免疫周次[不完全佐剂ml 抗原 pBS(m)灭活结核杆菌免疫用量 注射部位 石蜡油 毛脂小牛血清(m) 四只脚 腋窝腹股沟脊背 耳缘静脉 福氏完全佐剂常用的制备方法有研磨法和注射器法两种。研磨法方法如下:将经高压除 菌的石蜡油0.5m和羊毛脂1.5ml放入无菌的乳钵内,再慢慢滴入小牛血清。PBS及已灭活 的结核杆菌,边滴边研磨,直至成为乳白色粘稠的油包水乳剂。检验方法是取一滴乳剂滴入 水面(冷水),如不扩散,则完全佐剂已研磨成功。此配方为一只兔子的免疫用量,也可按 比例多组联合研磨。注射器法:将两个注射器中间接上一根短的胶皮,注射器左右推拉 使注射器内的溶剂充分乳化,直至形成油包水乳剂。 2.免疫血清效价的测定 第四周时通过耳缘静脉采血lml,先将血液置室温30分钟,离心(3500rpm)10分钟, 取出血清。用双向免疫扩散法测定抗血清的效价,以确定免疫效果。 3.颈动脉采血 将禁食12小时或隔夜的兔子仰面固定于固定板上,头部放低,暴露出颈部,剪开颈中 部皮肤,约10cm长。沿气管分离皮下组织,直至暴露气管前的胸锁乳突肌。仔细分开胸锁 乳突肌(注意勿剪断小血管),在肌束下面靠近气管两侧,可以看到搏动的颈动脉。取二把 血管钳在血管的远心端(近头部)夹紧,一把夹住近心端的血管(在近心端用线扎好与血管 相连的神经,然后用剪子在二把血管钳中间的血管上剪一小口插入塑料放血管(用线固定) 轻轻放开近心端的止血钳,使血很快射入三角瓶中。直至血流缓慢时(也可用同法在另一侧 动脉内插管放血)将固定板后肢端抬高,增加放血量。 将三角瓶盖好,放置室温一小时,再放4℃过夜,待血块收缩后分离血清(离心3500rpm, 10分钟)。 4.血清的保存 如要长时间存放,56℃灭活,在血清里添加0.1%叠氮化钠,将血清进行小量分装,放 置低温冰箱内保存265 免疫周次 不完全佐剂(ml) 抗原 小牛血清(ml) PBS(ml) 灭活结核杆菌 免疫用量 ml/只 注射部位 石蜡油 羊毛脂 一 0.5 1.5 1.5 0.5 0.1-0.2mg/ml 2 四只脚掌 二 0.5 1.5 1 1 2 腋窝 腹股沟 脊背 三 1 1 2 腹腔 四 0.3 0.2 0.5 耳缘静脉 福氏完全佐剂常用的制备方法有研磨法和注射器法两种。研磨法方法如下：将经高压除 菌的石蜡油 0.5ml 和羊毛脂 1.5ml 放入无菌的乳钵内，再慢慢滴入小牛血清。PBS 及已灭活 的结核杆菌，边滴边研磨，直至成为乳白色粘稠的油包水乳剂。检验方法是取一滴乳剂滴入 水面（冷水），如不扩散，则完全佐剂已研磨成功。此配方为一只兔子的免疫用量，也可按 比例多组联合研磨。 注射器法：将两个注射器中间接上一根短的胶皮，注射器左右推拉， 使注射器内的溶剂充分乳化，直至形成油包水乳剂。 2. 免疫血清效价的测定 第四周时通过耳缘静脉采血 1ml，先将血液置室温 30 分钟，离心（3500rpm）10 分钟， 取出血清。用双向免疫扩散法测定抗血清的效价，以确定免疫效果。 3. 颈动脉采血 将禁食 12 小时或隔夜的兔子仰面固定于固定板上，头部放低，暴露出颈部，剪开颈中 部皮肤，约 10cm 长。沿气管分离皮下组织，直至暴露气管前的胸锁乳突肌。仔细分开胸锁 乳突肌（注意勿剪断小血管），在肌束下面靠近气管两侧，可以看到搏动的颈动脉。取二把 血管钳在血管的远心端（近头部）夹紧，一把夹住近心端的血管（在近心端用线扎好与血管 相连的神经，然后用剪子在二把血管钳中间的血管上剪一小口插入塑料放血管（用线固定）， 轻轻放开近心端的止血钳，使血很快射入三角瓶中。直至血流缓慢时（也可用同法在另一侧 动脉内插管放血）将固定板后肢端抬高，增加放血量。 将三角瓶盖好，放置室温一小时，再放 4℃过夜，待血块收缩后分离血清（离心 3500rpm, 10 分钟）。 4．血清的保存 如要长时间存放，56℃灭活，在血清里添加 0.1%叠氮化钠，将血清进行小量分装，放 置低温冰箱内保存