 回复 弱毒 化。这是84— 1号 弱毒株 还不 够纯，或 减毒不够所致 因此，拟通过毒株克隆和异种细胞与动物强化驯化等途径，进一步纯化 和 g摹 在尚杀驯化出稳定的弱毒株以前，用筛选代作毒种，生产出的弱毒疫苗还是安 全 可 靠的，抗原性也 较稳 定。 ， ’ 二，细胞弱毒疫苗在保存和运输过程 中，常因各种客观条件限制而不能全部满足所 需 的要求 ，从而使疫 苗的效价有不 同程度 的降低 我们研制 的草 鱼 出 血病 细胞 弱毒 疫 苗 ，小型试验稀 释度 10 免 疫保护力均达 100％， 14 免 疫保 护力 亦可达 50 o因此在 生产上，我们认为 以l0 浓度使用是适宜的，可以有1O倍以上的保险系数。1989年生产 表 证较 大面积使用 的结果也证 明了这 一点 。 三、在 同一浓度 下注射疫苗剂 量多 少，其实是一个接种 病毒 量 的问题 。冻 干细胞弱 毒 疫苗 10 ～ 浓 度0．1毫升／尾与0．3毫升／尾免 疫量 引起免 疫保护效应相 同， 免疫保护 力 均 达 100％。因此 ，我们在生产 上使用 O．2毫升／尾 的剂量 ，亦有 10倍 以上 的保 险系数。 四、冻 干细胞 弱毒 疫苗不 同温度 的保 存试验 ，本文报导 的仅是 初步 试验结果。根 据 ， ^ 、 ， ' 、 畜 医生 物制品 0 和我们过去对组 织苗 的保存试验 ， 冻干 苗在 低温条件下保存 期一般在 1年 以上 草 鱼出血病 冻干 细胞 弱毒疫苗 的保存 期试验仍要继 续下去． 参 考 文 献 (1)李 焕林 等，1979。草鱼传 染性烂 鳃、肠炎 、赤皮病 组织苗 免疫技术 的研 究。 全 国鱼病 防止技 术总结暨 经验 交流 总资 料汇绵，27～33。 (2)高汉姣 等， 1980。草鱼出血病灭 活疫 苗的研究。鱼病 简讯 ， 1980(3 )， 1 ～ 8 。 (3 )杨 广智等 ， 1986。草 鱼出血 病细胞 疫苗 制备方 法及其免疫效果 的初步 研究 。 鱼病 简讯 1986(2)9～ 10。 (4 )杨 先乐等， 1986。草鱼出血病细胞培 养灭 活疫苗研究 初步报告。 淡水 渔业， 1986 ( 3 )， 1～ 5。 c (5 )邓初 夏等，草 鱼出血病 缅胞 培养灭 活疫 苗的研究及其初 报。 (油印材料 ) (6 )王 明俊等， 1983 兽 医生 物药 品基 本知识，57~64。农业出版 社。 维普资讯 http://www.cqvip.com
