《草鱼出血病》两株水生呼肠孤病毒部分特性的比较

维普资讯 i http://www.cqvip.com.cqvip.com 第18卷5期 中国病毒学 18(5):464-467 2003年10月 VIROLOGICA SINIGA October 2003 两株水生呼肠孤病毒部分特性的比较 方勤1,丁清泉1,汪亚平2,朱作言2 (1.中国科学院武汉病毒研究所,湖北武汉,43001:2.淡水生态与生物技术国家重点实验室,中国科学院水生生物研究所,湖北武汉430072) Partial Characteristic Comparison Between Two Aquareovirus Isolates FANG Qin', DING Qing-quan', WANG Ya-ping', ZHU Zuo-yan 2 1. Wuhan Institute of Virology. Chinese Academy of Sciences. Wuhan 430071, China 2. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology; Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China Abstract: Aquareoviruses, which belong to a newly identified genus of the family Reoviridae, are agents infecting all kind of aquatic animals. Grass carp reovirus (GCRV) was isolated from outbreak grass carp fingerling in South China freshwater region, and Threadfin reovirus (TFV) is a Singapore isolate from acute diseased marine threadfin fingerling In this study, the partial characterization between GCRV and TFV were compared. It showed that two viruses can cause CPE in CIK cell line,but not all the same in the other compared fish cell lines. In addition, their RNA genome compositions are different by both electrophoresis and RT-PCR. It is interesting to point out that, based on serological related Western blot analysis, the antiserum against GCRV could cross detecting some of the proteins found in TFV, but not all of the proteins. It suggested they may share some similar epitopes. Key Wards: Aquareovirus; Grass carp reovirus(GCRV); Threadfin reovirus(TFV); Characteristic comparison 摘要:水生呼肠孤病毒为感染水生动物的一类病原体,隶属于呼肠孤病毒科新建水生呼肠孤病毒属。草鱼呼肠孤 病毒(Grass carp reovirus,GCR)是引起中国南方淡水养殖草鱼暴发性出血病病原,鱼呼肠孤病毒(Threadfin reovirus,tv)是引起海水养殖鲅鱼病毒病病原本研究将GCRV与新加坡TFV分离株进行了部分特性比较研 究。结果表明,GCRV与TF均能感染CK细胞,但对其它鱼类细胞系的敏感性有所差异。此外,凝胶电泳与 逆转录聚合酶链式扩增显示,GCRV与TFV核酸属不同的基因型。在多肽特性上,证实了GCRV的5条主要结 构多肽具有与FTV及水生呼肠孤病 Wester毒相似的特性。 blot检测显示,草鱼呼肠孤病毒与TFV结构蛋白拥有 部分相同的抗原决定簇。 关键词:水生呼肠孤病毒:草鱼呼肠孤病毒:鱼呼肠孤病毒;特性比较 中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1003-5125(2003)05-0464-04 水生动物病毒是严重危害水产养殖及疾病传检测试剂的不完善,使得各种病原体很容易通过进 播的主要病原。随着水产集约化养殖业的迅速发展,出口途径在世界各地传播。最近在新加坡大面积爆 病毒性流行病频频发生,这些疾病在世界范围内对发的马鲅鱼流行病,已证实其病原为水生呼肠孤病 水产养殖造成了极大的危害。有资料显示,85的毒2。这是继1978年中国南方暴发性草鱼出血病大 世界水产品供应来自亚洲,特别是在我国南方地区规模流行后,在亚洲水产养殖区域发生的又一严重 及东南亚一带,水产养殖业为重要的经济来源,而的传染性病毒病。草鱼呼肠孤病毒(Grass carp 病毒性疾病的发生严重地影响了这些地区水产养 reovirus,GCRV)为中国分离鉴定的第一株鱼类病 殖业的健康稳定发展近年来,由于国际间鱼苗、毒,在GCRV研究方面,国内相继进行了系统的病 鱼卵以及鱼制品进出口的日益增多及检疫制度与毒流行病学、生物化学及分子生物学等研究 收稿期:20303-18回日期:2003-04-20 基金项目:国家自然科学基金资助项目日3017073):“淡水生态与生物技术国家重点实验室”开放课题(202B05 作者简介:方勤(1961-),女,湖北省籍,副研究员,博士。主要从事 dsRNA病毒的分子生物学及基因工程研究

第 18卷 5期 2003年 10月 中 国 病 毒 学 VIR0L0GICA SINIGA 18 (5)：46卜 467 October 2003 两株水生呼肠孤病毒部分特性的比较 方 勤 ，丁清泉 ，汪亚平 2，朱作言 2 (1．中国科学院武汉病毒研究所，湖北武汉，430071：2．淡水生态 与生物技术国家重点实验室，中国科学院水生生物研究所，湖北武汉 ，430072) PartialCharacteristicCom parisonBetweenTwoAquareovirusIsolates FANG Qin，DINGQing—quan，WANGYa-ping，ZHUZuo—yan (I．WuhanInstituteofVirology,ChineseAcademyofSciences。Wuhan430071．China：2．StateKeyLaboratoryof FreshwaterEcologyandBiotechnology,InstituteofHydrobiology,ChineseAcademyofSciences，Wuhan430072,China) Abstract：Aquareoviruses，which belong to a newly identified genus ofthe family Reoviridae，are agentsinfectingallkindofaquaticanimals．Grasscarpreovirus(GCRV)wasisolatedfrom outbreak grasscarp fingerlinginSouthChinafreshwaterregion，andThreadfinreovirus(1f1W )isaSingapore isolate from acute diseased marine threadfin fingerling． In th is study, the partialcharacterization betweenGCRV andTFV werecom pared．ItshowedthattwovirusesCan causeCPE in CIK cellline，but notallthesamein theothercompared fish celllines．In addition．theirRNA genome compo sitionsale diferentby both electrophoresisand RT_PCR．Itisinteresting to pointoutth at．based on serological related W estem blotanalysis．m eantiserum againstGCRV could crossdetecting some oftheproteins foundinTFV butnotalloftheproteins．Itsuggestedtheym aysharesomesim ilar epitopes． KeyWards：Aquareovirus；Grasscarpreovirus(GCRV)；Threadfinreovirus(TFV)；Characteristiccomparison 摘 要：水 生呼肠孤病毒 为感染水 生动 物的一类病 原体 ，隶属 于呼肠孤 病毒科新建水 生呼肠孤病 毒属 。草鱼 呼肠孤 病 毒 (Grasscarpreovirus，GCRV)是引起 中国南方 淡水养殖草 鱼暴发性 出血病病原 ，鲅鱼呼肠孤病 毒 (Threadfin reovirus，TFV)是引起 海水养殖鲅 鱼病 毒病病 原。本研 究将 GCRV 与新加坡 TFV分离株进 行 了部分特性 比较研 究。结果表 明，GCRV 与 TFV 均能感染 CIK 细胞 ，但对 其它鱼类 细胞系 的敏感性 有所差异 。此外 ，凝胶 电泳与 逆 转录聚合酶 链式扩增显 示，GCRV与 TFV核酸 属不同 的基 因型 。在 多肽特 性上 ，证 实了 GCRV 的 5条 主要结 构 多肽具有与 F1’V及 水生呼肠孤 病毒相似 的特 性。Westernblot检测显 示 ，草鱼 呼肠孤 病毒与 TFv结构 蛋 白拥有 部 分相 同的抗 原决定簇 。 关键词 ：水 生呼肠孤病毒 ：草鱼呼肠孤 病毒 ；鲅鱼 呼肠孤病 毒；特 性 比较 中图分类号 ：Q78 文献标 识码 ：A 文章编 号： 1003—5125(2003)05—0464—04 水生动物 病毒是严 重危害 水产养殖 及疾病传 播 的主要病原。随着水产集约化养殖业 的迅速发展， 病毒性流行病频频发生，这些疾病在世界范围内对 水产养殖造成了极大的危害 。有资料显示 ，85 的 世界水产 品供应来 自亚洲 ，特别是在我国南方地区 及东南亚一带，水产养殖业为重要的经济来源 ，而 病毒性疾 病 的发 生严重地影 响 了这些地 区水产养 殖业的健康稳定发展¨J。近年来 ，由于国际间鱼苗、 鱼卵 以及 鱼制 品进 出口的 目益 增多及检 疫制度与 检测试剂 的不完善，使得各种病原体很容易通过进 出口途径在世界各地传播 。最近在新加坡大面积爆 发的马鲅鱼流行病，已证实其病原为水生呼肠孤病 毒 】。这是继 1978年中国南方暴发性草鱼 出血病大 规模流行后，在亚洲水产养殖区域发生的又一严重 的传 染 性病 毒 病 。草 鱼 呼肠孤 病 毒 (Grasscarp reovims，GCRV)为中国分离鉴定的第一株鱼类病 毒，在 GCRV研究方面，国内相继进行 了系统的病 毒流行病学 、生物化学及分子生物学等研 究【3．7】； 收稿 日期：2003．03=18，修回 日期：2003．04．20 基金项 目：国家自然科学基金资助项 目 (30170730)：“淡水生态与生物技术 国家重点实验室”开放课题 (2002FB05) 作者简介：方勤 (1961一)，女，湖北省籍，副研究员，博士。主要从事 dsRNA病毒的分子生物学及基因工程研究。 维普资讯 http://www.cqvip.com

维普资讯htp/www.cqvip.com 方勤,等,两株水生呼肠孤病毒部分特性的比较 Rangel等认为,GCRV为水生呼肠孤病毒中致病性 effect,cPE),按Reed- Muech法测定病毒TCDs 最强的毒株。鲅鱼呼肠孤病毒( Threadfin reovirus,滴价。GCRV与TFV的病毒纯化与核酸提取按文献 TFV)为引起鲅鱼鱼苗爆发流行病的病原,对其寄[7进行 主同样具有极强的致病性2。为了了解水生动物病1.3逆转录聚合酶链式反应( RT-PCR) 毒病原侵染途径与致病机理,预防病毒病发生与蔓 根据已知 GCRVgn S10外壳基因片段序列14 延,我们对这2株水生呼肠孤病毒分离株进行了细分别设计一对含开放阅读框和一对含糖基化位点 胞感染及相关分子生物学特性等比较研究。其目的的引物进行GCRⅴ与TFV的 RT-PCR扩增。扩增条 在于进一步了解各毒株基因组的复制特性及与宿件为:首次94C变性3min,然后按常规PCR进 主的相互作用关系,为重组水生呼肠孤病毒基因工行30循环的PCR扩增,即94°C(30s),55°C(45s), 程疫苗的研制与抗病毒研究奠定基础。 72C(60s),最后72°C,延伸5min。.用1%的琼脂 1材料与方法 糖凝胶电泳检测PCR产物,EB染色,紫外灯下观 察结果。引物名称与序列为:1).GCRv-S10-SF 1材料 5 CAT GGA TCC CCG ATC ATC ACC ACG AT3 细胞与病毒毒株:实验用草鱼肾细胞系26mers2)GCRS10ASF:5 CGC TGA ATT CGA Ctenopharyngodon idellus kidney cell, CIK) HtE. TGA AAC GAG AGA CC326merso 3).GCRV-S10- 文功等建立,本实验室保存,传代165代。肥头SF1:5 CAT GGA TCC TCT AAG GAT ATC GTC 鲤细胞( Fathead minnow cel,FHM)由法国马赛地324mers 中海大学医学院H. Attoui博士馈赠,传代次数为14结构蛋白的 SDS-PAGE与 Western blotting分 145代。蓝鱼细胞( Bluegil fry cell, BF2)与鲤鱼上 皮瘤细胞( Epithelioma papulosum cyprini cell.c 病毒蛋白的 SDS-PAGE按 Lamm方法进行, 细胞系由德国慕尼黑大学动物学院S. Ssbauer博浓缩胶为4%(pH6.8),分离胶为12%(pH8.9) 士馈赠,传代次数分别为168、175代。草鱼呼肠将在凝胶电泳中分离的GCRv与TFV多肽转移至 孤病毒湖南邵阳( gCRv873)与长沙株( GCRV9g)硝酸纤维素滤膜( Nitrocellulose membrane)上进行 均为本实验室保存。马鲅鱼呼肠孤病毒毒株(TFV) Western blotting分析,具体方法参见分子克隆1, 由新加坡国立大学生命科学院 YM Sin教授提供。转移的滤膜用5%牛血清白蛋白封闭,然后加入稀 试剂:病毒RNA提取试剂盒 RNA Now kit为释的兔抗GCRv抗体(1:10),37℃浮育2h, Biogentex公司产品。PCR扩增试剂及Taq酶为抗为碱性磷酸酶标记的羊抗兔lgG-AP(1:1000, Perkin elmer产品。兔抗GCRⅤ抗血清为本实验室 NBT-BCIP显色。 制备。PCR引物由大连 TaKaRa公司合成 1.2细胞培养与病毒增殖 2结果 草鱼肾CIK细胞的培养按本实验室常规方法21GCRv与TFV的细胞感染特性 进行。培养液为含10%超级小牛血清的 Eagles 采用CIK、BF2、EPC与FHM细胞系,在28℃ MEM培养基(MEM10),pH7.2。CK细胞最适培培养温度下,分别对GCRv与TV进行了细胞敏 养温度为28℃,细胞生长2-3d,待基本铺满培养瓶感性实验,结果表明,两者的细胞培养特性存在 瓶底后,采用0.1%的胰蛋白酶消化贴壁细胞,进定的差别(表1)。对GCRV敏感的细胞株有CK 行传代培养,HHM、BF2及EPC细胞的培养均按与FHM,对FrV敏感的细胞株为CIK和BF2。其 上述方法进行。病毒增殖方法为:挑选处于对数生中,两种病毒共有的敏感细胞株为CIK细胞。在 长期的细胞分别接种草鱼呼肠孤病毒(GCRV)和CIK细胞中增殖,两者的病毒滴度均可达到 马鲅鱼呼肠孤病毒(TFV),按1/10的培养体积加103TCID5mL;BF2细胞是FrV的敏感细胞株,但 入感染的病毒悬液,病毒的感染复数MOI( Multip-对GCRⅤ不敏感,病毒感染细胞后不能产生CPE。 icity of infection)为5-10PFUe,在病毒悬液吸FHM细胞对GCRV较为敏感,病毒感染细胞的滴 附细胞3060min后,倒掉未吸附的病毒悬液,然后度可达到10 TCID/mL,但对TFV不很敏感,滴 用1×PBS清洗3次,去除未吸附的病毒颗粒。采度很低,难以测定。EPC细胞对两种病毒都不敏感。 用含2%小牛血清的MEM(MEM2)维持液进行通过细胞敏感性测定,可以推测2种病毒表面蛋白 病毒增殖,2-3d后观察细胞病变效应( Cytopathic存在与CIK细胞共同作用的敏感蛋白因子 IT III

方勤 ，等．两株水生 呼肠孤病毒 部分特性 的比较 465 Rangel等认为，GCRV为水生呼肠孤病毒中致病性 最强的毒株 J。鲅鱼呼肠孤病毒 (Threadfinreovirus， Ⅱ )为引起鲅鱼鱼苗爆发流行病 的病原，对其寄 主同样具有极强 的致病性 J。为了了解水生动物病 毒病原侵染途径与致病机理 ，预防病毒病发生与蔓 延 ，我们对这 2株水生呼肠孤病毒分离株进行了细 胞感染及相关分子生物学特性等 比较研究。其 目的 在于进 一步 了解各毒株 基 因组 的复制特性及 与宿 主的相互作用关系，为重组水生呼肠孤病毒基 因工 程疫苗的研制与抗病毒研究奠定基础。 1 材料 与方 法 1．1 材料 细 胞 与 病 毒 毒 株 ： 实 验 用 草 鱼 。肾细 胞 系 (Ctenopharyngodonidelluskidneycell，CIK)由左 文功等建立【9】，本实验室保存，传代 165代。肥头 鲤细胞 (Fatheadminnowcell，FHM)由法 国马赛地 中海大学医学 院 H．Attoui博士馈赠，传代次数为 145代。蓝鱼细胞 (Bluegilfrycell，BF2)与鲤鱼上 皮瘤细胞 (Epitheliomapapulosumcyprinicell，EPC) 细胞系 由德国慕尼黑大学动物学院 S．Essbauer博 士馈赠 ，传代次数分别为 168、175代 。草鱼呼肠 孤病毒湖南邵阳 (GCRV873)与长沙株 (GCRV991) 均为本实验室保存 。马鲅鱼呼肠孤病毒毒株 (TFV) 由新加坡国立大学生命科学院 YM Sin教授提供。 试剂：病毒 RNA提取试剂盒 RNA Now kit为 Biogentex 公司产 品。PCR 扩 增试剂及 Taq 酶为 PerkinElmer产品。兔抗 GCRV抗血清为本实验室 制备。PCR引物 由大连 TaKaRa公司合成。 1．2 细胞培养与病毒增殖 草鱼。肾 CIK 细胞的培养按本实验 室常规方法 进行 。培 养液 为含 10％超级 小 牛血 清 的 Eagle’S MEM 培养基 (MEM一10)，pH7．2。CIK细胞最适培 养温度为 28"C，细胞生长 2—3d，待基本铺满培养瓶 瓶底后 ，采用 0．1％的胰蛋 白酶消化贴壁细胞 ，进 行传代培养 ，FHM 、BF2及 EPC细胞的培养均按 上述 方 法进 行 。病 毒 增殖 方 法 为 ：挑 选 处 于对 数 生 长期 的细胞分别接种草鱼呼肠孤病毒 (GCRv)和 马鲅鱼呼肠孤病毒 (n )，按 1／10的培养体积加 入感染的病毒悬液，病毒 的感染复数 MOI(Multip— licityofinfection)为 5—10PFU／cell，在病毒悬液吸 附细胞 30—60min后，倒掉未吸附的病毒悬液 ，然后 用 1×PBS清洗 3次，去除未吸附的病毒颗粒 。采 用含 2％小牛血清的 MEM (MEM一2)维持液进行 病毒增殖 ，2—3d后观察细胞病变效应 (Cytopathic effect，CPE)，按 Reed—Muech法 测 定病 毒 TCIDso 滴价 。GCRV与 耵 的病毒纯化与核酸提取按文献 [7]进行 。 1．3 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 根据 已知 GCRV873S10外壳基因片段序列 41， 分别设计 一对含开放 阅读框和 一对 含糖基化位 点 的引物进行 GCRV与 耵Ⅳ 的 RT-PCR扩增 。扩增条 件 为：首次 94。C 变性 3min ，然后按常规 PCR进 行 30循 环 的 PCR扩 增 ， 即 94。C (30s)，55。C (45s)， 72。C(60s)，最后 72。C。延伸 5min。采用 1％的琼脂 糖凝胶 电泳检测 PCR产物 ，EB染色，紫外灯下观 察 结 果 。引 物 名 称 与 序 列 为 ： 1)．GCRV-S10一SF： 5’CAT GGA C CCG ATC ATC ACC ACG AT3’ 26mers。 21．GCRV-S10一ASF：5’CGC Z’GA AT／"CGA TGA AAC GAG AGA CC3’26m ers。 31．GCRV-S10一 SF1：5’CAT GGA Z℃ C TCT AAG GAT ATC GTC 3’24mers。 1．4 结构蛋 白的 SDS—PAGE与 Western blotting分 析 病毒蛋白的 SDS—PAGE按 Laemmli方法进行【l”， 浓缩胶为 4％ (pH6．8)，分离胶为 12％ (pH8．9)。 将在凝胶电泳 中分离的 GCRV 与 耵 多肽转移至 硝酸纤维素滤膜 (Nitrocellulosemembrane)上进行 Westernblotting分析，具体方法参见分子克隆【】， 转移的滤膜用 5％牛血清 白蛋 白封 闭，然后加入稀 释 的兔抗 GCRV抗体 (1：10)，37"C浮育 2h，二 抗为碱性磷酸酶标记的羊抗兔 IgG—AP (1：1000)， NBT-BCIP显 色 。 2 结 果 2．1 GCRV 与 TFV的细胞感染特性 采用 CIK、BF2、EPC与 bTqM 细胞系 ，在 28℃ 培养温度下，分别对 GCRV 与 耵 进行 了细胞敏 感性实验，结果表 明，两者的细胞培养特性存在一 定 的差别 (表 1)。对 GCRV 敏感的细胞株有 CIK 与 FHM，对 FTV敏感的细胞株为 CIK和 BF2。其 中，两种病毒共有 的敏感细胞株为 CIK 细胞 。在 CIK 细 胞 中 增 殖 ，两 者 的病 毒 滴 度 均 可 达 到 10TCID50／mL~BF2细胞是 FTV的敏感细胞株 ，但 对 GCRV不敏感 ，病毒感染细胞后不能产生 CPE。 FHM 细胞对 GCRV较 为敏感，病毒感染细胞的滴 度可达到 10 TCID5加 L，但对 耵 不很敏感，滴 度很低 ，难 以测定 。EPC细胞对两种病毒都不敏感 。 通过细胞敏感性测定 ，可 以推测 2种病毒表面蛋 白 存在与 CIK细胞共 同作用的敏感蛋 白因子 。 维普资讯 http://www.cqvip.com

维普资讯htp/www.cqvip.com 中国病毒 第18卷 500bp的目的PCR产物,但以 TFV RNA为模板则 表1GCR与TFV的细胞感染特性比较 未能得到任何扩增产物,表明两种病毒的第10基 Table, Cell infectious companson between TFV and GCR因的核酸片段在核苷酸水平的同源性很小或至少 Cell lines 在扩增引物位点无序列同源性。 GCRV M12345678 ClK, Ctenopharyngodon idellus kidney cells; BF2, Blucgil fry cell: EPC Epithelioma papulosum cyprini cell: FHM. Fathead minnow cell GCRV, entire monolayer, +/-Little CPE or no viral replication: - No CPE. 2.2GCR与TFV核酸分析 为在同一电泳条件下比较GCRV与TFV的核图22株GCRV与TFv第10基因片段的PCR扩增结果 酸特性,我们将纯化的两株 GCRV(GCRv &3,Fig2 The PCR amplification of segment 10 between2GcRV GcRⅤ∞)与TrⅤ的 dsRNA进行了1%琼脂糖凝胶 strains and TFV 电泳分离(见图1)。图片显示,病毒RNA电泳带 M, Ikb DNA ladder; 1, Full length SI0 amplification of GCRV 91: 2/4. 型基本呈现为3组,第1组为1~3片段,第2组为 Xbp S10 amplification of GCRV&n and GCRv991 respectively: 3/5. S10 amplification of TFV template: 67, full length S10 amplification of 4~6片段,第3组为7~11片段。其中, GCRV3与 GCRV83 8, Negative control GCRv9核酸片段分子量完全一致,而 TFV RNA 部分电泳条带的迁移率与GCRⅤ有所不同。TFV的24GCRV与TFV的结构蛋白与 Western blot分析 第一片段与GCRV的十分接近,但最小的第11片 为比较病毒结构蛋白组分,采用12% 段的分子量小于GCRV第11片段,中间各片段分 SDS-PAGE对纯化的TFV与GCRV蛋白同时进行 孑量均有差异。提示这2株水生呼肠孤病毒基因组电泳分离,获得5条主要结构多肽,它们的多肽图 成不属于同一类型。由于它们的核酸大片段在琼谱基本相似,但分子量有差异(见图3A)。从GCRV 脂糖凝胶电泳上电泳很难分离成单一条带,图中所 示 Segment1~3为S1、S2、S3的混合物 Segment 图3GCRV与TF结构多肽 A,GCRV与TV结构多肽的 SDS-PAGE:B, Westem blot分析:M 图!GCRV和TFV核酸图谱 标准蛋白分子量,泳道1,GCRV1结构多肽,2,TV结构多肽 Fig. I Map of GCRV and TFV dsRNA Fig 3 Structural polypeptides of GCRV and TT DNA marke: 1. tFV dsRNA; 2, GCRV*73 dsRNA: 3. GCRVoul dsRNA A, SDS-PAGE of both GCRV and TFV protein; B, Western blot analysis; M Standard protein molecular weight; 1, GCRV proteins; 2, TFV proteins 23GCRV与TFV第10基因片段比较 为检测TFV与GCRⅤ核酸序列的同源关系,和TFV蛋白电泳图谱可以看出,GCRV大分子量 根据GCRⅴ8编码外壳蛋臼的第10基因片段已知蛋白与TFV的十分接近。此外,两种病毒基因组 序列,设计一对含阅读框(900bp)与另一对约500bp均编码43kDa多肽,TFV最小的结构多肽比GCRV (含糖基化位点)的引物分别进行GCRV83、最小的一条要小1~3kDa,而TFV中分子量约 GCRV∞以及TFⅤPCR检测(图2),从结果可以67kDa的多肽较GCRv91的大1~3kDa。结果表 看出,以GCRⅤw和GCRVω毒株 dSRNA为模板,明,这两种病毒编码的主要结构多肽组成及图谱与 通过 RT-PCR反应,均能扩增得到大小为900bp与其它水生呼肠孤病毒的结构蛋白特性相吻合16m 「II翻

中 国 病 毒 学 第 18卷 表 1 GCRV 与 TFV 的细胞感染特性 比较 Table1 CellinfectiouscomparisonbetweenTFV andGCRV CIK，Ctenopharyngodon idelluskidney cells；BF2，Bluegilfry cell；EPC， Epithelioma papulosum cyprinicell；FHM ，Fathead minnow cel1．GCRV, Grasscarp reovirus；TFV,Threadfin reovirus．+ClearCPE involving the entiremonolayer；+，一 LittleCPE ornoviralreplication；一NoCPE． 2．2 GCRV 与 TFV核 酸 分 析 为在同一电泳条件下比较 GCRV 与 TFV 的核 酸 特 性 ， 我 们 将 纯 化 的 两 株 GCRV(GCRVs73， GCRV991)与 TFV 的 dsRNA 进 行 了 1％ 琼 脂糖 凝 胶 电泳分离 (见图 1)。图片显示 ，病毒 RNA 电泳带 型基本呈现 为 3组，第 1组为 1～3片段，第 2组为 4^6片段，第 3组为 7-11片段。其 中，GCRV 与 GCRV99l核酸片段分子量完全一致 ，而 TFV RNA 部分电泳条带 的迁移率与 GCRV有所不 同。TFV 的 第一 片段与 GCRV 的十分接近，但最小的第 11片 段 的 分子 量 小于 GCRV 第 11片段 ， 中 间各 片段 分 子 量均 有 差异 。提 示这 2株 水 生呼 肠孤 病 毒 基 因组 成不 属 于 同一 类 型 }J。由于 它们 的核酸 大 片段 在 琼 脂糖凝胶 电泳上 电泳很难分离成单一条带，图中所 示 Segment1～3为 S1、S2、S3的混合 物 。 Segm ent l 4 7 l0-l1 图 l GCRV和 TFV核酸 图谱 Fig．1 M ．dpofGCRV andTFV dsRNA M ，DNA marke；1，TFV dsRNA；2，GCRV873dsRNA；3，GCRV99IdsRNA． 2-3 GCRV与 TFV 第 l0基 因片段 比较 为检测 TFV 与 GCRV 核酸序列的同源关系， 根 据 GCRV 编码 外 壳 蛋 白的第 10基 因片 段 已知 序列 ，设计一对含 阅读框(900bp)与另一对约 500bp (含 糖 基化 位 点 ) 的引物 分 别进 行 GCRV 、 GCRV99l以及 TFV PCR检 测 (图 2)，从 结 果可 以 看出，以 GCRV873和 GCRV99l毒株 dsRNA为模板 ， 通 过 RT-PCR 反 应 ，均 能扩 增 得 到 大小 为 900bp与 500bp的 目的 PCR产物，但 以 TFvRNA为模板则 未能得到任何扩增产物，表 明两种病毒的第 10基 因 的 核 酸 片段 在 核 苷 酸 水 平 的 同源 性 很 小 或 至 少 在 扩 增 引物 位 点无 序 列 同源 性 。 2 2株 GC ● RV与 T1 第 1O基 l 因片段 的 PCR扩增 结果 Fig．2 ThePCR amplificationofsegment10between2GCRV strainsandTFv M ，1kb DNA ladder；1，Fulllength S10 amplification ofGCRV99l：2／4， 500bp S10 amplification ofGCRV873andGCRV991respectively；3／5，S10 amplification of TFV template；6／7．full length SIO amplification of GCRV873：8，Negativecontro1． 2．4 GCRV与 TFv的结构蛋 白与 Westernblot分析 为 比 较 病 毒 结 构 蛋 白 组 分 ， 采 用 12％ SDS—PAGE 对 纯化 的 TFV 与 GCRV 蛋 白同时进 行 电泳分离，获得 5条主要结构多肽，它们 的多肽 图 谱 基 本相 似 ，但 分子 量 有 差异 (见 图 3A)。从 G-CRV — _-31 A B 图 3 GCRV与 TFv结构多肽 A，GCRV 与 TFV 结构 多 肽 的 SDS—PAGE：B，Westernblot分析 ；M ， 标准 蛋 J分子 量 ，泳 道 1，GCRV99I结构 多肽 ，2，T1 结 构 多肽 ． Fig．3 StructuralpolypeptidesofGCRV an dTFv A，SDS—PAGEofboth GCRV an dTFV protein；B．Western blot an alysis；M ． Standardproteinmolecularweight；1，GCRV proteins；2，TFv proteins． 和 TFV 蛋白电泳图谱可 以看 出，GCRV 大分子量 蛋 白与 TFV 的十分接近。此外 ，两种病毒基 因组 均编码 43kDa多肽，TFv最小的结构多肽比GCRV 最 小的一条要小 1～3kDa，而 TFv 中分子量约 67kDa的多肽较 GCRV99l的大 1～3kDa。结果表 明，这两种病毒编码 的主要结构多肽组成及 图谱与 其它水生呼肠孤病毒 的结构蛋 白特性相吻合[16,171。 零 卯 维普资讯 http://www.cqvip.com

维普资讯htp:/www.cqvip.com 两株水生呼肠孤病毒部分特性的比较 为进一步鉴定TFV与GCRV的血清学关系,将2 as isolated from marine threadfin fish (Eleutheronema tetradact 种病毒蛋白与兔抗GCRⅤ抗体进行了 Western blotting分析(图3B)。结果显示,兔抗GCRv抗王炜,赵桃莢,方勤,等.草鱼出血病病毒多肽的免疫原性门中 体能部分与TFV结构多肽产生交叉反应,说明这两 国病毒学,1995,I0:166-168. 种病毒表面蛋白存在相似的抗原决定簇。能为 4]方勤,肖调义,邹桂平,等.四株草鱼呼肠孤病毒毒株的感染特性 比较研究门中国病毒学,2002,17:188-190 GCR抗体识别的TFV多肽是136kDa,132kDa 15]方勤,肖调义,丁清泉,等。草鱼呼肠孤病毒991分离株的病毒学 43kDa(箭头所指)。另外两条多肽(67kDa,31 特性分析{.中国病毒学,2002,17:183-187 kDa)则不能与之抗体产生反应。 6]邹桂平,方勤,草鱼呼肠孤病毒在CIK细胞中复制及形态发生的 3讨论 研究中国病毒学,200015:186-192 刀]方勤,田静,草鱼呼肠孤病毒(GCRV)部分片段cDNA文库的构 GCRV与TFV的细胞感染特性结果表明,对 建门.中国病毒学,200015:78-82 GCRV敏感的细胞株有CIK与FHM,对FTV敏感|8 Rangel AA. Lockemann D I. Hetrick F M. Identification of grass 的细胞株为CIK和BF2。而EPC细胞对两种病毒 carp hemorrhage virus as a new genogroup of aquareovirus[]. J Gen 都不敏感。GCRⅤ与TFV均能在CIK细胞中有效 9左文功,钱华鑫,许映方,等.草鱼肾脏组织细胞系CK的建立 地增殖,表明这两种病毒衣壳蛋白存在与CIK细胞 淡水渔业,1984.(2)38-39 共同作用的敏感蛋白因子。根据几株水生呼肠孤病 ]柯丽华,方勤,蔡宜权.一株新的草鱼出血病病毒分离物的特性 毒(CSV,GsV和CRV)的免疫交叉实验,发现 [J.水生生物学报,1990,14:153-159 这三株病毒虽表现出各自的血清学特性,但也显示 11 Lacmmli U K. Leavage of structure protein during the assembly of 出微弱的交叉反应;因此 Hedrich等认为各亚群或 he head of bacteriaphage T4[J]. Nature, 1970. 227: 680-685 毒株间可能存在一种或多种共同的抗原决定簇1 [12] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning, A 对GCRV与TFV结构蛋白的电泳 Western印迹杂 Laboratory Manual[M]. 2nd ed, USA, NY: Cold Spring Harbor, 1989. 交分析显示,GCRV抗体能与TFV部分蛋白产生交3 u I, Lu. g,aa. ompete nucleotide sequence 叉反应,进一步证实这2株病毒蛋白存在共同的表 SIOgenome segment of grass carp reovirus( GCHV) J]. Dis Aquar 面抗原决定簇。有关GCRⅤ与TFV琼脂糖凝胶电 J Attoui H. Fang Q, Mohd F, et al. 2002. Common evolutionary origin 泳及第10基因片段 RT-PCR的扩增结果,可以初步 of aquareoviruses and orthoreoviruses revealed by 说明GCRV与TFV的基因组与单一片段的核苷酸 characterization of Golden shiner reovirus, Grass carp reovirus, 组成是有差异的,但由于目前未能获得TFV全基因 Striped bass reovirus and golden ide reovirus (genus Aquareovirus, 组序列,因此很难准确定义这2株病毒的基因序列 family Reoviridae)[J].J Gen Virol, 2002, 83(8).1941-1951 同源性及结构蛋白的异同。对GCRV与TFV及其5 Merten,PPC, Arella M. Antoni H,eral. reoviridae. In virus 它水生呼肠孤病毒的基因组结构与蛋白组分在病 Taxonomy. Seventh Report of the International Committee for the 毒颗粒中的相对位置及在侵染复制中的生物学功 Viruses (Van Regenmortel, Eds) [M]. New York: 能,有待更深入的研究来加以阐明。 Academic Press. 2000. [16] Winton J R, Lannan C N, Fryer J L et aL. Morphological and biochemical properties of four members of a novel group of 致谢:国立新加坡大学Sin教授提供TFV病毒毒株, reoviruses isolated from aquatic animals[J]. J Gen Virol, 1987, 68: 中国科学院水生生物研究所研究生吴刚同学 在蛋白质电泳方面提供帮助,谨致谢意。 [17] Samal S K, Dopazo C P, et al. Heterogencity in the genome RNAS and polypeptides of five members of a novel group of rotavirus like 参考文献 viruses from aquatic animals J]. J Gen virol, 1991, 72: 181-184 [1] Ahne W. Viral infectious of aquatic animals with psecial reference to [18] Hedrick R P, Rosemark R, Aronstein D, et al. Characteristics of a new asian aquaculture[J]. Annual Review of Fish Diseases. 1994. 4: 375. Reovirus from channel catfish (Ictalurus punctatus)[J]. J Gen Virol 2] Seng EK, Fang Q, Chang SF, et al. Characterisation of a pathogenic 1984,65:1527-1534 ITl闩

方勤 ，等 ．两株 水生呼肠孤病 毒部分特性 的 比较 467 为进一步鉴定 TFV 与 GCRV 的血清学关系，将 2 种 病 毒 蛋 白与兔 抗 GCRV 抗 体进 行 了 Western blotting分析 (图 3B)。结果显示，兔抗 GCRV抗 体能部分与 TFV结构多肽产生交叉反应 ，说 明这两 种 病 毒 表 面 蛋 白存 在相 似 的抗 原 决 定簇 。能 为 GCRV抗体识别的 TFV多肽 是 136kDa，132kDa， 43kDa(箭头所指 )。另外两条 多肽 (67kDa，31 kDa )则不能与之抗体产生反应 。 3 讨 论 GCRV 与 TFV 的 细胞 感 染特 性 结 果表 明 ，对 GCRV敏感的细胞株有 CIK与 FHM，对 F11V敏感 的细 胞株 为 CIK 和 BF2。而 EPC 细 胞对 两 种病 毒 都不敏感 。GCRV与 耵 均能在 CIK细胞 中有效 地增殖 ，表明这两种病毒衣壳蛋 白存在与 CIK细胞 共 同作用 的敏感蛋白因子 。根据几株水生呼肠孤 病 毒 (CSV，GSV 和 CRV)的免疫交叉实验 ，发现 这三株病毒虽表现 出各 自的血清学特性 ，但也显示 出微弱的交叉反应 ；因此 Hedrich等认为各亚群或 毒株间可能存在一种或多种共同的抗原决定簇 l1引。 对 GCRV 与 TFV 结构 蛋 白的 电泳 Western 印迹 杂 交分析显示，GCRV抗体能与 TFV部分蛋白产生交 叉 反 应 ，进 一 步证 实 这 2株 病 毒 蛋 白存 在共 同的表 面抗原决定簇 。有关 GCRV 与 TFV 琼脂糖凝胶 电 泳及第 l0基 因片段 RT-PCR的扩增结果 ，可 以初 步 说 明 GCRV 与 TFV 的基 因组与单一片段 的核苷 酸 组成是有差异 的，但 由于 目前未能获得 TFV全基 因 组序列，因此很难准确定义这 2株病毒的基因序 列 同源性 及 结构 蛋 白的异 同 。对 GCRV 与 TFV 及 其 它 水 生 呼 肠 孤 病 毒 的 基 因组 结 构 与 蛋 白 组 分 在 病 毒颗 粒中 的相对 位置及在侵 染复制 中的生物学 功 能，有待更深 入的研究来加 以阐明。 致谢：国立新加坡大学 Sin教授提供 TFV病毒毒株 ， 中国科学 院水生生物研 究所研 究生吴 刚同学 在蛋 白质 电泳方面提供帮助 ，谨致谢意。 参考 文献 【1】 AhneW ．Viralinfectiousofaquaticanimalswithpsecial referenceto asianaquaculture[J]．AnnualReviewofFishDiseases，1994，4：375—388． 【2】 SengEK，FangQ，ChangSE eta1．Characterisationofapathogenic virusisolatedfrom marinethreadfinfish(Eleutheronema tetradact— flus)duringadiseaseoutbreak[J]．Aquaculture，2002，214．pl—l8． 【3】 王炜，赵桃英，方勤，等．草鱼出血病病毒 多肽的免疫原性【J】．中 国病 毒学 ，1995，10：166-168． 【4】 方勤，肖调义，邹桂平，等．四株草鱼呼肠孤病毒毒株的感染特性 比较研 究 【J】．中 国病 毒学 ，2002，17：188—190． 【5】 方勤，肖调义，丁清泉，等．草鱼呼肠孤病毒 991分离株的病毒学 特性分析【J]．中国病毒学，2002，17：183—187． 【6】 邹桂平，方勤．草鱼呼肠孤病毒在 CIK 细胞中复制及形态发生的 研 究 【J】l中 国病毒 学 ，2000，15：186—192． 【7】 方勤，田静．草鱼呼肠孤病毒 (GCRV)部分片段 cDNA文库的构 建 【J】．中 国病 毒学 ，2000，15：78．82． 【8】 RangelA A，RockemannD D，HetrickFM．Identificationofgrass carphemorrhagevirusasanewgenogroupofaquareovirus[J]．JGen Virol，l999，80：2399—2402． 【9】 左文功，钱华鑫，许映方，等．草鱼肾脏组织细胞系CIK的建立【J] 淡 水 渔业 ，1984，(2)38—39． 【l0】 柯丽华，方勤，蔡宜权．一株新的草鱼出血病病毒分离物的特性 fJj．水 生生 物 学报 ，1990，14：153．159． 【11】 LaemmliU K．Leavageofstructureproteinduringtheassemblyof theheadofbacteriaphageT4[J]．Nature，1970，227：680-685． 【12】 Sambrook J， Fritsch E E Maniatis Molecular Cloning， A LaboratoryManual[M]．2nded，USA，NY：ColdSpnngHarbor,1989． 【13】 Qiu LuR H，Zhan gJ，eta1．Competenucleotidesequenceofthe S10genomesegmentofgrasscarpreovirus(GCHV)【J】．DisAquar Organ ．2001，44：69—74． 【14】 AttouiH，FangQ，Mohd eta1．2002．Commonevolutionaryorigin of aquareoviruses an d orthoreoviruses revealed by genome characterization of Golden shiner reovirus，Grass carp reovirus， Stripe dbassreovirusandgoldenidereovirus(genusAquareovirus， familyReovindae)【J】_JGenVirol，2002，83(8)，1941—1951． 【15】 Me~ens，PPC，Arella M，AttoulH，eta1．Reoviridae．In Vh-us Taxonomy．Seventh Reportofthe Intern ationalCommittee forthe Taxonomy ofViruses (Van Regenmortel，Eds)【MI．New York： AcademicPress，2000． 【16】 Winton JR，Lannan C N，FryerJ L eta1．Morphological and biochemi cal prope rties of fo ur members of a novel group of reovirusesisolated from aquaticanimals[J]．JGenVirul，1987，68： 353—356． 【17】 Samal SK，DopazoC eta1．HeterogeneityinthegenomeRNAs an dpo lype ptidesoffivemembe rs ofanovelgroupofrotavirus—like virusesfrom aquaticanimals[J]．JGenVirol，1991，72：181—184． 【18】 HedrickR RosemarkR，AronsteinD，eta1．Characteristicsofanew Reovirusfrom channelcatfish(Ictaluruspunctatus)【J】．JGenXrtrol， 1984．65：l527—1534． 维普资讯 http://www.cqvip.com