第九章DNA的生曲合成 第九章DNA的生物合成 (The Biosynthesis of DNA) 脱氧核糖核酸(DNA)是生物界遗传的主要物质基础。生物有机体的遗传特 征以密码(code)的形式编码在DNA分子上,表现为特定的核苷酸排列顺序(即 遗传信息),在细胞分裂前通过DNA的复制( Replication),将遗传信息由亲代 传递给子代,在后代的个体发育过程中,遗传信息由DNA转录( Transcription 给RNA,并指导蛋白质合成,以执行各种生命功能,使后代表现出与亲代相 似的遗传性状,这种遗传信息的传递方向,是从DNA到RNA再到蛋白质, 即所谓的生物学“中心法则”,80年代以后在某些致癌RNA病毒中发现遗传 信息也可存在于RNA分子中,由RNA通过逆转录( reverse transcription)的方 式将遗传信息传递给DNA。这为中心法则加入了新的内容 复制 录 蛋白质 耐译 中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律,揭示遗传的分子基础 不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识, 而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程,给人类的生产和生 来了深刻的革命。 复制:以亲代DNA双链中的每一股链为模板,按照碱基配对原则,合成 出与亲代完全相同的两个双链DNA分子的过程。 转录:以DNA为模板,按照碱基配对原则,将DNA分子的遗传信息转 移到RNA分子上的过程。 翻译:以RNA为模板,根据三个碱基决定一个AA的原则,合成具有特 定AA顺序的蛋白质的过程 逆转录:逆转录病毒能以其RNA为模板,合成DNA,称为逆转录 本章的内容主要涉及DNA生物合成的三个方面,第一,DNA复制:第 ,细胞内DNA受到损伤时进行的修复作用:第三,RNA反转录为DNA
第九章 DNA 的生物合成 ·1· 蛋白质 翻译 转录 逆转录 复制 复制 DNA RNA 蛋白质 翻译 转录 逆转录 复制 复制 DNA RNA 第九章 DNA 的生物合成 (The Biosynthesis of DNA) 脱氧核糖核酸(DNA)是生物界遗传的主要物质基础。生物有机体的遗传特 征以密码(code)的形式编码在 DNA 分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序（即 遗传信息），在细胞分裂前通过 DNA 的复制(Replication)，将遗传信息由亲代 传递给子代，在后代的个体发育过程中，遗传信息由 DNA 转录(Transcription) 给 RNA，并指导蛋白质合成，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相 似的遗传性状，这种遗传信息的传递方向，是从 DNA 到 RNA 再到蛋白质， 即所谓的生物学“中心法则”，80 年代以后在某些致癌 RNA 病毒中发现遗传 信息也可存在于 RNA 分子中，由 RNA 通过逆转录(reverse transcription)的方 式将遗传信息传递给 DNA。这为中心法则加入了新的内容。 ? 中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础， 不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识， 而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带 来了深刻的革命。 复制：以亲代 DNA 双链中的每一股链为模板，按照碱基配对原则，合成 出与亲代完全相同的两个双链 DNA 分子的过程。 转录：以 DNA 为模板，按照碱基配对原则，将 DNA 分子的遗传信息转 移到 RNA 分子上的过程。 翻译：以 RNA 为模板，根据三个碱基决定一个 AA 的原则，合成具有特 定 AA 顺序的蛋白质的过程。 逆转录：逆转录病毒能以其 RNA 为模板，合成 DNA，称为逆转录。 本章的内容主要涉及 DNA 生物合成的三个方面，第一，DNA 复制；第 二，细胞内 DNA 受到损伤时进行的修复作用；第三，RNA 反转录为 DNA
第九章DNA的生曲合成 第一节DNA的复制 DNA做为遗传物质的基本特点就是在细胞分裂前进行准确地自我复制 ( self replication),使DNA的量成倍增加,这是细胞分裂的物质基础。曾经有 过多种关于DNA复制方式的学说,包括半保留复制,全保留复制以及分散复 制等。1953年 Watson和 Crick提出DNA双螺旋结构模型指出,DNA是由二 条互补的脱氧核苷酸链组成,所以一条DNA链上的核苷酸排列顺序是由图 16-1双螺旋DNA的复制另一条决定的。这就说明DNA的复制是由原来存在 的分子为模板来合成新的链 、DNA复制的方式及一般过程 (一)DNA的半保留复制( semiconservative replication) Watson和(rick在提出DNA双螺旋结构模型时即推测,DNA在复制时 首先两条链之间的氢键断裂,两条链分开,然后以每一条链分别做模板各自 合成一条新的DNA链,这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA 另一条链是新合成的,这种复制方式为半保留复制(如P407图) 1958年 Meselson和Stah利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA 的半保留复制,他们将大肠杆菌放在含有15N标记的NHC1培养基中繁殖了 15代,使所有的大肠杆菌DNA被1N所标记,可以得到1N标记的DNA。 然后将细菌转移到含有14N标记的NH4Cl培养基中进行培养,在培养不同代 数时,收集细菌,裂解细胞,用氯化铯(CsC)密度梯度离心法观察DNA所处 的位置。由于15N-DNA的密度比普通DNA(4N-DNA)的密度大,在氯化铯密 度梯度离心( density gradient centrifugation)时,两种密度不同的DNA分布在不 同的区带(如下图)
第九章 DNA 的生物合成 ·2· 第一节 DNA 的复制 DNA 做为遗传物质的基本特点就是在细胞分裂前进行准确地自我复制 (self replication)，使 DNA 的量成倍增加，这是细胞分裂的物质基础。曾经有 过多种关于 DNA 复制方式的学说，包括半保留复制，全保留复制以及分散复 制等。1953 年 Watson 和 Crick 提出 DNA 双螺旋结构模型指出，DNA 是由二 条互补的脱氧核苷酸链组成，所以一条 DNA 链上的核苷酸排列顺序是由图 16-1 双螺旋 DNA 的复制另一条决定的。这就说明 DNA 的复制是由原来存在 的分子为模板来合成新的链。 一、DNA 复制的方式及一般过程 （一）DNA 的半保留复制(semiconservative replication) Watson 和 Crick 在提出 DNA 双螺旋结构模型时即推测，DNA 在复制时 首先两条链之间的氢键断裂，两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自 合成一条新的 DNA 链，这样新合成的子代 DNA 分子中一条链来自亲代 DNA， 另一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制（如 P407 图）。 1958 年 Meselson 和 Stahl 利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了 DNA 的半保留复制，他们将大肠杆菌放在含有 15N 标记的 NH4Cl 培养基中繁殖了 15 代，使所有的大肠杆菌 DNA 被 15N 所标记，可以得到 15N 标记的 DNA。 然后将细菌转移到含有 14N 标记的 NH4Cl 培养基中进行培养，在培养不同代 数时，收集细菌，裂解细胞，用氯化铯(CsCl)密度梯度离心法观察 DNA 所处 的位置。由于 15N-DNA 的密度比普通 DNA(14N-DNA)的密度大，在氯化铯密 度梯度离心(density gradient centrifugation)时，两种密度不同的 DNA 分布在不 同的区带（如下图）
第九章DNA的生曲合成 () 6⑨ E ai Coven Rep iate 15 Centrifuge Centrifuge Centrifuge Centifuge x21y223 实验结果表明:在全部由1N标记的培养基中得到的15N-DNA显示为一 条重密度带位于离心管的管底。当转入1N标记的培养基中繁殖后第一代,得 到了一条中密度带,这是15N-DNA和N-DNA的杂交分子。第二代有中密度 带及低密度带两个区带,这表明它们分别为15NN-DNA和14N1N-DNA。随 着以后在1N培养基中培养代数的增加,低密度带增强,而中密度带逐渐减弱, 离心结束后,从管底到管口,CsCl溶液密度分布从高到低形成密度梯度,不 同重量的DNA分子就停留在与其相当的CsCl密度处,在紫外光下可以看到 DNA分子形成的区带。为了证实第一代杂交分子确实是一半15N-DNA一半 14N-DNA,将这种杂交分子经加热变性,对于变性前后的DNA分别进行CsCl 密度梯度离心,结果变性前的杂交分子为一条中密度带,变性后则分为两条 区带,即重密度带(NDNA)及低密度带(1N-DNA)。这个实验只有用半保留 制的理论才能得到圆满的解释。 半保留复制的生物学意义:使生物的遗传性保持了相对稳定性 (二)DNA复制的一般过程 DNA双螺旋是由两条方向相反的单链组成,复制开始时,双链打开,形 成一个复制叉( replicative fork,从打开的起点向一个方向形成)或一个复制泡 ( replicative bubble,从打开的起点向两个方向形成)。两条单链分别做模板。 各自合成一条新的DNA链。由于DNA一条链的走向是5→3方向,另一条链
第九章 DNA 的生物合成 ·3· 实验结果表明：在全部由 15N 标记的培养基中得到的 15N-DNA 显示为一 条重密度带位于离心管的管底。当转入 14N 标记的培养基中繁殖后第一代，得 到了一条中密度带，这是 15N-DNA 和 14N-DNA 的杂交分子。第二代有中密度 带及低密度带两个区带，这表明它们分别为 15N14N-DNA 和 14N14N-DNA。随 着以后在 14N 培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度带逐渐减弱， 离心结束后，从管底到管口，CsCl 溶液密度分布从高到低形成密度梯度，不 同重量的 DNA 分子就停留在与其相当的 CsCl 密度处，在紫外光下可以看到 DNA 分子形成的区带。为了证实第一代杂交分子确实是一半 15N-DNA－半 14N-DNA，将这种杂交分子经加热变性，对于变性前后的 DNA 分别进行 CsCl 密度梯度离心，结果变性前的杂交分子为一条中密度带，变性后则分为两条 区带，即重密度带( 15N-DNA)及低密度带( 14N-DNA)。这个实验只有用半保留 复制的理论才能得到圆满的解释。 半保留复制的生物学意义:使生物的遗传性保持了相对稳定性。 （二）DNA 复制的一般过程 DNA 双螺旋是由两条方向相反的单链组成，复制开始时，双链打开，形 成一个复制叉(replicative fork,从打开的起点向一个方向形成)或一个复制泡 (replicative bubble，从打开的起点向两个方向形成) 。两条单链分别做模板。 各自合成一条新的 DNA 链。由于 DNA 一条链的走向是 5'→3'方向，另一条链
第九章DNA的生曲合成 的走向是3→5方向,但生物体内DNA聚合酶只能催化DNA从5→3的方向 合成。那么,两条方向不同的链怎样才能做模板呢?这个问题由日本学者冈 崎先生解决。 Unidirectional Bidirectional Origin Replication forks 原来,在以3→5方向的母链为模板时,复制合成出一条5→3方向的前 导链( leading strand),前导链的前进方向与复制叉打开方向是一致的,因此前 导链的合成是连续进行的,而另一条母链DNA是5→3方向,它作为模板时 复制合成许多条5→3方向的短链,叫做随从链( agging strand),随从链的前进 方向是与复制叉的打开方向相反的。随从链只能先以片段的形式合成,这些 片段就叫做冈崎片段( Okazaki fragments),原核生物冈崎片段含有1000~200 核苷酸,真核生物一般100~200核苷酸。最后再将多个冈崎片段连接成一条 完整的链。由于前导链的合成是连续进行的,而随从链的合成是不连续进行 的,所以从总体上看DNA的复制是半不连续复制(见下图) Lead strand Direction of me 3 5 of replication fork Oka? Lagging 解链 RNA引物 合I
第九章 DNA 的生物合成 ·4· 解旋酶 DNA聚 合酶III 解链酶 RNA引物 引物酶和 引发体 DNA聚 合酶I SSB 3´ 3´ 5´ 5´ 3´ 5´ RNA 引物 解旋酶 DNA聚 合酶III 解链酶 RNA引物 引物酶和 引发体 DNA聚 合酶I SSB 3´ 3´ 5´ 5´ 3´ 5´ RNA 引物 的走向是 3'→5'方向，但生物体内 DNA 聚合酶只能催化 DNA 从 5'→3'的方向 合成。那么，两条方向不同的链怎样才能做模板呢？这个问题由日本学者冈 崎先生解决。 原来，在以 3'→5'方向的母链为模板时，复制合成出一条 5'→3'方向的前 导链(leading strand)，前导链的前进方向与复制叉打开方向是一致的，因此前 导链的合成是连续进行的，而另一条母链 DNA 是 5'→3'方向，它作为模板时， 复制合成许多条 5'→3'方向的短链，叫做随从链(lagging strand)，随从链的前进 方向是与复制叉的打开方向相反的。随从链只能先以片段的形式合成，这些 片段就叫做冈崎片段(Okazaki fragments)，原核生物冈崎片段含有 1000～2000 核苷酸，真核生物一般 100～200 核苷酸。最后再将多个冈崎片段连接成一条 完整的链。由于前导链的合成是连续进行的，而随从链的合成是不连续进行 的，所以从总体上看 DNA 的复制是半不连续复制(见下图)
第九章DNA的生曲合成 DNA复制的全部过程可以人为地分成三个阶段 第一个阶段为DNA复制的起始阶段,这个阶段包括起始点,复制方向以 及引发体的形成; 第二阶段为DNA链的延长,包括前导链及随从链的形成和切除RNA引 物后填补空缺及连接冈崎片段; 第三阶段为DNA复制的终止阶段。在DNA复制的整个过程中需要30多 种酶及蛋白质分子参加,我们将在DNA复制的各个阶段中着重介绍它们的作 用 、DNA复制的起始阶段 (一)DNA复制的起始点 复制是从DNA分子上的特定部位开始的,这一部位叫做复制起始点 ( originof replication)常用on或O表示(原点、起点)。细胞中的DNA复制一经 开始就会连续复制下去,直至完成细胞中全部基因组DNA的复制。DNA复 制从起始点开始直到终点为止,每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元 ( replicon)。在原核细胞中,每个DNA分子只有一个复制起始点,因而只有 个复制子,而在真核生物中,DNA的复制是从许多起始点同时开始的,所以 每个DNA分子上有许多个复制子。 DNA复制起始点有结构上的特殊性,例如:大肠杆菌染色体DNA复制 起始点Oric由422个核苷酸组成,是一系列对称排列的反向重复序列,即回 文结构( palindrome),其中有9个核苷酸或13个核苷酸组成的保守序列,这些 部位是大肠杆菌中DnaA蛋白识别的位置,大肠杆菌染色体DNA是环状双链 DNA,它的复制是典型的“θ”型复制(由于形状像希腊字母θ,见下图)。从 个起点开始,同时向两个方向进行复制,当两个复制方向相遇时,复制就 停止。而有些生物的DNA复制起始区是一段富含A·T的区段。这些特殊的 结构对于在DNA复制起始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都 是必须的 (二)DNA复制的方向(P408) 定点开始双向复制 这是原核生物和真核生物DNA复制最主要的形式,从一个特定位点解链 沿着两个相反的方向各生长出两条链,形成一个复制泡,用电子显微镜可以 观察到复制泡的存在(如下图)
第九章 DNA 的生物合成 ·5· DNA 复制的全部过程可以人为地分成三个阶段： 第一个阶段为 DNA 复制的起始阶段，这个阶段包括起始点，复制方向以 及引发体的形成； 第二阶段为 DNA 链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除 RNA 引 物后填补空缺及连接冈崎片段； 第三阶段为 DNA 复制的终止阶段。在 DNA 复制的整个过程中需要 30 多 种酶及蛋白质分子参加，我们将在 DNA 复制的各个阶段中着重介绍它们的作 用。 二、DNA 复制的起始阶段 （一）DNA 复制的起始点 复制是从 DNA 分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点 (originof replication)常用 ori 或 O 表示(原点、起点)。细胞中的 DNA 复制一经 开始就会连续复制下去，直至完成细胞中全部基因组 DNA 的复制。DNA 复 制从起始点开始直到终点为止，每个这样的 DNA 单位称为复制子或复制单元 (replicon)。在原核细胞中，每个 DNA 分子只有一个复制起始点，因而只有一 个复制子，而在真核生物中，DNA 的复制是从许多起始点同时开始的，所以 每个 DNA 分子上有许多个复制子。 DNA 复制起始点有结构上的特殊性，例如：大肠杆菌染色体 DNA 复制 起始点 Oric 由 422 个核苷酸组成，是一系列对称排列的反向重复序列，即回 文结构(palindrome)，其中有 9 个核苷酸或 13 个核苷酸组成的保守序列，这些 部位是大肠杆菌中 DnaA 蛋白识别的位置，大肠杆菌染色体 DNA 是环状双链 DNA，它的复制是典型的“θ”型复制(由于形状像希腊字母θ，见下图)。从 一个起点开始，同时向两个方向进行复制，当两个复制方向相遇时，复制就 停止。而有些生物的 DNA 复制起始区是一段富含 A·T 的区段。这些特殊的 结构对于在DNA复制起始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都 是必须的。 （二）DNA 复制的方向（P408） 1. 定点开始双向复制 这是原核生物和真核生物DNA复制最主要的形式，从一个特定位点解链， 沿着两个相反的方向各生长出两条链，形成一个复制泡，用电子显微镜可以 观察到复制泡的存在(如下图)
第九章DNA的生曲合成 2.定点开始单向复制 质粒 colEl是个典型的例子,复制从一个起点开始,以同一方向生长出两 条链,形成一个复制叉( replication fork) 3.两点开始单向复制 腺病毒DNA的复制是从两个起点开始的,形成两个复制叉,各以一个单 一方向复制出一条新链。 总之DNA复制的起点及方向不仅原核细胞与真核细胞不同,就是同属于 原核生物和真核生物的不同种属也有相当大的差异。 (三)DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质 1.解链酶( helicase) DNA开始复制时首先在起始点处解开双链,反应是在一种解链酶 ( helicase)的催化下进行的。解链酶需要ATP分解供给能量。大肠杆菌中DnaB 蛋白就有解链酶活性,与随从链的模板DNA结合,沿5→3方向移动;还有 种叫做Rep蛋白和前导链的模板DNA结合,沿3→5方向移动。解链酶的 作用就是打开DNA双链之间的氢键。 2.单链结合蛋白( single strand binding proteins,SsBP) 它与解开的单链DNA结合,使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切 酶对单链DNA的水解,保证了单链DNA做为模板时的伸展状态,SSBP可以 重复利用 3.引发体的形成 DNA复制起始的关健步骤是前导链DNA的合成,一旦前导链DNA的聚 合作用开始,随从链DNA的合成也随着开始。由于前导链的合成是连续进行
第九章 DNA 的生物合成 ·6· 2. 定点开始单向复制 质粒 colE1 是个典型的例子，复制从一个起点开始，以同一方向生长出两 条链，形成一个复制叉(replication fork)。 3. 两点开始单向复制 腺病毒 DNA 的复制是从两个起点开始的，形成两个复制叉，各以一个单 一方向复制出一条新链。 总之 DNA 复制的起点及方向不仅原核细胞与真核细胞不同，就是同属于 原核生物和真核生物的不同种属也有相当大的差异。 （三）DNA 复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质 1. 解链酶(helicase) DNA 开始复制时首先在起始点处解开双链，反应是在一种解链酶 (helicase)的催化下进行的。解链酶需要 ATP 分解供给能量。大肠杆菌中 DnaB 蛋白就有解链酶活性，与随从链的模板 DNA 结合，沿 5'→3'方向移动；还有 一种叫做 Rep 蛋白和前导链的模板 DNA 结合，沿 3'→5'方向移动。解链酶的 作用就是打开 DNA 双链之间的氢键。 2. 单链结合蛋白(single strand binding proteins, SSBP) 它与解开的单链 DNA 结合，使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切 酶对单链 DNA 的水解，保证了单链 DNA 做为模板时的伸展状态，SSBP 可以 重复利用。 3. 引发体的形成 DNA 复制起始的关健步骤是前导链 DNA 的合成，一旦前导链 DNA 的聚 合作用开始，随从链 DNA 的合成也随着开始。由于前导链的合成是连续进行
第九章DNA的生曲合成 的,所以它的起始相对简单,而随从链的合成是不连续进行的,所以引发阶 段比较复杂。大肠杆菌的引发前体由 DnaB. dnaC和单链结合蛋白组成 (1)引物酶( primase) 它是一种特殊的RNA聚合酶,可催化短片段RNA的合成。这种短RNA 片段一般十几个至数十个核苷酸不等,它们在DNA复制起始处做为引物。 RNA引物的3′OH末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一个磷酸 二酯键的位置 2)引发体( primosome 高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发体促进了引物酶的结 合,共同形成引发体。引发体主要在DNA随从链上开始,它连续地与引物酶 结合并解离,从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物,在引物RNA 的3-OH末端接下去合成DNA片段,这就是随从链不连续合成的开始 (3)DNA连接酶 催化双链DNA中一条链上缺口的共价连接,形成3,5一磷酸二酯键 缺口上的3ˆ-OH,5’-磷酰基必须相邻。如果缺少一个或几个核苷酸残基,连 接酶不能将缺口弥合。也不能将两条游离的单链连接起来。需要消耗能量, 大肠杆菌NAD,真核细胞ATP。 (4)、DNA解螺旋酶 DNA双螺旋在复制和修复中都必须解链,以便提供单链DNA模板。催 化DNA双螺旋解链,都有依赖双链DNA的 ATPase活性。水解ATP提供 解链所需能量。 复叉 解使赛 引物体 SsB二··↓ 二RNA引物 DNASE 前导 RNA引物
第九章 DNA 的生物合成 ·7· 复制叉的 移动方向 解旋酶 DNA聚 合酶III 解链酶 RNA引物 引物体 DNA聚 合酶I SSB 3´ 3´ 5´ 前导链 随后链 5´ 3´ 5´ RNA引物 3´ 3´ 的，所以它的起始相对简单，而随从链的合成是不连续进行的，所以引发阶 段比较复杂。大肠杆菌的引发前体由 DnaB. DnaC 和单链结合蛋白组成。 (1)引物酶(primase) 它是一种特殊的 RNA 聚合酶，可催化短片段 RNA 的合成。这种短 RNA 片段一般十几个至数十个核苷酸不等，它们在 DNA 复制起始处做为引物。 RNA 引物的 3'-OH 末端提供了由 DNA 聚合酶催化形成 DNA 分子第一个磷酸 二酯键的位置。 (2)引发体(primosome) 高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发体促进了引物酶的结 合，共同形成引发体。引发体主要在 DNA 随从链上开始，它连续地与引物酶 结合并解离，从而在不同部位引导引物酶催化合成 RNA 引物，在引物 RNA 的 3'-OH 末端接下去合成 DNA 片段，这就是随从链不连续合成的开始。 (3)DNA 连接酶 催化双链 DNA 中一条链上缺口的共价连接，形成 3’,5’－磷酸二酯键。 缺口上的 3’-OH，5’-磷酰基必须相邻。如果缺少一个或几个核苷酸残基，连 接酶不能将缺口弥合。也不能将两条游离的单链连接起来。需要消耗能量， 大肠杆菌 NAD+，真核细胞 ATP。 (4) 、DNA 解螺旋酶 DNA 双螺旋在复制和修复中都必须解链，以便提供单链 DNA 模板。催 化 DNA 双螺旋解链，都有依赖双链 DNA 的 ATPase 活性。水解 ATP 提供 解链所需能量
第九章DNA的生曲合成 (5)、拓扑异构E 大肠杆菌(原核生物)DNA为双链环形,其三级结构为麻花状超螺旋形 式,连环数是表示超螺旋的一个参数。大小和一级结构完全相同的DNA分子 可因连环数不同而形成一系列拓扑异构体 引起拓扑异构反应的E,亦称旋转酶。有两种类型: 拓扑异构酶Ⅰ,松解螺旋,能切开一条DNA链在复制叉前面的一段DNA 的一个磷酸二酯键,允许该DNA链绕着另一条完整的DNA链自由旋转,而 后由拓扑异构酶重新形成磷酸二酯键。(不需AP,可切无DNA双螺旋中的 条链)。 拓扑异构酶Ⅱ(旋转E)细菌环形DNA复制后,两个DNA分子是互锁 的。该酶结合到一双链DNA环上,造成一暂时性的双链断裂,另一DNA环 正好从这一断裂处穿过,然后拓扑异构酶重新封上这个链的断口。(引入负超 螺旋,需AP,消除复制叉前进时产生的扭曲张力。在无AP时,可松解负 超螺旋。可同时切断DNA双链。) 三、DNA复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子 DNA的复制实际上就是以DNA为模板在DNA聚合酶作用下,将游离的 四种脱氧单核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dP简写为dNTP)聚合成DNA的过程。 这是一个非常复杂的酶促反应,需要许多种酶和蛋白质参与,现分别叙述它 们在DNA复制中作用。 (一)DNA的聚合反应和DNA聚合酶 1957年, Arthur kornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶I(DNA polymerase I,简写 DNA pol I),后来又相继发现了DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚 合酶Ⅲ。( DNA polymeraseⅡ,Ⅲ,简写 DNA pol II, DNA pol)。实验证明大 肠杆菌中DNA复制的主要过程靠 DNA pol起作用,而 DNA pol I和 DNA pol 在DNA错配的校正和修复中起作用 这种酶的共同性质是 1)需要DNA模板,因此这类酶又称为依赖DNA的DNA聚合酶(DNA dependent DNA polymerase, DDDP 2)需要RNA或DNA做为引物( primer),即DNA聚合酶不能从头催化 DNA的起始: 3)催化dNTP加到引物的3-OH末端,因而DNA合成的方向是5→3 4)三种DNA聚合酶都属于多功能酶,它们在DNA复制和修复过程的不 同阶段发挥作用。由于DNA聚合酶Ⅰ是研究得最清楚而且代表了其他DNA 聚合酶的基本特点,所以我们着重介绍 DNA pol I的作用并指出另外二种 DNA pol的特殊性 1.DNA聚合酶I(P414)
第九章 DNA 的生物合成 ·8· (5) 、拓扑异构 E 大肠杆菌（原核生物）DNA 为双链环形，其三级结构为麻花状超螺旋形 式，连环数是表示超螺旋的一个参数。大小和一级结构完全相同的 DNA 分子， 可因连环数不同而形成一系列拓扑异构体。 引起拓扑异构反应的 E，亦称旋转酶。有两种类型： 拓扑异构酶Ⅰ，松解螺旋，能切开一条 DNA 链在复制叉前面的一段 DNA 的一个磷酸二酯键，允许该 DNA 链绕着另一条完整的 DNA 链自由旋转，而 后由拓扑异构酶重新形成磷酸二酯键。（不需 ATP，可切无 DNA 双螺旋中的 一条链）。 拓扑异构酶Ⅱ（旋转 E）细菌环形 DNA 复制后，两个 DNA 分子是互锁 的。该酶结合到一双链 DNA 环上，造成一暂时性的双链断裂，另一 DNA 环 正好从这一断裂处穿过，然后拓扑异构酶重新封上这个链的断口。（引入负超 螺旋，需 ATP，消除复制叉前进时产生的扭曲张力。在无 ATP 时，可松解负 超螺旋。可同时切断 DNA 双链。） 三、DNA 复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子 DNA 的复制实际上就是以 DNA 为模板在 DNA 聚合酶作用下，将游离的 四种脱氧单核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP,简写为 dNTP)聚合成 DNA 的过程。 这是一个非常复杂的酶促反应，需要许多种酶和蛋白质参与，现分别叙述它 们在 DNA 复制中作用。 （一）DNA 的聚合反应和 DNA 聚合酶 1957 年，Arthur kornberg 首次在大肠杆菌中发现 DNA 聚合酶Ⅰ(DNA polymerase Ⅰ,简写 DNA polⅠ)，后来又相继发现了 DNA 聚合酶Ⅱ和 DNA 聚 合酶Ⅲ。(DNA polymerase Ⅱ，Ⅲ，简写 DNA polⅡ,DNA polⅢ)。实验证明大 肠杆菌中 DNA 复制的主要过程靠 DNA polⅢ起作用，而 DNA polⅠ和 DNA pol Ⅱ在 DNA 错配的校正和修复中起作用。 这种酶的共同性质是： 1）需要 DNA 模板，因此这类酶又称为依赖 DNA 的 DNA 聚合酶(DNA dependent DNA polymerase, DDDP)； 2）需要 RNA 或 DNA 做为引物(primer)，即 DNA 聚合酶不能从头催化 DNA 的起始； 3）催化 dNTP 加到引物的 3'-OH 末端，因而 DNA 合成的方向是 5'→3'； 4）三种 DNA 聚合酶都属于多功能酶，它们在 DNA 复制和修复过程的不 同阶段发挥作用。由于 DNA 聚合酶Ⅰ是研究得最清楚而且代表了其他 DNA 聚合酶的基本特点，所以我们着重介绍 DNA polⅠ的作用并指出另外二种 DNA pol 的特殊性。 1. DNA 聚合酶Ⅰ（P414）
第九章DNA的生曲合成 DNA pol I是由一条多肽链组成,分子量为109KD。酶分子中含有一个 Zn2+,是聚合活性必须的 大肠杆菌每个细胞中约有400个酶分子,每个酶分子每分钟在37℃下能 催化667个核苷酸参入到DNA链中,用枯草杆菌蛋白酶可将此酶水解成两个 片段,大片段分子量为76KD,通常称为 klenow片段,小片段为34KD。大小 片段具有不同的酶活性 1)DNA聚合酶的5→3聚合活性 这是DNA聚合酶最主要的活性,按模板DNA上的核苷酸顺序,将互补 的dNTP逐个加到引物RNA3-OH末端,并促进3-OH与dNTP的5-PO4形 成磷酸二酯键,酶的专一性表现为新进入的dNTP必须与模板DNA碱基配对 时才有催化作用,5→3聚合活性存在于 klenow片段上。 2)DNA聚合酶的3→5外切核酸酶活性 这种酶活性的主要功能是从3'→5方向识别并切除DNA生长链末端与模 板DNA不配对而游离的核苷酸,这种功能称为校对功能,这是保证其聚合作 用的正确性不可缺少的,因此对于DNA复制中极高的保真性是至关重要的 3-5外切 图:DNA聚合酶的3-5外切酶水解位点 (3)DNA聚合酶的5→3外切核酸酶活性: 这种酶活性是从DNA链的5端向3末端水解已配对的核苷酸,本质是切 断磷酸二酯键,每次能切除10个核苷酸。因此,这种酶活性在DNA损伤的 修复中可能起重要作用,对完成的DNA片段去除5端的RNA引物也是必须 的 DNA pol I的5→3聚合活性和5→3外切酶活性协同作用,可以使DNA 条链上的切口从5→3方向移动,这种反应叫做缺刻平移( nick translation) 利用此反应可在体外对DNA片段进行放射性磷(a-32 PdNTP)的标记制成探针 ( probe),进行核酸的分子杂交实验,是现代分子生物学的一项重要技术(见右 许多实验证实 DNA pol I并不是DNA复制过程中的主要酶,它的作用主 要与DNA损伤后的修复有关 2DNA聚合酶( DNA pol ll) 分子量为120KD,每个细胞约有100个酶分子,活性只有 DNA pol I I的
第九章 DNA 的生物合成 ·9· 3´ 3´ 5´ 5´ 错配碱基 3´- 5´核酸外切 酶水解位点 3´- 5´核酸外切 酶水解位点 DNA polⅠ是由一条多肽链组成，分子量为 109KD。酶分子中含有一个 Zn2+，是聚合活性必须的。 大肠杆菌每个细胞中约有 400 个酶分子，每个酶分子每分钟在 37℃下能 催化 667 个核苷酸参入到 DNA 链中，用枯草杆菌蛋白酶可将此酶水解成两个 片段，大片段分子量为 76KD，通常称为 klenow 片段，小片段为 34KD。大小 片段具有不同的酶活性。 1）DNA 聚合酶的 5'→3'聚合活性 这是 DNA 聚合酶最主要的活性，按模板 DNA 上的核苷酸顺序，将互补 的 dNTP 逐个加到引物 RNA 3'-OH 末端，并促进 3'-OH 与 dNTP 的 5'-PO4 形 成磷酸二酯键，酶的专一性表现为新进入的 dNTP 必须与模板 DNA 碱基配对 时才有催化作用，5'→3'聚合活性存在于 klenow 片段上。 2）DNA 聚合酶的 3'→5'外切核酸酶活性 这种酶活性的主要功能是从 3'→5'方向识别并切除 DNA 生长链末端与模 板 DNA 不配对而游离的核苷酸，这种功能称为校对功能，这是保证其聚合作 用的正确性不可缺少的，因此对于 DNA 复制中极高的保真性是至关重要的。 图：DNA 聚合酶的 3´- 5´外切酶水解位点 (3)DNA 聚合酶的 5'→3'外切核酸酶活性： 这种酶活性是从 DNA 链的 5'端向 3'末端水解已配对的核苷酸，本质是切 断磷酸二酯键，每次能切除 10 个核苷酸。因此，这种酶活性在 DNA 损伤的 修复中可能起重要作用，对完成的 DNA 片段去除 5'端的 RNA 引物也是必须 的。 DNA polⅠ的 5'→3'聚合活性和 5'→3'外切酶活性协同作用，可以使 DNA 一条链上的切口从 5'→3'方向移动，这种反应叫做缺刻平移(nick translation)， 利用此反应可在体外对 DNA 片段进行放射性磷(α- 32PdNTP)的标记制成探针 (probe)，进行核酸的分子杂交实验，是现代分子生物学的一项重要技术（见右 图）。 许多实验证实 DNA polⅠ并不是 DNA 复制过程中的主要酶，它的作用主 要与 DNA 损伤后的修复有关。 2. DNA 聚合酶Ⅱ(DNA polⅡ) 分子量为 120KD，每个细胞约有 100 个酶分子，活性只有 DNA polⅠ的
第九章DNA的生曲合成 5%,它具有5→3聚合活性 Nick 和3→5外切活性,而没有 更 RNA or DNA 5→3外切活性,它的作用可 能与DNA损伤修复有关。 Template DNA strand 3.DNA聚合酶Ⅲ(DNA poll) polymerase I 这是在DNA复制过程 中起主要作用的聚合酶,它 5 是由一个多亚基(a,B,Y dNMPs dTPA rAMPs 组成的蛋白质分子,其分子 量>600kDa,整个酶分子形 成一个不对称的二聚体,每 OH(P 个大肠杆菌细胞中只有3 1000个酶分子,但催化 dNTP参入DNA链的速率却 是最快的,约为9000核苷酸 /每分钟/每个酶分子。这也 Nick 证明 DNA poll是DNA复 制过程中主要发挥作用的5 在大肠杆菌染色体 DNA进行复制时,DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是单独起作用的,而是与引发体 解链酶等构成一个复制体( replisome)。由于复制体的存在,先导链和随从链可 以同时复制。 DNA poll可能同时负责先导链和随从链的复制,在◆xX14的复 制中观察到引发体总是伴随着DNA噜噗(oop)的存在。由于随从链的模板 DNA在DNA聚合酶Ⅲ全酶上绕转了180°而形成一个噜噗,因此冈崎片段的 合成方向能够与先导链的合成方向以及复制体移动方向保持一致
第九章 DNA 的生物合成 ·10· 5%，它具有 5'→3'聚合活性 和 3'→5'外切活性，而没有 5'→3'外切活性，它的作用可 能与 DNA 损伤修复有关。 3. DNA 聚合酶Ⅲ(DNA polⅢ) 这是在 DNA 复制过程 中起主要作用的聚合酶，它 是由一个多亚基（α,β,γ, δ,δ’,ε,θ,τ,χ,ψ） 组成的蛋白质分子，其分子 量＞600kDa，整个酶分子形 成一个不对称的二聚体，每 个大肠杆菌细胞中只有 1000 个 酶 分子 ，但 催 化 dNTP参入DNA链的速率却 是最快的，约为 9000 核苷酸 /每分钟/每个酶分子。这也 证明 DNA polⅢ是 DNA 复 制过程中主要发挥作用的 酶。 在大肠杆菌染色体 DNA 进行复制时，DNA 聚合酶Ⅲ全酶并不是单独起作用的，而是与引发体， 解链酶等构成一个复制体(replisome)。由于复制体的存在，先导链和随从链可 以同时复制。DNA polⅢ可能同时负责先导链和随从链的复制，在φ ×17 4 的复 制中观察到引发体总是伴随着 DNA 噜噗(loop)的存在。由于随从链的模板 DNA 在 DNA 聚合酶Ⅲ全酶上绕转了 180°而形成一个噜噗，因此冈崎片段的 合成方向能够与先导链的合成方向以及复制体移动方向保持一致
