2.酶法一一双脱氧终止法,自动测序的原理 双脱氧链终止法 DNA的合成总是从5°端向3'端进行的。DNA的合成需要模板以及相应 的引导核酸链。DNA的合成过程中,在合成的DNA链的3末端,依据碱 基配对的原则,通过生成新的3,5一磷酸二酯键,使DNA链合成终止,产 生短的DNA链。具体测序工作中,平行进行四组反应,每组反应均使用相 同的模板,相同的引物以及四种脱氧核苷酸;并在四组反应中各加入适量 的四种之一的双脱氧核苷酸,使其随机地接入DNA链中,使链合成终止, 产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再 经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开,经过放射自显影显示区带, 就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列 Primer HCTAAGCTCGACT dCTP, dGTP, dATP, dTTP ddATP ddcTp ddGTP t ddTTP -ATTCGAGCTGILA TTCGAGCTddG -GATTCGAGCIIT HlA tCDd - GAdd G 3AGTcGAGcTTAG Autoradiogram of electropboresis gel 目前根据该原理能够实现对DNA的自动测序。 3.DNA化学降解法 Maxam和 Gilbert(1977):基本步骤为(1)先将DNA的末端之一进行标记 通常为放射性同位素32P;(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定2.酶法——双脱氧终止法，自动测序的原理 Sanger 双脱氧链终止法： DNA 的合成总是从 5’端向 3’端进行的。DNA 的合成需要模板以及相应 的引导核酸链。DNA 的合成过程中，在合成的 DNA 链的 3’末端，依据碱 基配对的原则，通过生成新的 3’,5’－磷酸二酯键，使 DNA 链合成终止，产 生短的 DNA 链。具体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相 同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量 的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入 DNA 链中，使链合成终止， 产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的 DNA 链。这四组 DNA 链再 经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带， 就可以直接读出被测 DNA 的核苷酸序列。 目前根据该原理能够实现对 DNA 的自动测序。 3. DNA 化学降解法 Maxam 和 Gilbert（1977）：基本步骤为(1)先将 DNA 的末端之一进行标记 (通常为放射性同位素 32P；(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定