第二章核酸搋论 第一节概论 核酸的发现 1868年,瑞士的内科医生 Fried rich Miescher从脓细胞核中提取到一种 富含磷元素的酸性化合物,将其称为核质( nuclein):后来他又从鲭鱼精子中 分离出类似的物质,此酸性物质即是现在所知的核酸( nucleic acid)。1944 年 Oswald Avery, Colin Macleod和 Maclyn McCarty发现,一种有夹膜、具致 病性的肺炎球菌中提取的核酸DNA( deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸), 可使另一种无夹膜,不具致病性的肺炎球菌的遗传性状发生改变,转变为 有夹膜,具致病性的肺炎球菌,且转化率与DNA纯度呈正相关,若将DNA 预先用DNA酶降解,转化就不发生。该项实验彻底纠正了蛋白质携带遗传 信息这一错误认识,确立了核酸是遗传物质的重要地位。1953年 Watson 和Crik创立的DNA双螺旋结构模型,不仅阐明了DNA分子的结构特征 而且提出了DNA作为执行生物遗传功能的分子,从亲代到子代的DNA复 制( eplication)过程中,遗传信息的传递方式及高度保真性,为遗传学进入 分子水平奠定了基础,成为现代分子生物学发展史上最为辉煌的里程碑。 后来的研究又发现了另一类核酸RNA( ribonucleic acid,核糖核酸),RNA在 遗传信息的传递中起着重要的作用。从此,核酸研究的进展日新月异,如 今,由核酸研究而产生的分子生物学及其基因工程技术已渗透到医药学 农业、化工等领域的各个学科,人类对生命本质的认识进入了一个崭新的 天地。 、核酸的种类、分布 核酸是生物体内的高分子化合物,包括DNA和RNA两大类。 RNA包括三种:mRNA、tRNA、rRNA,二者组成不同。 细胞核、细胞质(线粒体、叶绿体等)。 、核酸的化学组成 组成核酸的元素有C、H、O、N、P等,与蛋白质比较,其组成上有 两个特点:一是核酸一般不含元素S,二是核酸中P元素的含量较多并且 恒定,约占9~10%。因此,核酸定量测定的经典方法,是以测定P含量来 代表核酸量。 核酸经水解可得到核苷酸,因此核苷酸是核酸的基本单位。核酸就是 由很多单核苷酸聚合形成的多聚核苷酸。核苷酸可被水解产生核苷和磷酸, 核苷还可再进一步水解,产生戊糖和含氮碱基。 口核酸 多聚核苷酸( polynucleotides) n核苷酸( nucleotide(dAMP、AMP) 磷酸 核苷( nucleoside)(dA、A) 戊糖- ribose(R) 碱基AGUC
第二章 核酸概论 第一节 概 论 一、核酸的发现 1868 年，瑞士的内科医生 Friedrich Miescher 从脓细胞核中提取到一种 富含磷元素的酸性化合物，将其称为核质(nuclein)；后来他又从鲭鱼精子中 分离出类似的物质，此酸性物质即是现在所知的核酸(nucleic acid)。1944 年 Oswald Avery,Colin Macleod 和 Maclyn McCarty 发现，一种有夹膜、具致 病性的肺炎球菌中提取的核酸 DNA(deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸)， 可使另一种无夹膜，不具致病性的肺炎球菌的遗传性状发生改变，转变为 有夹膜，具致病性的肺炎球菌，且转化率与 DNA 纯度呈正相关，若将 DNA 预先用 DNA 酶降解，转化就不发生。该项实验彻底纠正了蛋白质携带遗传 信息这一错误认识，确立了核酸是遗传物质的重要地位。1953 年 Watson 和 Crick 创立的 DNA 双螺旋结构模型，不仅阐明了 DNA 分子的结构特征， 而且提出了 DNA 作为执行生物遗传功能的分子，从亲代到子代的 DNA 复 制(replication)过程中，遗传信息的传递方式及高度保真性，为遗传学进入 分子水平奠定了基础，成为现代分子生物学发展史上最为辉煌的里程碑。 后来的研究又发现了另一类核酸 RNA(ribonucleic acid,核糖核酸)，RNA 在 遗传信息的传递中起着重要的作用。从此，核酸研究的进展日新月异，如 今，由核酸研究而产生的分子生物学及其基因工程技术已渗透到医药学、 农业、化工等领域的各个学科，人类对生命本质的认识进入了一个崭新的 天地。 二、核酸的种类、分布 核酸是生物体内的高分子化合物，包括 DNA 和 RNA 两大类。 RNA 包括三种：mRNA 、tRNA、rRNA ，二者组成不同。 细胞核、细胞质（线粒体、叶绿体等）。 三、核酸的化学组成 组成核酸的元素有 C、H、O、N、P 等，与蛋白质比较，其组成上有 两个特点：一是核酸一般不含元素 S，二是核酸中 P 元素的含量较多并且 恒定，约占 9～10%。因此，核酸定量测定的经典方法，是以测定 P 含量来 代表核酸量。 核酸经水解可得到核苷酸，因此核苷酸是核酸的基本单位。核酸就是 由很多单核苷酸聚合形成的多聚核苷酸。核苷酸可被水解产生核苷和磷酸， 核苷还可再进一步水解，产生戊糖和含氮碱基。 (dAMP、AMP) (dA、A)
1.碱基 分嘧啶碱基( pyrimid ine)、嘌呤碱基( purine) 核苷酸中的碱基均为含氮杂环化合物,它们分別属于嘌呤衍生物和嘧 啶衍生物。核苷酸中的嘌呤碱( purine)主要是鸟嘌呤( guanine g和腺嘌呤 ( adenine,A);嘧啶碱( pyrimid ine)主要是胞嘧啶( cytosine,C)、尿嘧啶( uracil 和胸腺嘧啶( thymine,T。DNA和RNA都含有鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和胞嘧 啶(C);胸腺嘧啶(T一般而言只存在于DNA中,不存在于RNA中;而尿 嘧啶(U)只存在于RNA中,不存在于DNA中。它们的化学结构见下图: 知 Cytosine Guanine (RNAI DNA的碱基组成:C、G、A、T:RNA的碱基组成:C、G、A、U。 核酸中五种碱基中的酮基和氨基,均位于碱基环中氮原子的邻位,可 以发生酮式一醇式或氨基、亚氨基间的结构互变。这种互变异构在基因突 变和生物进化中具有重要作用。 有些核酸中还含有修饰碱基( mod ified bases,或稀有碱基, minor bases), 这些碱基大多是在上述嘌呤或嘧啶碱的不同部位甲基化( methylation或进 行其它的化学修饰而形成的衍生物。一般这些碱基在核酸中的含量稀少, 在各种类型核酸中的分布也不均一。DNA中的修饰碱基主要见于噬菌体 DNA,如5-甲基胞嘧啶(mC),5-羟甲基胞嘧啶hm5C;RNA中以RNA含 修饰碱基最多,如1-甲基腺嘌呤(mA),2,2一二甲基鸟嘌呤(m2G)和5,6- 二氢尿嘧啶(DHU等。 2戊糖 核酸中的戊糖有核糖( (ribose)和脱氧核糖( deoxyribose)两种,分别存在于 核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸中。为了与碱基标号相区别,通常将戊糖的C 原子编号都加上“′”,如C1′表示糖的第一位碳原子。 3核苷 (1)连接方式戊糖与嘧啶或嘌呤碱以糖苷键连接就称为核苷,通常 是戊糖的C1′与嘧啶碱的№或嘌呤碱的Nφ通过β-糖苷键相连接
1.碱基 分嘧啶碱基(pyrimidine) 、嘌呤碱基(purine) 核苷酸中的碱基均为含氮杂环化合物，它们分别属于嘌呤衍生物和嘧 啶衍生物。核苷酸中的嘌呤碱(purine)主要是鸟嘌呤(guanine,G)和腺嘌呤 (adenine,A)；嘧啶碱(pyrimidine)主要是胞嘧啶(cytosine,C)、尿嘧啶(uracil,U) 和胸腺嘧啶(thymine,T)。DNA 和 RNA 都含有鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和胞嘧 啶(C)；胸腺嘧啶(T)一般而言只存在于 DNA 中，不存在于 RNA 中；而尿 嘧啶(U)只存在于 RNA 中，不存在于 DNA 中。它们的化学结构见下图： DNA 的碱基组成：C、G、A、T； RNA 的碱基组成：C、G、A、U。 核酸中五种碱基中的酮基和氨基，均位于碱基环中氮原子的邻位，可 以发生酮式－醇式或氨基、亚氨基间的结构互变。这种互变异构在基因突 变和生物进化中具有重要作用。 有些核酸中还含有修饰碱基(modified bases，或稀有碱基，minor bases)， 这些碱基大多是在上述嘌呤或嘧啶碱的不同部位甲基化(methylation)或进 行其它的化学修饰而形成的衍生物。一般这些碱基在核酸中的含量稀少， 在各种类型核酸中的分布也不均一。DNA 中的修饰碱基主要见于噬菌体 DNA，如 5-甲基胞嘧啶(m5C)，5-羟甲基胞嘧啶 hm5C；RNA 中以 tRNA 含 修饰碱基最多，如 1-甲基腺嘌呤(m1A)，2,2 一二甲基鸟嘌呤(m22G)和 5,6- 二氢尿嘧啶(DHU)等。 2.戊糖 核酸中的戊糖有核糖(ribose)和脱氧核糖(deoxyribose)两种，分别存在于 核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸中。为了与碱基标号相区别，通常将戊糖的 C 原子编号都加上“′”，如 C1′表示糖的第一位碳原子。 3.核苷 （1）连接方式 戊糖与嘧啶或嘌呤碱以糖苷键连接就称为核苷，通常 是戊糖的 C1′与嘧啶碱的 N1 或嘌呤碱的 N9 通过β-糖苷键相连接
(2)常见核苷及其代号 核苷:嘌呤或嘧啶碱与核糖或脱氧核糖以糖苷键连接的复合物。 表:核酸中的常见核苷 简称代号简称代号 腺苷|A 脱氧腺苷|dA 鸟苷|G 脱氧鸟苷|dG 胞苷C脱氧胞苷dC 尿苷|U 脱氧胸苷dT 均为反式构象,但习惯上写顺式构象。 核苷的解离会影响到碱基配对,进而影响复制和翻译,甚至突变。 4核苷酸和稀有核苷酸 核苷中戊糖的羟基与磷酸以磷酸酯键连接而成为核苷酸。生物体内的 核苷酸大多数是核糖或脱氧核糖的Cs′上羟基被磷酸酯化,形成5′核苷 酸;当然也有一些其他的连接方式。 核苷+磷酸一 核苷酸 核苷酸的连接一一3’5磷酸二酯键 稀有核苷:除表:核酸中的常见8种核苷外,还有一些稀有核苷。 (1)稀有核苷可分为3大类: A.由稀有碱基组成的核苷;B.有2-O-甲基核糖组成的核苷;C碱基与 戊糖的连接方式与众不同的核苷。 如:假尿苷(ψ)、二氢尿嘧啶核苷(DHU、N°,N-二甲基腺苷(m°2A) 2-O-甲基腺苷(Am)等。 (2)稀有核苷的结合方式 A.基团甲基化,如:1-甲基腺苷(m1A)、m2A、N6.甲基腺苷(mA)。 BS代基团,如:2-硫代胞苷(S2C、2-硫代尿苷(S2U)、4-硫代尿苷(S4U) C氢化如:二氢尿苷OHU)、5-甲基56-二氢尿苷(m5DU) 其他修饰基团 CH3 +H-OH-CH2OH-COCH3-OCH2 COOH m SDO c Purine or pyrimidine Phosphate0-P--0-CH, O Pentose H OHOH H H
(2)常见核苷及其代号： 核苷：嘌呤或嘧啶碱与核糖或脱氧核糖以糖苷键连接的复合物。 表：核酸中的常见核苷 简称 代号 简称 代号 腺苷 A 脱氧腺苷 dA 鸟苷 G 脱氧鸟苷 dG 胞苷 C 脱氧胞苷 dC 尿苷 U － － － － 脱氧胸苷 dT 均为反式构象，但习惯上写顺式构象。 核苷的解离会影响到碱基配对，进而影响复制和翻译，甚至突变。 4.核苷酸和稀有核苷酸 核苷中戊糖的羟基与磷酸以磷酸酯键连接而成为核苷酸。生物体内的 核苷酸大多数是核糖或脱氧核糖的 C5′上羟基被磷酸酯化，形成 5′核苷 酸；当然也有一些其他的连接方式。 核苷+磷酸→→→→核苷酸 核苷酸的连接――3',5'磷酸二酯键 稀有核苷：除表：核酸中的常见 8 种核苷外，还有一些稀有核苷。 （1）稀有核苷可分为 3 大类： A.由稀有碱基组成的核苷；B.有 2’-O-甲基核糖组成的核苷；C.碱基与 戊糖的连接方式与众不同的核苷。 如：假尿苷（Ψ）、二氢尿嘧啶核苷(DHU)、N6 ,N6 -二甲基腺苷（m6 2A）、 2’-O-甲基腺苷(Am)等。 （2）稀有核苷的结合方式 A.基团甲基化，如：1-甲基腺苷（m1A）、m2A、N6 -甲基腺苷（m6A）。 B.S 代基团，如：2-硫代胞苷(S2C)、2-硫代尿苷（S 2U）、4-硫代尿苷（S 4U）。 C.氢化 如：二氢尿苷(DHU)、5-甲基-5,6-二氢尿苷(m5DU)。 其他修饰基团： -CH3 -S +H -OH -CH2OH -COCH3 -OCH2COOH m S D O om ac c
5细胞内的游离核苷酸、衍生物及其生物学作用 核苷一磷酸可以进一步磷酸化,形成核苷二磷酸和核苷三磷酸。如腺 苷一磷酸(AMP)、腺苷二磷酸(ADP)和腺苷三磷酸(AT)。 ADP、AP常参与能量转换,此外 GTP CTP UTP也有能量传递的作用 GDP、CDP、UDP参与物质的合成 ATP在腺苷酸环化酶的作用下可以生成3,5-环腺苷酸(cAMP), 同样GTP在鸟苷酸环化酶催化下也可生成3′,5′-环鸟苷酸(cGMP)。 cAMP和cGMP是高能化合物,即它们的3′-磷酰键的水解可释放出很大 的能量,但这两个化合物在细胞内含量很少,它们的重要作用不是作为能 量的供体,而主要是起着第二信使的作用 核苷酸或其衍生物一一辅酶或辅基的组成成分。 四、核苷酸的理化性质 核苷酸中的碱基具有多种理化性质,影响核苷酸和核酸的结构,并进 而影响功能 碱基的构型与紫外吸收 Pu和Py是共轭分子,这对核酸的结构、电子分布、光吸收有重要影 响。它们的大部分键具有双键性质,因此碱基环成为平面结构,随pH值不 同有不同的异构形式:生理pH值下,碱基以酮式构型存在 碱基影响核酸的结构(1)碱基堆积力: (2)碱基配对 第二节DNA的分子结构 碱基组成 C、G、A、T和少量稀有碱基 级结构 核酸是由很多单核苷酸聚合形成的多聚核苷酸( polynucleotide),DNA 的一级结构即是指四种核苷酸(dAMP、dCMP、dGMP、dIMP)按照一定的 排列顺序,通过磷酸二酯键连接形成的多核苷酸,由于核苷酸之间的差异
5.细胞内的游离核苷酸、衍生物及其生物学作用 核苷一磷酸可以进一步磷酸化，形成核苷二磷酸和核苷三磷酸。如腺 苷一磷酸（AMP）、腺苷二磷酸（ADP）和腺苷三磷酸（ATP）。 ADP、ATP 常参与能量转换，此外 GTP CTP UTP 也有能量传递的作用， GDP、CDP、 UDP 参与物质的合成。 ATP 在腺苷酸环化酶的作用下可以生成 3ˊ,5ˊ-环腺苷酸（cAMP）, 同样 GTP 在鸟苷酸环化酶催化下也可生成 3ˊ,5ˊ-环鸟苷酸（cGMP）。 cAMP 和 cGMP 是高能化合物，即它们的 3ˊ-磷酰键的水解可释放出很大 的能量，但这两个化合物在细胞内含量很少，它们的重要作用不是作为能 量的供体，而主要是起着第二信使的作用。 核苷酸或其衍生物——辅酶或辅基的组成成分。 四、核苷酸的理化性质 核苷酸中的碱基具有多种理化性质，影响核苷酸和核酸的结构，并进 而影响功能 碱基的构型与紫外吸收 Pu 和 Py 是共轭分子，这对核酸的结构、电子分布、光吸收有重要影 响。它们的大部分键具有双键性质，因此碱基环成为平面结构，随 pH 值不 同有不同的异构形式：生理 pH 值下，碱基以酮式构型存在。 碱基影响核酸的结构（１）碱基堆积力： （２）碱基配对： 第二节 DNA 的分子结构 一、碱基组成 C、G、A、T 和少量稀有碱基。 二、一级结构 核酸是由很多单核苷酸聚合形成的多聚核苷酸(polynucleotide)，DNA 的一级结构即是指四种核苷酸(dAMP、dCMP、dGMP、dTMP)按照一定的 排列顺序，通过磷酸二酯键连接形成的多核苷酸，由于核苷酸之间的差异
仅仅是碱基的不同,故又可称为碱基顺序。核苷酸之间的连接方式是 个核苷酸的5′位磷酸与下一位核苷酸的3′-OH形成3′,5′磷酸二酯键, 构成不分支的线性大分子,其中磷酸基和戊糖基构成DNA链的骨架,可变 部分是碱基排列顺序。核酸是有方向性的分子,即核苷酸的戊糖基的5′位 不再与其它核苷酸相连的5′末端,以及核苷酸的戊糖基3′位不再连有其 它核苷酸的3′末端,两个末端并不相同,生物学特性也有差异。 寡核苷酸( oligonucleotide)是指二至十个甚至更多个核苷酸残基以磷酸 二酯键连接而成的线性多核苷酸片段。目前多由仪器自动合成而用作DNA 合成的引物( Primer)、基因探针( probe)等,在现代分子生物学研究中具有广 泛的用途。 表示一个核酸分子结构的方法由繁至简有许多种。由于核酸分子结构 除了两端和碱基排列顺序不同外,其它的均相同。因此,在核酸分子结构 的简式表示方法中,仅须注明一个核酸分子的哪一端是5′末端,哪一端是 3′末端,末端有无磷酸基,以及核酸分子中的碱基顺序即可。如未特别注 明5′和3′末端,一般约定,碱基序列的书写是由左向右书写,左侧是5′ 末端,右侧为3′末端。如 pCpCpA或pCC-A或5CCA-3。 base pairs C:GI ase pair Nucleotide 三、一级结构的分析测定方法 重叠法一一最初
仅仅是碱基的不同，故又可称为碱基顺序。核苷酸之间的连接方式是：一 个核苷酸的5′位磷酸与下一位核苷酸的3′-OH形成3′，5′磷酸二酯键， 构成不分支的线性大分子，其中磷酸基和戊糖基构成 DNA 链的骨架，可变 部分是碱基排列顺序。核酸是有方向性的分子，即核苷酸的戊糖基的 5′位 不再与其它核苷酸相连的 5′末端，以及核苷酸的戊糖基 3′位不再连有其 它核苷酸的 3′末端，两个末端并不相同，生物学特性也有差异。 寡核苷酸(oligonucleotide)是指二至十个甚至更多个核苷酸残基以磷酸 二酯键连接而成的线性多核苷酸片段。目前多由仪器自动合成而用作 DNA 合成的引物(Primer)、基因探针(probe)等，在现代分子生物学研究中具有广 泛的用途。 表示一个核酸分子结构的方法由繁至简有许多种。由于核酸分子结构 除了两端和碱基排列顺序不同外，其它的均相同。因此，在核酸分子结构 的简式表示方法中，仅须注明一个核酸分子的哪一端是 5′末端，哪一端是 3′末端，末端有无磷酸基，以及核酸分子中的碱基顺序即可。如未特别注 明 5′和 3′末端，一般约定，碱基序列的书写是由左向右书写，左侧是 5′ 末端，右侧为 3′末端。如 pCpCpA 或 pC-C-A 或 5'-CCA-3'。 三、一级结构的分析测定方法 1.重叠法——最初
2.酶法一一双脱氧终止法,自动测序的原理 双脱氧链终止法 DNA的合成总是从5°端向3'端进行的。DNA的合成需要模板以及相应 的引导核酸链。DNA的合成过程中,在合成的DNA链的3末端,依据碱 基配对的原则,通过生成新的3,5一磷酸二酯键,使DNA链合成终止,产 生短的DNA链。具体测序工作中,平行进行四组反应,每组反应均使用相 同的模板,相同的引物以及四种脱氧核苷酸;并在四组反应中各加入适量 的四种之一的双脱氧核苷酸,使其随机地接入DNA链中,使链合成终止, 产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再 经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开,经过放射自显影显示区带, 就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列 Primer HCTAAGCTCGACT dCTP, dGTP, dATP, dTTP ddATP ddcTp ddGTP t ddTTP -ATTCGAGCTGILA TTCGAGCTddG -GATTCGAGCIIT HlA tCDd - GAdd G 3AGTcGAGcTTAG Autoradiogram of electropboresis gel 目前根据该原理能够实现对DNA的自动测序。 3.DNA化学降解法 Maxam和 Gilbert(1977):基本步骤为(1)先将DNA的末端之一进行标记 通常为放射性同位素32P;(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定
2.酶法——双脱氧终止法，自动测序的原理 Sanger 双脱氧链终止法： DNA 的合成总是从 5’端向 3’端进行的。DNA 的合成需要模板以及相应 的引导核酸链。DNA 的合成过程中，在合成的 DNA 链的 3’末端，依据碱 基配对的原则，通过生成新的 3’,5’－磷酸二酯键，使 DNA 链合成终止，产 生短的 DNA 链。具体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相 同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量 的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入 DNA 链中，使链合成终止， 产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的 DNA 链。这四组 DNA 链再 经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带， 就可以直接读出被测 DNA 的核苷酸序列。 目前根据该原理能够实现对 DNA 的自动测序。 3. DNA 化学降解法 Maxam 和 Gilbert（1977）：基本步骤为(1)先将 DNA 的末端之一进行标记 (通常为放射性同位素 32P；(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定
碱基的化学修饰;(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链;(4)聚丙烯酰胺 凝胶电泳将DNA链按长短分开;(5)根据放射自显影显示区带,直接读出 DNA的核苷酸序列。 第三节DNA的二级结构 、DNA的二级结构双螺旋结构模型( double heliⅸ model) 1953年, Watson和 Crick提出了著名的DNA分子的双螺旋结构模型, 揭示了遗传信息是如何储存在DNA分子中,以及遗传性状何以在世代间得 以保持。 50年代初, Changan应用紫外分光光度法结合纸层析等简单技术,对 多种生物DNA作碱基定量分析,发现DNA碱基组成有如下规律 (1)同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同 (2)一种生物DNA碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化 而改变 (3)几乎所有的DNA,无论种属来源如何,其腺嘌呤摩尔含量与胸腺嘧 啶摩尔含量相同([A]=[T),鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩尔含量相同(〖G] [C]),总的嘌呤摩尔含量与总的嘧啶摩尔含量相同([A+G]=[C]+[T)。 同,(4)不同生物来源的DNA碱基组成不同,表现在A+TG+C比值的不 这些结果后来为DNA的双螺旋结构模型提供了一个有力的佐证 Watson和 Crick以立体化学原理为准则,对 Wilkins和 Franklin的DNA ⅹ射线衍射分析结果加以研究,提出了DNA结构的双螺旋模式(如下图), 其主要内容如下: Minor groove Major 36A
碱基的化学修饰；(3)在修饰碱基位置化学法断开 DNA 链；(4)聚丙烯酰胺 凝胶电泳将 DNA 链按长短分开；(5)根据放射自显影显示区带，直接读出 DNA 的核苷酸序列。 第三节 DNA 的二级结构 一、DNA 的二级结构 双螺旋结构模型(double helix model) 1953 年，Watson 和 Crick 提出了著名的 DNA 分子的双螺旋结构模型， 揭示了遗传信息是如何储存在 DNA 分子中，以及遗传性状何以在世代间得 以保持。 50 年代初，Chargaff 应用紫外分光光度法结合纸层析等简单技术，对 多种生物 DNA 作碱基定量分析，发现 DNA 碱基组成有如下规律： (1)同一生物的不同组织的 DNA 碱基组成相同； (2)一种生物 DNA 碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化 而改变； (3)几乎所有的 DNA，无论种属来源如何，其腺嘌呤摩尔含量与胸腺嘧 啶摩尔含量相同([A］=［T])，鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩尔含量相同([G］ =［C])，总的嘌呤摩尔含量与总的嘧啶摩尔含量相同(［A＋G］=［C]＋［T])。 (4)不同生物来源的 DNA 碱基组成不同，表现在 A＋T/G＋C 比值的不 同； 这些结果后来为 DNA 的双螺旋结构模型提供了一个有力的佐证。 Watson 和 Crick 以立体化学原理为准则，对 Wilkins 和 Franklin 的 DNA X 射线衍射分析结果加以研究，提出了 DNA 结构的双螺旋模式（如下图）， 其主要内容如下：
(1)在DNA分子中,两股DNA链围绕一假想的共同轴心形成一右手螺 旋结构,双螺旋的螺距为34nm,直径为20nm (2)链的骨架( backbone)由交替出现的、亲水的脱氧核糖基和磷酸基构 成,位于双螺旋的外侧。 (3)碱基位于双螺旋的内侧,两股链中的嘌呤和嘧啶碱基以其疏水的、 近于平面的环形结构彼此密切相近,平面与双螺旋的长轴相垂直。一股链 中的嘌呤碱基与另一股链中位于同一平面的嘧啶碱基之间以氢链相连,称 为碱基互补配对或碱基配对 base pairing),碱基对层间的距离为0.34nm。碱 基互补配对总是腺嘌呤与胸腺嘧啶之间(A=形成两个氢键;或者鸟嘌呤与 胞嘧啶之间(G=C)形成三个氢键。 (4DNA双螺旋中的两股链走向是反平行的,一股链是5→3走向,另 股链是3→5走向。两股链之间在空间上形成一条大沟( major groove)和 条小沟( minor groove),这是蛋白质识别DNA的碱基序列,与其发生相互 作用的基础。DNA双螺旋的稳定由互补碱基对之间的氢键和碱基对层 间的堆积力 base stacking force维系。DNA双螺旋中两股链中碱基互补的特 点,逻辑地预示了DNA复制过程是先将DNA分子中的两股链分离开,然 后以每一股链为模板(亲本),通过碱基互补原则合成相应的互补链(复本), 形成两个完全相同的DNA分子。因为复制得到的每对链中只有一条是亲 链,即保留了一半亲链,将这种复制方式称为DNA的半保留复制(semi conservative replication)。后来证明,半保留复制是生物体遗传信息传递的 最基本方式。DNA双螺旋是核酸二级结构的重要形式。双螺旋结构理论 支配了近代核酸结构功能的研究和发展,是生命科学发展史上的杰出贡献。 后来证明, Watson和Crik发现的是B型。除B型外,还存在着A、B 和Z型的DNA A-DNA、B-DNA和ZDNA的主要结构特点 结构特点 A-DNA B-DNAZ-DNA 螺旋方向 右手右手左手 每一碱基对旋转角度37°346°30° 每一转的碱基对数 l1~104~12
(1)在 DNA 分子中，两股 DNA 链围绕一假想的共同轴心形成一右手螺 旋结构，双螺旋的螺距为 3.4nm，直径为 2.0nm。 (2)链的骨架(backbone)由交替出现的、亲水的脱氧核糖基和磷酸基构 成，位于双螺旋的外侧。 (3)碱基位于双螺旋的内侧，两股链中的嘌呤和嘧啶碱基以其疏水的、 近于平面的环形结构彼此密切相近，平面与双螺旋的长轴相垂直。一股链 中的嘌呤碱基与另一股链中位于同一平面的嘧啶碱基之间以氢链相连，称 为碱基互补配对或碱基配对(base pairing)，碱基对层间的距离为 0.34nm。碱 基互补配对总是腺嘌呤与胸腺嘧啶之间(A=T)形成两个氢键；或者鸟嘌呤与 胞嘧啶之间(G=C)形成三个氢键。 (4)DNA 双螺旋中的两股链走向是反平行的，一股链是 5’→3’走向，另 一股链是 3’→5’走向。两股链之间在空间上形成一条大沟(major groove)和 一条小沟(minor groove)，这是蛋白质识别 DNA 的碱基序列，与其发生相互 作用的基础。 DNA 双螺旋的稳定由互补碱基对之间的氢键和碱基对层 间的堆积力(base stacking force)维系。DNA 双螺旋中两股链中碱基互补的特 点，逻辑地预示了 DNA 复制过程是先将 DNA 分子中的两股链分离开，然 后以每一股链为模板(亲本)，通过碱基互补原则合成相应的互补链(复本)， 形成两个完全相同的 DNA 分子。因为复制得到的每对链中只有一条是亲 链，即保留了一半亲链，将这种复制方式称为 DNA 的半保留复制(semi conservative replication)。后来证明，半保留复制是生物体遗传信息传递的 最基本方式。 DNA 双螺旋是核酸二级结构的重要形式。双螺旋结构理论 支配了近代核酸结构功能的研究和发展，是生命科学发展史上的杰出贡献。 后来证明，Watson 和 Crick 发现的是 B 型。除 B 型外，还存在着 A、B 和 Z 型的 DNA。 A-DNA、B-DNA 和 Z-DNA 的主要结构特点 结构特点 A-DNA B-DNA Z-DNA 螺旋方向 右手 右手 左手 每一碱基对旋转角度 32.7° 34.6° 30° 每一转的碱基对数 ～11 ～10.4 ～12
碱基对相对螺旋轴的倾斜角度19°1.2°9 每一碱基对沿螺旋轴上升的距离0.23mm033nmn0.38nm 螺距 2.46nm340nm4.5nm 螺旋直径 255nm2.37nm184nm 细胞内的DNA不是以纯的BDNA存在的,DNA处于一种动的状态。 大多数DNA是以一种非常类似于标准B构象的形式存在的,但在螺旋的 定区域内会出现短序列的A-DNA。A-DNA中的碱基相对于螺旋轴大约倾 斜20°,每一转含有11个碱基对,螺旋比B-DNA宽。 Z-DNA是左手双螺旋结构,每一转含有12个碱基对。此外Z-DNA没 有明显的沟,因为碱基对只梢偏离螺旋轴。尽管可以合成Z-DNA,但在生 物体的基因组中很少出现这类DNA。 影响双螺旋结构稳定的因素:①氢键(次要);②碱基堆积力(主要) ③静电力。 DNA双螺旋结构的多态性与碱基顺序、环境因子(阴离子、阳离子、 相对湿度)等 第四节DNA的三、高级结构 级结构一主要是DNA超螺旋 双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成其三级结构,超螺旋是DNA三级 结构的主要形式。自从1965年 Vinograd等人发现多瘤病毒的环形DNA的 超螺旋以来,现已知道绝大多数原核生物都是共价封闭环( covalently closed circle;ccC)分子,这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构 ( superhetⅸx或 supercoil)。有些单链环形染色体或双链线形染色体(如噬菌体 入),在其生活周期的某一阶段,也必将其染色体变为超螺旋形式。对于真 核生物来说,虽然其染色体多为线形分子,但其DNA均与蛋白质相结合, 两个结合点之间的DNA形成一个突环(oo)结构,类似于CCC分子,同样 具有超螺旋形式。超螺旋按其方向分为正超螺旋和负超螺旋两种。真核生 物中,DNA与组蛋白八聚体形成核小体结构时,存在着负超螺旋。研究发 现,所有的DNA超螺旋都是由DNA拓扑异构酶产生的。 、DNA的高级结构一染色质和核小体 生物体内的核酸通常以核蛋白( nucleoprotein)的形式存在。基因组DNA 与蛋白质结合形成染色体(染色质) 1染色质 真核生物的染色体( chromasome)在细胞生活周期的大部分时间里都是 以染色质( chromatin)的形式存在的。染色质是一种纤维状结构,叫做染色质 丝,它是由最基本的单位一核小体( nucleosome)成串排列而成的。DNA是
碱基对相对螺旋轴的倾斜角度 19° 1.2° 9° 每一碱基对沿螺旋轴上升的距离 0.23nm 0.33nm 0.38nm 螺距 2.46nm 3.40nm 4.56nm 螺旋直径 2.55nm 2.37nm 1.84nm 细胞内的 DNA 不是以纯的 B-DNA 存在的，DNA 处于一种动的状态。 大多数 DNA 是以一种非常类似于标准 B 构象的形式存在的，但在螺旋的一 定区域内会出现短序列的 A-DNA。A-DNA 中的碱基相对于螺旋轴大约倾 斜 20°，每一转含有 11 个碱基对，螺旋比 B-DNA 宽。 Z-DNA 是左手双螺旋结构，每一转含有 12 个碱基对。此外 Z-DNA 没 有明显的沟，因为碱基对只梢偏离螺旋轴。尽管可以合成 Z-DNA，但在生 物体的基因组中很少出现这类 DNA。 影响双螺旋结构稳定的因素：①氢键（次要）；②碱基堆积力（主要） ③静电力。 DNA 双螺旋结构的多态性与碱基顺序、环境因子（阴离子、阳离子、 相对湿度）等。 第四节 DNA 的三、高级结构 一、三级结构－主要是 DNA 超螺旋 双螺旋 DNA 进一步扭曲盘绕则形成其三级结构，超螺旋是 DNA 三级 结构的主要形式。自从 1965 年 Vinograd 等人发现多瘤病毒的环形 DNA 的 超螺旋以来，现已知道绝大多数原核生物都是共价封闭环(covalently closed circle,CCC)分子， 这种双 螺旋 环状分 子再度 螺旋 化成为 超螺旋 结构 (superhelix 或 supercoil)。有些单链环形染色体或双链线形染色体(如噬菌体 入)，在其生活周期的某一阶段，也必将其染色体变为超螺旋形式。对于真 核生物来说，虽然其染色体多为线形分子，但其 DNA 均与蛋白质相结合， 两个结合点之间的 DNA 形成一个突环(loop)结构，类似于 CCC 分子，同样 具有超螺旋形式。超螺旋按其方向分为正超螺旋和负超螺旋两种。真核生 物中，DNA 与组蛋白八聚体形成核小体结构时，存在着负超螺旋。研究发 现，所有的 DNA 超螺旋都是由 DNA 拓扑异构酶产生的。 二、DNA 的高级结构－染色质和核小体 生物体内的核酸通常以核蛋白(nucleoprotein)的形式存在。基因组 DNA 与蛋白质结合形成染色体（染色质）。 1.染色质 真核生物的染色体(chromasome)在细胞生活周期的大部分时间里都是 以染色质(chromatin)的形式存在的。染色质是一种纤维状结构，叫做染色质 丝，它是由最基本的单位—核小体(nucleosome)成串排列而成的。DNA 是
染色体的主要化学成分,也是遗传信息的载体,约占染色体全部成分的 27%,另外组蛋白和非组蛋白占66%,RNA占6%。组蛋白 histones是一种 碱性蛋白质,P点一般在P100以上,其特点是富含二种碱性氨基酸(赖 氨酸和精氨酸) 2核小体 核小体是构成染色质的基本结构单位,使得染色质中DNA、RNA和蛋 白质组织成为一种致密的结构形式。核小体由核心颗粒( core particle)和连接 区DNA( linker dna)二部分组成,在电镜下可见其成捻珠状,前者包括组蛋 白H2A,H2B,H和H4各两分子构成的致密八聚体(又称核心组蛋白), 以及缠绕其上1.75圈长度为146bp的DNA链;后者包括两相邻核心颗粒 间约60bp的连接DNA和位于连接区DNA上的组蛋白H1,连接区使染色 质纤维获得弹性。核小体是DNA紧缩的第一阶段,在此基础上,DNA链 进一步折叠成每圈六个核小体,直径30nm的纤维状结构,这种30nm纤维 再扭曲成襻,许多襻环绕染色体骨架( Scaffold)形成棒状的染色体,最终压 缩将近一万倍。这样,才使每个染色体中几厘米长(如人染色体的DNA分 子平均长度为4cm)的DNA分子容纳在直径数微米(如人细胞核的直径为 6-7μm)的细胞核中 核小体的形成以及DNA超螺旋结构与功能的关系还不十分清楚,可能 与基因的转录调节控制有关。 第五节RNA的结构与功能 DNA并非蛋白质合成的直接模板,合成蛋白质的模板是RNA。与DNA 相比,RNA种类繁多,分子量相对较小,一般以单股链存在,但可以有局 部二级结构,其碱基组成特点是含有尿嘧啶( urid in,U〕而不含胸腺嘧啶,碱 基配对发生于C和G与U和A之间,RNA碱基组成之间无一定的比例关 系,且稀有碱基较多。此外,tRNA还具有明确的三级结构 RNA的分类 细胞核和胞液 线粒体 功能 核糖体RNA TRNA mt tRNA 核蛋白体组成成分 信使RNA 蛋白质合成模板 运RNA trNA mt tRNA 转运氨基酸 不均一核RNA hnRNA 成熟mRNA的前体 小核RNA SnRNA 参与 hnRNA的剪接、转运 小胞浆RNA SCRNA/7SL-RNA 定位合成的信 号识别体的组成成分 、信使RNA(mRNA) 遗传信息从DNA分子抄录到RNA分子中的过程称为转录 transcription)。在真核生物中,最初转录生成的RNA称为不均一核
染色体的主要化学成分，也是遗传信息的载体，约占染色体全部成分的 27%，另外组蛋白和非组蛋白占 66%，RNA 占 6%。组蛋白(histones)是一种 碱性蛋白质，PI 点一般在 PH10.0 以上，其特点是富含二种碱性氨基酸(赖 氨酸和精氨酸)。 2.核小体 核小体是构成染色质的基本结构单位，使得染色质中 DNA、RNA 和蛋 白质组织成为一种致密的结构形式。核小体由核心颗粒(core particle)和连接 区 DNA(linker DNA)二部分组成，在电镜下可见其成捻珠状，前者包括组蛋 白 H2A，H2B，H3 和 H4 各两分子构成的致密八聚体(又称核心组蛋白)， 以及缠绕其上 1.75 圈长度为 146bp 的 DNA 链；后者包括两相邻核心颗粒 间约 60bp 的连接 DNA 和位于连接区 DNA 上的组蛋白 H1，连接区使染色 质纤维获得弹性。核小体是 DNA 紧缩的第一阶段，在此基础上，DNA 链 进一步折叠成每圈六个核小体，直径 30nm 的纤维状结构，这种 30nm 纤维 再扭曲成襻，许多襻环绕染色体骨架(Scaffold)形成棒状的染色体，最终压 缩将近一万倍。这样，才使每个染色体中几厘米长(如人染色体的 DNA 分 子平均长度为 4cm)的 DNA 分子容纳在直径数微米(如人细胞核的直径为 6-7μm)的细胞核中。 核小体的形成以及 DNA 超螺旋结构与功能的关系还不十分清楚，可能 与基因的转录调节控制有关。 第五节 RNA 的结构与功能 DNA 并非蛋白质合成的直接模板，合成蛋白质的模板是 RNA。与 DNA 相比，RNA 种类繁多，分子量相对较小，一般以单股链存在，但可以有局 部二级结构，其碱基组成特点是含有尿嘧啶(uridin,U)而不含胸腺嘧啶，碱 基配对发生于 C 和 G 与 U 和 A 之间，RNA 碱基组成之间无一定的比例关 系，且稀有碱基较多。此外，tRNA 还具有明确的三级结构。 RNA 的分类 细胞核和胞液 线粒体 功能 核糖体 RNA rRNA mt tRNA 核蛋白体组成成分 信使 RNA mRNA mt mRNA 蛋白质合成模板 转运 RNA tRNA mt tRNA 转运氨基酸 不均一核 RNA hnRNA 成熟 mRNA 的前体 小核 RNA snRNA 参与 hnRNA 的剪接、转运 小胞浆 RNA scRNA/7SL-RNA 蛋白质内质网定位合成的信 号识别体的组成成分 一、信使 RNA(mRNA) 遗传信息从 DNA 分子抄录到 RNA 分子中的过程称为转录 (transcription)。在真核生物中，最初转录生成的 RNA 称为不均一核