维普讯 htp://www.eqvip.com.ipcom 第12卷第1期 鱼类病害研究 1990年 草鱼出血病病毒所致肝功能代谢失调 机理的初步研究 朱心玲谢巧雄 中国科学院水生生物研究所) 草鱼出血病是我国淡水养殖业中位害较大流行广的一种疾病,此病的病原体已被确定 已被定名为草鱼呼肠弧病毒( Reovirus of Grass Carp简称GCV)关于草的组织病理 的研究,已由郑德崇等(1984)、芦全章等1985)报导,作者(1987)也曾报导了此病的 血液病理研究结果。上述的研究均阐明病毒侵袭宿主后,被使全身毛细血管受损,导致组织 出血,细胞坏死、本文研究的目的旨在探讨病毒侵宿主造成肝脏微循环障碍所致肝细胞损 害、环死,引起肝功能代谢失调的机理。 材料与方法 病毒毒源武汉市东西湖养殖场水产试验所的发病池中收集的病鱼组织,贮存于20℃ 冰箱,备用。 试验鱼体重为30—80克的草鱼,取自本所试验场试验前需用2%盐水作2030分钟 的体外消毒,然后放入去氯自来水中暂养约24小时,备用。 人工感染的试验步骤 一、感染;将冰冻保存的病鱼组织,制成101的病毒悬液,然后,每尾按0.01毫升1 克体重的注射量,注入鱼体腹腔内,尔后放入去氯自来水饲养观察,感染期间不喂食,水温 控制在2830℃。 二、血样的收集:潜伏期病鱼的血样收集是取经注射感染4天,外观无症状的病鱼;发 展期病鱼血样收集是取经感染后症状明显,垂死的病鱼另设置未感染病毒的对照用切 开围心腔法采血。自然发病病鱼的血样收集:潜伏期病鱼的血样采集是在初发出血病的病池 中,随意捕用无症状的鱼;发展期病鱼是逐尾捞取病池内症状明显的病鱼。平均体重是15.88 克,用切开围心腔法采血。 血样的制备采出的血液置4℃冰箱中经30分钟左右,离心(3000转/分),取出上清液, 血浆或清置0℃保存,备用。 血液临床化学分析 酶活性的测定:谷丙转氨酶(GPT)用金氏直接显色法异柠檬酸脱氢酶(ICDH)用反 应产物a一酮二酸和2,4一二基苯肼的呈色反应法碱性酸酶(AKP)用4氨基 安替比林法鸟氨酸氨甲酰移换酶(OCT)用鸟氨酸和氨基甲酰磷酸二锂为基质,用二乙酰单
第12卷第1期 鱼 类 病 害 研 究 199o年 草鱼出血病病毒所致肝功能代谢失调 机 理 的 初 步 研 究 朱J玲 谢 雄 (中 国科 学 院水4z'!-2l物 研究所 ) 草 鱼 出血病是 我 国淡 水养殖业 中危害较大流 行广 的一种疾 病，此病 的病原体 已被确定井 已被定名为草鱼呼肠 弧病 毒 (ReovirusofGrass Carp 简称GCRV)戈于 草盘的组织病理 的研览， 已由郑 簿崇 等 (1984)、芦全 章等 (1985)报导 ，佧 者 (1987)也曾撤导 了此病的 血 液病 理研 究结 果。 上述 的研 究均 阐明病毒侵袭 宿主后，被使 垒身毛细 血管 受损 ，导 致纽纵 出血 ，细 胞 坏死 、本 文研 究 的 目 的 旨在 探 讨 病 毒 侵 袭 宿 主造 成 肝 脏 微循 环 障 碍 所 致 肝 细 胞 损 害 、坏 死， 引起肝 功能代谢失讯的机理 。 材 料 与 方 法 病毒毒 源 武汉市东西湖养殖 场水产 试验所的发病池 中收集 的病鱼 组织 ，贮存 于 一20℃ 珠箱，备用。 试 验 鱼 体 重 为 30— 8O克 的草 鱼 ， 取 自本所 试 验 场。 试 验 前需 用 2 盐 水作 20— 3O分 钟 的体外 消毒 ，然 后放入去 氯 自来水 中暂养约 24小 时，备用。 人 工感 染的试 验步骤 一 感 染。 将冰冻保存 的病鱼组织，制 成 10I1的病毒悬 液，然后 ，每 尾按 0．01毫升 1 克 俸重 的注射量，注入鱼 体腹腔内，尔后放入去氯 自来水饲养观察 ，感染期 间不喂食 ，水温 控 制在 28— 3O℃。 二 、 血 样 的 收 集 。 潜 伏 期 病 鱼 的血 样 收集 是 取 经 注射 感染 4天 ， 外 观 无 症 状 的病 鱼 }发 展 期 病 鱼 血 样 收 集 是 取 经 感 染 后症 状 明显 ， 垂 死 的病 包 ， 另设 置 未 感 染 病 毒 [由对 照 龟 。用 切 开 围心腔法 采 【缸。 自然发 病病翅的血样 收集 ：潜 伏期病鱼 的血样采 集是 ：初发 出I缸病 的病 池 中，随 意捕用无症状 的鱼 ；发 展期病鱼是逐尾捞取病 池内症状 明显 的病鱼。平均体重是15．88 克，用切开 围心腔法采血 血 样 的 制 备 采 出的 血 液 置 4℃ 冰箱 中经 3O分 钟 左 右 ，离 心 (8000转 ／分 )，取 出上 清 液 ， 血 浆 或 清 置 0℃保 存 ，备 用 。 血液 临 床 化 学 分 析 酶活性 的测定。 谷丙转氨 酶 (GPT)用金 氏直接显色 法J异柠檬酸脱 氢酶(ICDH )用 反 应产物 一酮戊二酸和 2， 4一二硝基苯肼的呈色反应法，碱性磷酸酶 (AKP)用 4一氨基 安替 比林 法} 鸟氮酸氮 甲酰移换酶 (OCT)用 呜舞酸和氨基 甲酰磷酸二锂为基质，甩二乙酰 单 维普资讯 http://www.cqvip.com
肟和反应产瓜氨酸的呈色反应测定酶活;乳酸脱氢酶同工酶(SLDH同工酶)用醋酸纤维 薄膜电泳法。 蛋白质的定:血浆总蛋白用双缩脲法:白蛋白用溴甲酚绿法。 尿素氮用二乙酰一肟法 胆固醇用邻苯二甲醛查接暴色法。 t值检验人工感染用感染组与对照组两样本均数差异的显著性涮验公式;白然感染用 样木均数与总体均数差异的感著性测验公式、总体均数采用作者建立的血液正常值。 结 映盱实质细胞损害的血清酶类。 实验选择了反映旰实质细胞损伤铰为敏感的谷丙转氨、异柠檬酸脱氢酶、碱性磷酸 酶、鸟氨酸氨甲酰移换酶和乳酸脱氢酶同工酶等5种酶类·检测结果见表1、?。从表中 显可见谷丙转氨酶、异柠檬酸脱氢酶活性,经人工感染4天后取样检查就有增高趋势.直至 发展期时这两种酶活性增高愈加明显。而碱性磷酸酶活性增高只在发展期病鱼血清中显示, 且增高的幅度小于30金一阿氏单位。鸟氨酸氨甲酰移换酶也显示了在发展明病鱼血清中有变 化,而其变化是酶活性降低。 血清乳酸脱氢酶同工酶(SLDH)的枪测结果是正常草鱼种此酶谱型是5条区带,酶相 对活性顺序是SLDH-1SLDH2>SLDH-3>5LDH-5>5LDH-4>SLDH-6。 二、反映肝实质细胞损害的血浆总蛋白、血清白蛋白、尿素氮和胆固醇 实验检测了血浆总蛋白、血清白蛋白、尿素氮和总胆固醇,结果列于表3。 队表中可见经人工感染病毒后的病鱼,无论是潜伏期和发展期,其含量均显示明显减少 (P值<0001)的病理变化。在自然感染出血病病毒发展期病鱼血清中,血清白蛋白的含量 减少(P值<0.01);血清尿素氮的含量无论在人工感染或自然感染病鱼中均呈现明显的病 理变化,其含量减少(P值<0001)在潜伏期和发展期都明显可见;血清胆固醇浓度减少 (P值<0.001)仅只在自然感染发展期病鱼体内发生。 讨论 肝脏是物质代谢最重要的器官,对于肌体内的蛋白质、脂肪、酶等合成、分解和贮存具 有非常重要的作用。当草鱼出血病病毒侵犯鱼体时,肝脏的结构和功能必将受到不同程度的 影响,临床上可应用各种生化检查方法来测知其受损的情况作辅助诊断。 芦全章等(1985)对此病曾作了系统的组织病理研究,通过形态病变的观察,说明了病 毒侵袭鱼体后使肝细胞肿大变化,随着病情的进展,循环及代谢障碍可导致组织坏死;作者 1987)对患出血病病鱼进行了系统的血液病理研究,已从检测的血液参数中,对肝、肾功 能失调的机理有所闸明。本研究中选择检测的血液指标是为了推测病毒侵袭鱼体后,造成肝 细胞损伤、坏死,导致肝功能代谢失调的机琿
肟和反应产物_瓜氨酸舸 色反应测定酶活力} 薄 膜 电泳 法 蛋 白 磺 的弼 定： 血 浆 总 蛋 白甩 双 缩 脉 法 ， 乳酸脱 氧酶同 1=酶(sIDltMI酶 )用醋酸纤维 自蛋白用澡甲酚绿 法。 尿 素 氨 用 二 乙酰 一肟 法。 ’ 胆 固 醇用 邻 苯 二 甲 醛 耋接 色 法 t值检 验 人工感染 用感染组与对照组两样本均数差异 的 显著性 测验 公 式 J 自然感染用 样本均数与总体均数差异的砬著性潮验公式，总体均数采用作 者 建 立的l吡液正常值。 结 果 一 ， 反 映 肝 实 质细 胞 损 害 的 血 清 酶 类 。 实验选择 了反映肝实 质细胞损伤较 为敏 感的 谷丙转氨酶、异柠 檬酸脱 氢 酶 ，碱性磷酸 酶 鸟氨酸氨甲酰 移换酶和乳酸脱 氢酶 同工酶 等 5种酶类 ，检 删结果见表 1、 2。从 表中明 显可见 谷丙转 氨酶 、异柠檬 酸脱 氢酶 活性，经人工感染 4天 后取样检查 就有 增高趋势 ，直至 发 展期时这两种酶 活性 增 高愈 加明显。而碱性磷酸酶活性 增 高只在发展期病鱼 血清中显示 ， 且增 高的幅度小于3O金一呵 氏单 位。 鸟氨 酸氨甲酰 移换酶也显示 了在发 展期病鱼皿清 中有 变 化 ，而其 变化是酶 活性降低 。 血 清乳 酸 脱 氧 酶 同 工 酶 (SLDH )的榆 测 结 果 是 正 常草 鱼 种 此酶 谱 型 是 5条 区带 。酶 相 对 活性 顺 序是 SLDH一1 SLDH一2> SLDH一3> SLDH一5> SLDH～4> SLDH一6。 二、反映肝实质细胞损害 的 衄浆总噩 白、 血清 白蛋白，尿素氮和胆 固醇 实验检 测 了血浆总虽 白、 血清 自蛋 白、尿素氮 和总胆周醇，结果列于表 3。 从表中可见 经 ^、工感染病毒后 的病 鱼，无论是潜 伏期和发 展期 ，其含量 均显 示明显减少 (P值 <9．001)的病理变化。在 自然感染 出l血病病毒发 展期 病鱼血清 中，血清 白蛋 白的含 量 减少 (P值 <0．01)}血清 尿素氨 的含 量无论猩 人工感染或 自然感染病 鱼中均 呈现明显的病 弹 变化，其含 量减少 (P值 <0．001)在 潜 伏 朝和发展 期都 明显 可见 } 衄清胆 固醇浓度减 少 (P值 <0．00])仅只在 自然 感染 发展期病 鱼休 内发 生。 讨 论 肝脏是物质代谢摄重 要的器官，对于肌体内 的蛋 白质、脂肪，酶等合成，分解和 贮存 具 有非常重要 的作用 。 当草 鱼 出血病病毒侵犯鱼体时，肝 脏的结构和功能必将受 到不 同程度 的 影响，临床上可应用各种生化检查 方法来 铡 知其受损 的情 况作辅助诊断。 芦 全章等 (1985)对此病 曾作 了系统的组织病 理研 究，通 过形态病变的观察，说 明了病 毒 侵 袭 鱼 体 后 使 肝 细 胞 肿 大 变 化， 随着 病情 的 进 展 ， 循 环 及 代 谢 障 碍 可 导 致 组 织 坏 死 ， 作 者 (1987)对患 出血病 病鱼进行 了系统的 液病 理研究 ， 已从检 测的血液参数 中， 对肝、 肾功 能失词的机理有所 闸明。本研究 中选 择检 测的血液指标是为了推测病 毒侵袭鱼体后。造成肝 细胞损伤、坏死，导致肝 功能代谢 失调聃梳 理。 ‘ 2 维普资讯 http://www.cqvip.com
肝脏在代谢过程中所起的重要作,与E含有许多种的酶类有关,它不代能报裝 些酶到胆道,而且还能释放一定数量的酶入血液。因此,肝脏受损害时,常伴育血清中某些 酶活性的升高或厣低。如谷丙转氨酶为胞浆中的酶和分子量小的异柠檬酸脱氢酶,常因肝细 胞破坏或细胞的变化而引起上述两种酶的滑出,使血中酶活性增高作者的检测结果也证实 了这一点。碱性磷酸酶活性为轻度增高(30金-阿氏单位),说明病变以肝细胞损害为主,故血 清碱性磷酸酶活性上升常不及胆道梗阻或肝内占位性病变明显。鸟氨酸氨甲酰移换酶活性的 阵低是由于肝脏受损害时,瓜氨酸合成障碍而造成乌氨酸循环中的一些酶如鸟氨甲酰移换酶 的活性降低。据杨端等(1981)的实验结果,阐明了草鱼不同组织中的SLDH同工酶谱型 并发现肝中还具育另一组分。 wilson等(1973)也从肝中分离出很高活性的向负极游动的 SLDH同工酶带,这种肝组织特的同工酶也存作于其它鲤科鱼中。研究表明在部分病色林 内出瑰了第6条区带(SLDH-6)。这条向负板游动的同工酶带似与肝中向负极游动的区 带相似。由此可见,患出血病病鱼体内有可能因为肝细胞遭受损伤导致SLDH问工酶释放至 血液中,因此,形成了SLDH同工酶第6条区带的出现。 肝脏是进行蛋白质代谢非常旺盛的器官,是合成血浆蛋白的主要场所,日前已知血浆全 部白蛋白及球蛋白也都在肝内合成的,因此,可由血浆蛋白的质和量的改变来检验肝脏功 能。研究结果也表明了血浆总蛋白及血消白蛋白的含量,在病鱼体内明显减少。同时,尿素 是蛋白质分解的产物,当蛋白质代谢受影响时,血中尿素氮的含量也受影响,研究表明血清 尿素氮含量下降显著,从而间接说明肝细胞的损害 肝脏在胆固醇的吸收、合成和酯化作用中均有重要作用,肝脏合成胆固醇的能力占全身 合成总鞦的3/4以上,因此,血清胆固醇含量在发期病鱼体内明显降低,貮意味着病蒜的 表 反映肝实质细胞损害的血清酵类 血液殄数 正常值 Normal yalues均潜伏期 Latent period Blood parameter值±标准差 Means.D.均值±标准差Mean上S,D均值士标准差Mean=S,D. 谷丙转氨酶 45.54±11.23 63.26±18,47 83,32±24.36 (GPT (43 异村檬酸脱氢商 136.938.32 0,27 182.66-43.6 ICDH (37 碱性磷酸酶 18.24=2.9 20.850.85 AKEy 鸟氨酸氨甲酰移换酶|6,57±1 4。70],50 (OCT) 10 Iu 括弧内数宁小剐定鱼数
旰啦 代谢过程 中昕起的剪要 垌， 与 台有许多种类 的酶类 订关，它不 比能摊 }H某 些酶到胆道，而 且还能 释放一定数量 的酶入 血液。 因此 ，肝 脏受损 害时，常伴 有血清 中某些 酶活性 的升 高或降低。 如谷丙转氨酶 为胞浆 中的酶 和分子 量小的异 柠檬酸脱 氢酶 ，常因肝细 胞 破 坏 或 细 晦 蟆 的变 化 丽 引 起 上 述 两 种 酶 的漏 出，使 血 中 酶 活 性 增 高 ，作 者 的检 铡 结 果 也 证 实 了这 一点 。 碱件 磷 酸酶 活 性 为轻 度 增 高 (30金一 阿 氏单 位 )，说 明病 变 以肝 细 胞 损 害 为 主 ，故 血 清 碱性 磷 酸 酶 活 性 上 升 常 不 及 胆 道 梗 阻或 肝 内 占 性 病 变 明显 。 吗氨 酸 氨 甲 酰 移 换酶 活性 的 降 低是 由于肝脏受损害时，瓜氨酸 台成障碍而造 成鸟氢 酸循环中 的一些酶如 鸟氢甲酰 移换酶 的活性 降低。据橱 端等 (1981)的 实验结果 ，阐 明 了草鱼不 同组织 中的SLDH同工酶谱 型， 并 发 现肝 中 还 具 有 另 一组 分 。 W iISOrl等 (1973)也 从 肝 中 分 离 出很 高 活性 的 向负 极 游 动 的 SLI3H同 工酶 带 ， 这种 肝 组 织 特 殊 的 同工酶 也 存 卉：于其 它 鲤 科 鱼 中 。 研 究 表 明 部 分 病 鱼 体 内出现 了第 6条 区带 (SLDH一6 )。 这条向负极游 动的同工酶带似 与旰中 向负极 游 动 的区 带相 似。由此可 见，患 出血病病龟体 内有可 能因为肝 细胞遭受 损伤导致sLDH同工酶释放 血 液 中 ， 因 此 。形 成 了SLDH同 工酶 第 6条 区 带 的 出现 肝 脏 是 进 行 蛋 白质 代 谢 非 常 旺 盛 的器 官 ， 是 合 成 血 浆 蛋 白的 ：#要 场所 ， 日前 已知 血 浆 部 白蛋 白及 球 蛋 白也 都 在 肝 内合 成 的， 因此 ，可 由血 浆 蛋 白的 质 和 最 的改 变 来 检 验 肝 脏 功 艟。 研 究 结 果 也 表 明 了血 浆 总 蛋 白及 血 清 白蛋 白舫 含 量 ， 在病 白 体 内 盟显 减 少 。 同 时 ，尿 素 是蛋 白质分解的产物， 蛋 白质代谢受影响时， 血中尿素氮 的含量 电受影响，研究表 明血骑 尿素氮含 量下降显 著，从而 间接 说 明肝细 胞的损害。 肝 脏在 胆固醇 的吸收、台成和酯化作用 中均有重要作用，肝 帆台成胆圃醇 的能力占垒身 合 成总最的3／4以上， 固此，血清胆 固静台 量花发 展期病鱼体 内明显降 低， 就意味着病毒 的 表 1 反 映 肝 实 质 细 胞 损 害 的 血 清酶 娄 血漓参数 }I——常— 值— —。，—姐a—】a—1。es均—— 。潜—优—期一La——tentpe—r—j。—d一 —篓— 嚣一 P—。— —e—1。—p—i———一 —— BI。。dparameterl值±标准差Meanis．D．1均值±标准差Mean±s．D均值=标准差Mean：s．D． … 一 ～ ． 一 一 — — … 一 一 一 一 ～ 一 … 一 ～ 谷丙 转氪 酶 45．5 ±11．23 03．26±l8．47 f 83．32±24．36 (GPT ) ({” l (3|) (22) IU L i i 异 柠檬 酸脱 氢 啡 130．99±38．27 191．72．72±50．27 182．06=d3．76 (Ic D H 1 ㈣ J (2 ， {25) IU ! ’ l 碱 性 磷 酸 酶 (A K P) 18．o~4 = 2．9 (37) 鸟氯酸氨甲酰移换酶 1 6．5r±1．98 (O CT ) (1O) rrt IU 1 括 弧 数宁示 测 定鱼数 。 3 一 ^l～．． 2 — 4 维普资讯 http://www.cqvip.com
感染影响了肝脏功能的正常代谢.使合成它的蘸力减弱,在加上摇病鱼的厌食造成营养不 良,也使它的含量七为陣低 参考文献略 襄2 正常鱼和病鱼乳酸脱氨聊同工露相对活性版序 组别 SLDH同工酶枏对活性的顺泞 正书鱼 sLDH-【<SLD玨-2<SLDH-3<SLDH-4<SLDH-5 自然感染病鱼 SLDH-6<SLDH-4<S]DH-5<SLDH-3<SLDH-2<SLDH-1 潜伏期 人工感染病鱼|SLDH6<SLDH4:SLDH5<s1pH3<sLDH-2<SLDH1 (发展期 寝3 反映肝实质胞损謇的血清蛋白类和胆固尊 血诚参敢 正常值 Normal ralues潜伏物 Latent period发展期 Dereloping period Blood parameter均f士标准卷Man±S.D均值吉标准差M均土标准差 MeanS.D. 尿素氮 7.51±2.65 5.23±3.0 5.06±153 BUN) (422) (197) ※※※ ※※※ 血浆总蛋白 2.88±0.53 2.27±0.66 1.79±0.43 C Plasma total protein (53) 26 太※※ 白蛋白 1.81±0。58 Serum albumen (215) g ※※ 胆固醇 240.04±53。48 137,88±3672 (Serum cholesterin (213) (19) ※※※ ※※≤0.001(非常显著),※※P≤,01(十分显著),※P≤0.05(显著) 括弧内数字表示测定鱼数
感染 影响 了肝脏功 能的 正常代谢，使 合成它 的能力减弱 ，在加 E罹病 鱼的厌 食 造 成营养 不 良， 也 使 它 的 含 量 天 为 降 低 。 参 考 文 献 略 。 寰 2 正 常 鱼 秘 翥 盘 乳 酸 脱 氯 一 同 工 群 相 对 活 性 羼 摩 组别 { SLDH同工酶相对活一的顺 正常鱼 SLDH一~<SLDt{一2<SLDIt一3<SLDH一{< SLDH一5 自拣感染病 鱼 SLDH-6<SLDH一4<SLDI{ <SLDH‘3<SLDH‘2<SLDH‘1 (潜伏期) i 人工感染病鱼 l (发展魑 ) I SLDH一6<SLDH‘4<SIDH‘S<sLpH‘3<SLDH 2<SIDH‘1 寰3 反映肝实质鲰雎擐害的血清强白类和鹏固■ 血诫参赦 正常值NormalYa1uesl潜伏期IAntpPri。d发庭期DeYe1。piⅡgperiod BloodparameIer均值士标准羞Mean~s．D 璺吉准差M∞“ 尿 素 氟 (BUN ) Ⅲ g 血 浆 总蛋 白 ( P1asm a tota1 protein ) g 7．5I士 2．65 (422) 5．23± 3．05 (107) ※旅※ I均值土标准荐Mear_+S·D 5．06± 1．53 (eZ ) ※ ※ ※ 白 蛋 白 丁 ]可 ※7(95±30)．43 (Serum a1bum en ) g 1．81± 0．58 ( 215) 24O．04±,53．48 (213 ) 1．35± 0．23 ( 7 ) ※ ※ 137．88±36．72 ( 19) ※ ※ ※ ×※袋≤ O．001(非常 显 著 )，※※P≤ O．01(十分显 著 )， ※ P≤ O．05(显 著 ) 括 弧 内数 字表 示 洌定鱼 数 ’ n e S 醇 e 固胆 曲皿 m 盯 维普资讯 http://www.cqvip.com
