第16卷第4期 杭州大学学报 Vol 16 No 19年0月 JOURNAL OF HANGZHOU UNIV ERSITY October 1939 草鱼出血病病原病毒在鱼类 细胞中增殖的研究 毛树坚邵健忠 (生物研究所) 摘要 应用电子显微镜和放射自显影术,观察草鱼出血病两种病原病毒——草鱼呼肠孤病毒 GcR)和草鱼小RNA病毒(GCP)在鱼类细胞中的形态及殖过程的一些重要特征 着重描述GCR从“毒浆结构”发生和GCP的特殊装配形式以及两者RNA在细胞中的复 制部位和转移过程,也对两种病毒的形态发生动态、释放形式与宿主细胞的病变效应作了 观察和讨论 关键词:草鱼;出血病;呼肠孤病毒!小RNA病毒;鱼类病毒 陈燕樂等(1983)从草鱼出血病病鱼组织中分离到一种病原病毒,定名为草鱼呼肠 孤病毒(GCR).作者等(1987)又分离出一种20-30m的病毒颗粒,经病毒的 形态观察与核酸分析,初步鉴别为小RNA病毒科( Picornaviridae)病毒,可以暂名 为草鱼小RNA病毒( Grass Carp Picornavirus,GCP).将经过分离纯化的两种病 毒分别注射入健康1—2龄草鱼,可以复制出典型的草色出血病* 呼肠孤病毒曾在患传染性胰腺坏死病的鳟鱼、日本大马哈鱼及河鲶中分离得到2-43 而小RNA病毒在鱼类中还是首次发现.为进一步探讨病原病毒致病的机理,本文报道 该两种病毒在鱼类培养细胞中增殖的途径和方式, 1材料与方法 ↑.1细胞与病哥 11.1用草鱼吻端组织ZC-7901细胞株作试验用细胞,常规培养 1.1.2从典型草鱼出血病病鱼组织分离纯化到呼肠孤病毒与小RNA病毒,用 Hanks 液稀释,透析24小时,经0.22#滤膜抽滤除菌,成为病毒液 1.1.3将病毒液分别接种于传代后三天的单层细胞培养物,27℃吸附60分钟后吸去病 毒液,加维持液,27℃培养3-5天收集产生明显细胞病变效应CPE的培养物,-20℃ 冻融三次,稀释后再接种到另外的传代三天的细胞培养物,再收集CPE的培养物.如 本文1988年8月5日收到 两种病的分离纯化及其形态学观察和核酸分析;两种病毒的感染致病结果,将另文报道
第j患第 l期 j，I，年 " 月 杭 州 大 学 学 报 JOURNAL OF HANGZ}10U UNiVERSITY V01．“ NO．1 October 1，3， 草鱼出血病病原病毒在鱼类 细胞 中增殖 的研 究 毛 树 坚 邵 健 忠 (生 物 研宄 所 ) 摘 要 应用电子显微镜和放射自显影术，观察草鱼出血病 两种病原精毒一一草鱼呼酾孤 病 毒 (GCR)和草鱼小 RNA病毒 (GCP)在鱼类细胞 中的形态及增殖过程的一些重要特征 ． 着重描述 GCR 从 “毒浆结构”发生和 GCP的特殊 装配形式 厦两者 RNA在细胞 中的。复 制部位和转移 过程，也对两种病 毒的形态发生动态 、释放形式与宿 主细胞 的病变效应 作 了 观察和讨论 ． 关建 词：草 鱼}出血病}砰晒 孤病毒J小 RNA病毒 ，鱼类 病毒 陈燕桑等 (1983)从草鱼出血病病鱼组 织 中分离到一种病原病毒，定名为草 鱼呼肠 孤病毒 (GCR)“ ．作者等 (1987)又分离出一种 20—3013111的病毒颗粒， 经 病 毒 的 形态 观察与核酸分 析，初步 鉴别为小 RNA 病毒科 (Picornaviridae)病毒，可以 暂 名 为草鱼小 RNA 病毒 (GrassCarp Picornavirus，GCP)．将经过分 离纯化 的两 种 病 毒 分别注射入健康 1— 2龄草鱼，可 以复制出典型的草鱼出 血病 ． 呼肠孤病毒 曾在患传染性胰腺坏 死病的鳟 鱼、日本大 马晗鱼 及河鲶 中分离得到 “ ， 而 小 RNA病毒在鱼类 中还是 首次发现 ．为进一 步探 讨病原病 毒致病的机理，本文 报 道 该 两种病毒 在鱼类培养 细胞中增 殖的途径 和方式 ． 1 材 料 与方 法 t．1 细胞 与病毒 1．1．1 用革鱼吻端组织 ZC-7901细胞株作 试验用细胞，常规培养 1．1．2 从典 型 草 鱼 出 血病 病 鱼 组 织分 离 纯 化 到 呼 肠 孤 病 毒 与 小 RNA 病 毒 ， 用 Hanks 液 稀 释 ，透 析 24小 时， 经 0．22 滤 膜 抽 滤 除 菌 ， 成 为 病 毒 液 ． 1．1．3 将 病 毒 液 分 别 接 种 于 传 代 后三 天 的单 屡 细 咆培 养 物 ， 27℃吸 附 60分钟 后 吸 去 病 毒液 ，加维 持液 ，27'13培养 3— 5天 ．收集产生 明显细胞病变效虚 CPE的培 养 物 ，一20'13 冻融三次 ，稀释后再 接种 到另外的传代三天 的细胞 培养物 ，再 收集 CPE 的培 养物 ．如 本 文 1988年 8月 5日嘘到 ·两种病毒的 分离纯化及其形 态学观察和桉酸分析，两种病毒的感染致病结果，将另文报道 维普资讯 http://www.cqvip.com
杭州大学学报 1989年 此重复传接3-5轮次 超薄切片与放射自显影术 1.2.1从病毒接种后的0分开始、↓冫3 」20分钟,6、12、24、48、72、1 小时,分别收集培养细胞,经戊二醛固定,1%锇酸重固定,Epon812包埋,切片经 酷酸双氧铂一佇模酸铅双璪色.对照材料不经病援种侵,收集细及制片方法相同 1.2.2选生长良好的细胞堵养物,经详接种后,邡入含放线磁素D0.05g/ml的培 养基.在接种后1和24小时计,H—嘧定(〔31-Uzd,比度20Ci/mM 浓度1mCi/ml终浓度1c0 mci/l)冰;标10分钟,立闺冲洗胞并固定.接种 6小时时卯入〔31-11(终浓度1:i/m)作持续标记,分别在12、24、48和72 小时时取材固定 另一部份细胞培齐讫,在病毒接种后,加入〔11一胸院脱氧核苷(3H-dT 比度41ci/mM,浓度1mCi/ml,终浓度1mCi/m)作持续标记,分别在12、24 48和72小时时取材定 上述固定材料,常规制成b00-800A切片,喷涂40-60A厚醭膜,涂布约1:1稀 释的HW核子乳胶(中国科学院原子能研究所),“曝光”45-60天,D1g-b显影剂 显影,30%硫代硫酸钠定影,制成放肘自显影标本,H-300、H--600电镜观察 果 2.1细胞经呼肠孤病接种后,CPE出现较迟,光学显做镜观察到感染120小时后的 培养细胞发生不均等收缩,出觐丝状突起,细胞质内颗粒性物质增多,色泽变暗,随后 细胞解体,从培养瓶壁脫落.少数残留瓶壁的细胞培养物萎缩呈破网状(图版Ⅱ,1) 受小RNA病毒感斗的细胞,48小时后即出现CP.细胞拉长,色泽变暗,随后也解 体而脱落,整个单层细出现明显的空斑(图版Ⅱ,2).电镜观察,病变细胞的结构 受损,如核周控肿胀,核孔扩大,内质网扩张或产生大量空泡,线粒体变态以及出现较 多的层板膜结构.病变细胞的最后结果是细胞解体,解体肘疠淼颗粒随之释放扩散 (图版五,3) 病毒致房的毒力,随在细胞中芗次传代而增强.用初从病鱼组织分离提纯的病毒接 种绷胞,仅50%左右的细胞出现CPE,细胞中病芗颗粒的效量也少,而经在细胞中传 代5轮后的病毒感染细胞,则几乎全部细胞发生典型的CPE,病毒颗粒增多,细胞大 量解体 22呼肠孤病毒分布于细胞核时近的细驰质中,有的被包围在囊泡中,病海颗粒呈六 边形,平均直径71m,可见心和内外双层衣壳,核心部份电子密度致密,直径52m, 病毒核壳体裸露无包膜,有部份病毒颗粒仅见衣壳而无核心部份(图版Ⅱ,4) 小RNA病毒近球形,但有些可辨出六边形,可见电子密度较高的核心,大小仅 24-30nm直径,无包膜.碳熟的病动出现于细抱质的囊泡内或聚集于细胞质的一定区 域(图版Ⅱ,5) 2.3从感染肠后收卬削:切片中可以看到开始时病痄吸附于细胞膜 上,继而细胞产生吞呱动诈,肟进八胞,在3-120分钟匀细题内部见到大小不等
此 重 复 传 接 3一 s轮 次 杭 州 大 学 学 报 i989每 1．2 超 薄 切 片 与放 射 自显 影 术 1．2．1 从 病毒 接种 后 的 0分 开 始 ，每 ％ ：0、60、 120分 钟 ， 6、 i2、 24、48、 72、 120 小 时，分 别收集培养 细胞，经戊二醛 固定， 1 锇酸重 固定，Epon 812包埋， 切片 经 醋酸 双氧 铀一柠檬酸铅 双染 色 ．对照材料不经 病毒 接种侵染 ，收集绍 匏及制片方法相同 ． 1．2．2 选生长 良好 的缩胞培养 物 ，经病毒接种后 ，加^含放 线 菌 素 D O．0S~g／ml的培 养基 ．在 接 种 后 l2和 24小 时 对 ，削 [ H]一 尿 嘧淀 接 苷 ((。I{]一 Urd，比 度 2~?CUmM， 旅度 1mCi／ml，终浓度 l00mCJ／：mi)脉冲标记 】0分钟，立 即冲冼细胞 并固 定 ．接 种 6小时时加A (。H]-_u’d(终浓度 1：v．CU'm1)作持 续标 记，分 日4在 j2、24、d8和 72 小 时 时取 材 固定 ． 男一部份 细胞培养 物 ，在病毒按种后 ，加 ^ [II：一 胸腺嘧 啶脱氧核苷([。H]一dT， 比度 41Ci／mM，}农度 ln1Ci／ml，终浓度 lm Ci／m1)作持 续标记，分 别 在 12、24、 48和 72小 时 时 取 材 定 ． 上述固定材料 ，常规制成 600-800：,切片，喷涂 40—6O盖厚碳膜，涂 布 约 l：1稀 释的 Hw。核子 乳胶 (中国科学院原 子能研究所 )， “曝光”45— 60天 ，D 一 显影 荆 显影，30 硫代 硫酸钠定影 ，制成放 射 自显影标 本，H一3∞、H--600电镜观察 ． 2 结 果 2．1 细 胞 经 呼肠 孤 旃 毒 接种 后 ， CPE 出 现 较 迟 ， 光 学 显 微 镜 观察 到感 染 120小 时后 的 培 养细胞发生不均等收缩，出现丝状突起，细 胞质 内颗粒 性物质增多 ，色泽变暗 ，随后 细 胞解 体，从培葬瓶壁脱落 ．少数残 留瓶壁 的细 胞培养物 婪缩 呈破 网状 (圉版 Ⅱ，1)． 受小 RNA 病毒感 染的细 胞，48小 时后 即出现 CPE 细胞拉长，色泽变暗，随 后 也 解 体而脱 落，整个单 层细胞出现明显的空斑 (图版 Ⅱ， 2)．电镜观察，病变 细胞 的结构 受损，如梭 周腔肿胀，饺孔扩大， 内质网扩 张或 产生 大量空袍，线粒体变态 以及 出现较 多的层板膜结构 ．病变细胞 的最后结 果是细 胞解体 ，解体时病毒颗粒隧之 释 放 扩 散 ． (图版 Ⅱ，3) 病毒致病的毒力 ，随 在细 匏中多次传代 而增强 ．用 初从 病鱼组织分 离提纯的病毒接 种细胞，仅 sO％ 左右 的细胞 出现 CPE，细 胞中病毒颗粒的数量也少，而 经在细 胞中 传 代 S轮后的病毒感染细胞，则几乎全部细胞发生典型的 CPE，病毒 颗粒增 多，细 胞 大 量解体 ． 2．2 呼肠孤病毒分布 于细 胞核附近的细胞质中，有 的被包围在囊泡 中，病毒颗粒 呈 六 边形 ，平均直径 5'5nm，可 见棱心稻 内外 双层衣壳 ，核心部份电子密度致密 ，直 径 S2nm， 病 毒核 壳律裸露 无包膜 ，有部 份病 毒颗粒仅 见衣壳丽无核心部份 (图版 Ⅱ， 4 )． 小 RNA 病 毒 近 球形 ， 但 有 些 可 辨 出六 边 形 ， 可 见 电子 密度 较 高 的 核 心 ， 大 小 倥 24—3Onm 直径，无包膜 ．成熟 的病毒 出现于细 胞质的囊泡 内或聚集于细胞质的一定区 域 (图 版 Ⅱ 5 ，． 2．3 从感 染 呼肠 疆 瘩 一 看问 黼 收浆 州 蜘 饱 如片 中 可以看 到 开 始 时 病 毒 吸 附 于 细 胞 膜 上，继 而细胞产生吞噬动作，病埠进^湖 也 ．在 3u～ 讹0分钟 内 ，细胞 内部见到大小不等 维普资讯 http://www.cqvip.com
4胡 已刊三:草鱼出病*”;角终细胚中殖的哥 的吞嗷溶酶体,内含毒颗粒,些拉近7-τm,,有些仅50nm 左右,是已脱去衣壳的心,但在小RA∵!!,这仰淙酶体 呼肠孤病感:72小时时,记∵、:们粒,是该 病毒复制增殖的高岭肝翔.小限A两:的期出,跑在容杂病点48小 时左右即出现大量裝配完毕的小A病毒,|比∴E“的细跑解体和脱 也较早 在病毒增殖的高峰翔,容舄看列,病∷讨同了:在『肠孤病毒侵 染的细胞中,细胞六阡近察到一些电子度,、出懈粒:的质,与周部细胞 质界限分明,但无一定形恋的区,而利为专( A roplast)或病毒发生质结 构,在这些基质中,可清地看见正在装配或已经袋订成熟的刑毒颗粒〔图版,) 小RNA病毒的发育迂程中有一种特殊的“装配结构”,主要是细胞质中一些由膜构成 的囊泡,病毒颗粒呈串珠状排列仁∵:”臏上〔閡版Ⅲ,7).病颗粒在膜上完成裝 配后有两条发育途洷:一是走向细厭:一是些入泣内部,走问细胞质的毒颗粒是 从膜上脱落后聚集在一定区域.入它泡内部的也有两种形式:一是由泡内陷,使 病毒颗粒包陷入囊泡内,奖似胞饮形式;…类汇志上观安是呼瞎而入鹫泡内部(图 版Ⅲ,8,9) 2.4在放射自显影标本中现察到H一F讨娟组细抱及是疗:侵染的细胞中均无 掺入.〔H〕—Urd在呼肠孤病侵法的细胞内,咏冲标记的银粒!现在细胞核附近 细胞质中,持续标记的银粒主要出珂子密度铰的奖结灼区玲中(图版Ⅲ,0) 在小RNA病毒侵的细胞中,球计标记的银粒较多的分布在细胞雷的一些囊泡膜的周 缘及附近,持续标记则主要转移到囊池部(Ⅲ,1、J2).主无病毒侵终的对照 组细胞及少数病诗感的细胞中,是脉冲或指续标记,在个别小细胞核中出理少量 〔H一Urd掺入的很粒 讨论 3.1呼肠狐病辱与小RNA别分别感草鱼培养细胞,都能使河温受侵产生CPE 但初次受侵染细跑的CPE不严重,随音病在细中多次传代,CPE还渐阴显,说明 病毒在宿主细胞中复制增轳,对宿主细临的坯有一个适应的过私,另外,翟中和等曾 详细研究动物病在细孢内增殖的特点,发现嗬感染的细咝配下同程度上都出现 CPEθ,本文研宄的两种病趕也能引起多类似的结果,说明不同病感染后出现的细 胞病变结果与病的分类地位无胆显钓关系,这结果对研究居藏与宿主细跑的关系及 抗病毒细胞的选培养很有帮助 3.2在呼肠孤病毒感染的细胞中,『—Urd的标汜发现在纽胞核驸近区域和毒浆结 构中,说明病券的RNA复制是在细息质中进行,以后随着RNA及它蛋白质的合成,集 中到一定区域形成毒浆结构,病苧颗拉在此结沟中装配及发育熱,这与以前有关呼肠 孤病毒及其它RNA病毒发育的投庭一致,2.小RNA病毒的H-Urd脉冲标记的 掺入是在细胞质囊泡跗近及囊泡膜上,持续标记是在褒泡的内部.说明病毒RNA的复 制是在囊泡附近的细胞中进行,RNA合成后到达泡的膜上装配成病毒颗粒,以后
蒡 4期 毛 耐羔 荨：草 …血 癌病 掰搿 一龟英 细胞 中 r照 昀孑}咒 173 的 吞 噬 溶 酶体， 内台病毒颗粒 ，有些颗 粒近 7c～s m，Z：L铰 毫 整，有 些 仅 5Onm 左右，是 已脱去衣壳【’核心 ．但 在小 A j感 i|l捆隆 见这和：吞 溶 酶体 ． 呼肠 孤 病 毒 感 染 72小 时 时 ， 钿 匏 ：{现 譬 ! ：n笼 掏免 基 昀疵 颈 粒 ， 是 该 病 毒 复 制 增 殖 的 高 时 期 ．，】、RNA l 的 瑚 ，：。碣 -期 出 M捩 i、． 啦 在感 染 病 毒 dsd, 时左右 即出现大量 装 完 毕的小 R A病毒 ， l囊此 枣· ‘、 疵0 ，细 胞解体 和 脱 落 也 较 早 ． 在 病 毒增 殖 的 岛 峰 翔 ， 容 易看 神 病 日复 矾 一币 同 了式 ； 在 呼 晒孤 病 毒 侵 染 的 细 胞中 ， 细 胞 咳m 近 规 察 到 一 些 }也子 婆度 薯、 出 粒 物 质 组 成 ∞ 基 质 ， 与周 邻 细 胞 质 界 限分 明 ，但 无 一 定形 态 的 区 域 ． ”】以嗣 为 荨紫 坫 柯 (viroplast)或 病 毒 发生 蟹 质 结 构 ．在这 些 基 质 中 ， 可 清 晰 地 看 见 正 在 装 配 或 已 经发 育 成 熟 的病 毒 颗 粒 (图 版 Ⅱ ，6)． 小 RNA 病 毒 的 发 育 过 程 中有 一 种 特殊 的 “装 配 结 构 ” ， 主要 是 细 匏 质 中 一 些 由膜 构 成 的囊泡，病毒颗粒呈 串珠状排 歹c仨囊 0膜 』：(圈版 Ⅲ， 7 )．病毒颗粒在膜上完成装 配后 有两条发育途径：一 是走 向绷盟质 ；一是进 A囊 澎内部 ．走 向细胞质的病毒颗 粒是 从膜上脱 落后 聚集在一定区域 ．进入囊池 内部 的也有两种形 式：一粪 是由囊 泡内陷，使 病毒颗粒 包陷入囊泡内 娄 fc』胞饮形式；另 一娄 形态上 观察是 穿胜 而入囊 泡内部 (图 版 Ⅲ， 8，9 ) 2．4 在放射 自显影标本 中观察到 ：：}}—dT 对照组细胞 及受瘸 侵 染的细胞 中均 无 掺 入 ．[H3-Urd在呼肠孤 病毒侵 染的锢胞内 脉冲标记 的银粒 m现 在细胞 榜 附 近 的 细胞质 中 ，持续标记 的银粒 主要 出现 在电子膏度 较商昀毒装结构区域 中 (图版 Ⅲ，]0)． 在 小 RNA 病 毒 侵 染 的细 胞 中 ， 脉冲 标 记 的 银 粒 较 多的 分 布 在 细胞 质 的一 些 囊 泡膜 的 周 缘及 附近 ，持 续标记则主 要转移到囊逊 肉都 (图版 Ⅲ，1i、j2) ，f无病毒 侵染的 对照 组 细 胞 及 少 数 病 毒 感 染 的 细 胞 中 ，不 沦是 脉 冲 或 持续 标 记 ， 在个 5]_!冉细 胞核 中 出 理 少量 [。H]一 Urd掺 八的 银 粒 ． 3 讨 论 3．1 呼 肠 孤 病 毒 与 小 RNA 瘸 分别 感 草 鱼培 养 细 胞 ，都 能使 细 胞 受 餐 染产 生 CPE． 但 初 次受 侵 染 细 胞的 CPE 不 严 重 ． 随着 病 ； 在 细 胞 中 多次 传 代 ，CPE 逐 渐 明显 ，说 明 病 毒 在 宿 主 细 胞 中 复 制增 殖 ， 对 宿 主 细 胞 的 环 境 有 一 个 适 应 的 过 程 另 外 ， 翟 中和 等 雷 详细研究 动物病 毒在细胞内增 殖的特 点，发现病毒感 染的细 胞在 同 程 度 上 都 出 现 CPE 本文 研究的两种病毒也毙 引起许多类似帕结果，说 嗝不 同病毒感染后出现的细 胞病变 结果与病毒的分类地位无 聪显构关 系 这 些结果 研究 病毒与宿主细胞的关系及 抗病毒细 胞的筛选培养很有 帮助 3．2 在呼 肠孤病毒感染的细 咆中 ，(。}{]一urd灼标记 发现在细 胞核 驸近 区域和毒浆 结 构 中 ，说 明病 毒 的 RNA 复 制 是 在细 胞 质 r目进 行 ，以 后 随 着 RNA 及 篡它 蛋 白质 的合 成 ，集 中到一定 区域形 成毒浆 结构，病 毒颗 粒在此结构 -装配 及发育成熟，这 与以前 有关 呼肠 孤病毒及其 它 RNA病 毒发育的授道一致” ．小 RNA病 毒的 [。I{j—Urd脉冲标记 的 掺 入是在细胞质 囊泡跗近 及囊泡膜 1，持续标记 是在囊泡 的 内部 ，说 l马病毒 RNA 的 复 制是在囊泡 附近 的细胞质 中进行，RNA 合成后到达囊泡的膜上装配成病毒颗 粒，以 后 维普资讯 http://www.cqvip.com
474 杭州大学学报 1989年 又通过两种形式进入囊泡内部或脱离囊泡膜而进入细胞质的一定区城,小RNA病毒的 复制与装配以前 Rekosh等曾提到是在细胞内一些光面膜结构—被称为“复制复合 体”( Replication complex)上进行的, Rekosh等还在脊髓灰质炎病毒感染的细胞内 发现大量的由膜包围的胞质小体和空泡,病毒装配后密集于这些小体和空泡之间,或进 入小体或空泡内部,翟中和等也曾报道猪水泡病毒与科萨奇B5病毒装配时在内质网 泡膜的凹陷处显串珠状排列町.这些情况与本文观察到的结构类似,说明草鱼出血病的 小RNA病珲在鱼类宿主细中的增殖与已郯小RNA病毒在形态发生上,存在共同的 特征 3.3放线菌素D能抑制细胞的RNA转录,而对单股RNA病毒一般没有影响.但这 种抑制取决于放线菌素D的浓度0-12.有人对哺乳动物呼肠孤病毒研究表明,放线菌 素D浓度低于0.5g/m时,对细胞RNA代谢的抑制很完全,而对病毒RNA复制影 响很小,木文在预备实验中发现放线菌素D对鱼类细胞毒性很大,因此选用0.05Kg/ml 浓度.经处理后,对照组细胞90%以上未发现被〔H-Urd标记,而感染病毒的细胞 仍有大量的掺入.说明在此浓度的放线菌素D对鱼类细胞RNA代射的抑制效果较 好,而对两种病毒的RNA复制影响不大.但在对照组细胞及受病毒侵染细胞核中都发 现有少量〔H一Urd的掺入,这是由于在0.05kg/ml浓度下,尚有少量细胞本身的 RNA转录未被抑制 34实验所用细胞都是生长致密的处于接触抑制状态的单层培养细胞,这类细胞被认 为是处于G1期;因此没有DNA的复制.实验结果说明两种病毒的复制都是RNA→ RNA;没有经过反转录的环节 陈汉民同志参加部分电镜工作,浙江省淡水水产研究所张念慈同志等绘予大力协助,谨致谢 沈 考文献 1陈燕榮,江育林.科学通报,1983:18:1138-1140 2 Wolf K. Fish Pathology, 1976: 10:135-154 3 Winton J R, et al. Fish Pathology,1981, 15:155-162 Hedrick R P, et al. J Gen Virol,1984:65 5张念慈,杨广智.实验生物学报,1981}14:101-105 6翟中和,潘维钓等.微生物学报,1981;21:375378 7邓初夏,杨兴棋,陈宏溪.水生生物学报,I9859:351-357 8 Silverstein S C, et al. J Cell Biol, 1968,36: 197--230 9 Rekosh D M K. The Molecular Biology of Animal Virus. New York: Nayak DP,1977:67-69 10 Kudo H, et al, J Bacteriol, 1065, 90: 936-945 11 Shakin A J, Biochem Biophys Commun, 1965;19: 506-516 2 Loh P C, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1965, 54: 857--863
抗 州 太 掌 学 报 又通过两种形 式进 入囊泡 内部或脱 离囊泡膜 而进八细胞质的一定区域 ．小 RNA病 毒 的 复制 与装配 以前 Rekosh等 曾提到 是在 细胞内一些光面膜 结构——被 称 为 “复 制 复 合 体” (Replicationcomplex 上进行 的，Rekosh等还在脊 髓灰质 炎病毒感 染的细胞 内 。 发现大量的 由膜 包围的胞质 小体和空泡，病毒装配后密集于这 些小体和空泡之间， 或进 入小体或空 泡内部 ；翟 中和等也 曾报道 猪水泡病毒与科萨 奇 B5病毒装配 对在内质 网 ． 泡膜 的 凹陷处呈 串珠状排列 ．这些情况 与本文 观察到的结构类似 ．说 明草鱼 出血病的 小RNA 病毒在 鱼类宿主 细胞 中的增殖与 已知小 RNA 病毒 在形态 发生 上，存在 共 同 的 特 赶 ． 3．3 放 线菌素 D 能抑制细胞的 RNA 转录，而 对单股 RNA病毒一 般没有影 响 ．但 这 种 抑制取决 予放线 菌素 D的浓度 “ ．有 入对哺乳动物呼肠孤 病毒研究 表明，放 绒 菌 素 D浓 度低于 0．5#g／ml时，对 细胞 RNA代谢 的抑制捉完 全，而对病 毒 RNA 复制 影 响很小．本文在预 备实验 中发现放 线菌素 D 对鱼类细胞毒性很 大， 因此选用 0．05 mI 浓度 ．经处理后，对照组细 胞 90 以上未 发现 被 [。H]一 Urd标记 ，而 感染病毒的细胞 仍 有 大 量 的掺八 ．说 明在此浓度的放线菌素 D 对鱼类细 胞 RNA 代射 的抑 制 效 果 较 好 ，而 对两种 病毒 的 RNA复制影响不大 ．但在对照 组细 胞及受病 毒侵 染细 胞核 中都 发 现 有少量 [H]一 urd的掺 入，这是 由于 在 0．05~g／ml浓 良下，尚有少量细 胞 本 身 的 RNA 转录 来 被 抑 制 ． 3．4 实验所 用细 胞都 是生长 致密的处 于接触抑制 状态 的单层培养细胞，这 类细胞 被 认 为 是处于 G 期 因此没有 DNA的复制 ．实验 结果说 明两种病毒 的 复 制 都 是 RNA— RNA，没 有经过反 转录的环节 ． 忱 陈汉 民同忘参加部分电镜工作J渐江省淡水承产研究所张念慈 同志等给予大 力 协 助，谨 致 谢 参 考 文 献 陈燕桑，江 育林 ．科 学通 报，1983~18：1138- 11a0 W olf K ． Fish Pathology， 1976~ 10：j35一 J54 W inton J R， ai．Fish Pathology， 1981} 15：1S5— 162 I-Iedriek R P， et a1． j Gen Virol， 1984, 65：1527- 1534 张念 慈， 杨广 智 ．实验生物 学报，1981~14：1O1一l05 翟中和， 潘维钧等 ．微生物学报， 1981}21：375--378 邓 初夏，杨兴棋，陈宏溪 ．水生生 物学报，1985~9：351—357 Siiverstein S C ， et ai． Ceil Biol， 1968~ 36：197～ 230 Rekosh D M K ．The MoleeulaI"~iology of AnlraalVirus． New York：Nayak D P， 1977：67— 69 Kudo H ， eta1． 】 Baeteriol， 1965~ 90：936— 94S Shakin A J． Biochem BiophysCommun， 1965~ 19：506— 5l6 Lob P C， et ai．Proc NatlAcad SciUSA， 1965~ S4：857- 863 l 2 3 4 S 6 7 8 9 加 u 维普资讯 http://www.cqvip.com
4期 毛树坚等,草鱼出血病病原病毒在鱼类细胞中增殖的研究 475 Studies on the Reproduction of Patho of grass Carp h ge in fish Cell lan Research Institute of Biology Abstract The is and some im t characterise th reproduction of two kinds of pathogenic virus of Hemorrhage of Grass Carp, Reovirus(GCR )and Picornavirus, in fish cell culture were studied by means of electron microscope and electron microscopic autoradiography. In thi paper, it mainly describes the occurence of Reovirus in "Viroplast"and the special assembly form of Picornavius as well as the location of the two viral RNA synthesis and the course of transition aditi e dynamics of viral morphogenesis and pathogenetic effects on the cells infected by one f these two viruses were discussed as well Key words: Grass carp, hemorrhage reovirus, picornavirus, fishes vitus
尊 4期 毛树坚 等。草 鱼出血病宿 愿寤毒在鱼类细胞 中增殖的研究 475 Studies on the Reproduction of Pathogenic Virus of Grass Carp H em orrhage in Fish Cells Mao Shujian Shao Jianzhong (Research Institute of Biology ) Abstract The morphogenesisand SOl~f1．e important characterjscics in the cour$~ of reproduction of two kinds of pathogenic virus of HemorrhageofGrass Carp， Reovirus(GCR )and Picornavirus，in fist1eellculture werestudied by means of electron microscope and electron microscopic autoradiography． In this paper， it mainly descrribes the oecu．rellee of Reovirus in “Viroplast” and the specialassembly form of Picornavius ns wellas the location ofthe two virnl RNA synthesis and the course oftransition．In addition．the dynamics of viralmorphogenesis and pathogenetlc effects oilthe cells infected by one of these two viruses were discussed as w eI1． Key words：Grass carpi hemorrhage~ reovirttsl picornavirus! fishes virus 维普资讯 http://www.cqvip.com
