实验夕 大蒜细胞S0D的提取分 高与活性测定
实 验 六 大蒜细胞SOD酶的提取分 离与活性测定
在生命科学高度发展的今天,蛋白质 酶和核酸等生物大分子的结构与功能的 研究是探求生命奥秘的中心课题,而生 物大分子结构与功能的研究,必须首先 解决生物大分子的制备问题,有能够达 到足够纯度的生物大分子的制备工作为 前题,结构与功能的研究就无从谈起 然而生物大分子的分离纯化与制备是 件十分细致而困难的工作
在生命科学高度发展的今天，蛋白质、 酶和核酸等生物大分子的结构与功能的 研究是探求生命奥秘的中心课题，而生 物大分子结构与功能的研究，必须首先 解决生物大分子的制备问题，有能够达 到足够纯度的生物大分子的制备工作为 前题，结构与功能的研究就无从谈起。 然而生物大分子的分离纯化与制备是一 件十分细致而困难的工作
与化学产品的分离制备相比较,生物大分子的制 备有以下主要特点: (1)生物材料的组成极其复杂,常常包含有数百种 乃至几千种化合物。 2)许多生物大分子在生物材料中的含量极微,分 离纯化的步骤繁多,流程长 (3许多生物大分子一日离开了生物体内的环境时 就极易失活,因此分离过程中如何防止其失活,就 是生物大分子提取制备最困难之处 (4)生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的, 温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种 组成的综合影响,很难准确估计和判断。(影响因 素多)
◼ 与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制 备有以下主要特点： ◼ ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种 乃至几千种化合物。 ◼ ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分 离纯化的步骤繁多，流程长。 ◼ ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时 就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就 是生物大分子提取制备最困难之处。 ◼ ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的， 温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种 组成的综合影响，很难准确估计和判断。(影响因 素多 )
生物大分子的制备通常可按以下步骤进行 通过文献调研和预备性实验,掌握生物大分子目 的产物的物理化学性质。 口根据实验目的,建立相应的可靠的分析测定、及 制备方法,这是制备生物大分子的关键。 生物材料的破碎和预处理。 分离纯化方案的选择和探索,这是最困难的过 程 生物大分子制备物的均一性(即纯度)的鉴定 产物的浓缩,干燥和倮存
◼ 生物大分子的制备通常可按以下步骤进行： ◼ 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目 的产物的物理化学性质。 ◼ 根据实验目的，建立相应的可靠的分析测定、及 制备方法，这是制备生物大分子的关键。 生物材料的破碎和预处理。 分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过 程。 生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定。 产物的浓缩，干燥和保存
大蒜SO的提取及活性测定 试验目的: (1)掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤 (2)了解酶在提取过程中的两个参数:回收率、纯 化倍数。 (3)掌握离心机的使用。 实验原理P64, 邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化释放出O2生 成带色的中间产物,在420nm有最大吸收峰。邻苯 三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间, 生成物与时间有较好的线性关系 颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅,即酶活力越大, 颜色越浅
大蒜SOD的提取及活性测定 ◼ 试验目的： （1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。 （2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯 化倍数。 （3）掌握离心机的使用。 ◼ 实验原理:P64, 邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2 - ,生 成带色的中间产物,在420nm有最大吸收峰。邻苯 三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间， 生成物与时间有较好的线性关系。 颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大， 颜色越浅
试验试剂: 大 磷酸缓冲液(PH78,0.05mol(PH8.3) 氯仿—乙醇混合液 冷丙酮 邻苯三酚 浓盐酸 操作步骤: SO提取:称取5g大蒜蒜瓣加入石英砂研磨破碎细胞, 加入15m的PH7.80.05mo/的磷酸缓冲液,研磨搅拌20分 钟,使SOD充分溶解,6000rpm离心,弃去沉淀,得上清 液。(留出lml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)
◼ 试验试剂： 大蒜 磷酸缓冲液（PH7.8, 0.05mol/l)(PH8.3) 氯仿—乙醇混合液 冷丙酮 邻苯三酚 浓盐酸 ◼ 操作步骤： 1、SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞， 加入15ml的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分 钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清 液。(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)
大蒜SOD的提取及活性测定 2、除杂蛋白:提取液加入14体积的氯仿一乙 醇混合液搅拌10分钟,6000pm离心15min去沉 淀,得粗酶液。(取lml粗酶液备用精确测量 剩余粗酶液体积) 3、SOD酶的沉淀分离:剩余的粗酶液中加入 等体积的冷丙酮,搅拌15min,6000p0m离心 15min,得到SOD酶沉淀。将沉淀每管先加2ml 磷酸缓冲液,溶解后在加3m混匀。6000m离 心15min,取上清得到SOD酶液。取1m备用, 其余量取体积
大蒜SOD的提取及活性测定 ◼ 2、除杂蛋白 ：提取液加入1/4体积的氯仿－乙 醇混合液搅拌10分钟，6000rpm离心15min去沉 淀，得粗酶液。（取1ml粗酶液备用,精确测量 剩余粗酶液体积） ◼ 3、SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入 等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心 15min，得到SOD酶沉淀。将沉淀 每管先加2ml 磷酸缓冲液，溶解后在加3ml混匀。6000rpm离 心15min，取上清得到SOD酶液。取1ml备用， 其余量取体积
■4、粗酶液活性测定(邻苯三酚法) 提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测,具体步骤 如下 OD2 试剂/m空白管 对照管 提取液粗酶液酶液 ODI PH8.3缓 冲液 3 3 SOD提 取液 0 0 0.1 0.1 0.1 蒸馏水2 1.8 1.7 1.7 室温放置20min 邻苯三酚 0 0.2 0.2 0.2 0.2 加入邻苯三酚后迅速混匀准确计时4min加一滴浓盐酸 停止反应420nm测吸光值
◼ 4、粗酶液活性测定（邻苯三酚法） 提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤 如下。 试剂/ml 空白管 对照管 OD1 提取液 粗酶液 酶液 PH8.3缓 冲液 3 3 3 3 3 SOD提 取液 0 0 0.1 0.1 0.1 蒸馏水 2 1.8 1.7 1.7 1.7 室温放置20min 邻苯三酚 0 0.2 0.2 0.2 0.2 加入邻苯三酚后迅速混匀,准确计时4min,加一滴浓盐酸 停止反应,420nm测吸光值. OD2
5、溶液中可溶性蛋白含量测定: 分别从1m备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml 按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公 式计算蛋白质浓度 提取液稀释:50× 粗酶液稀释:20× 酶液稀释:10× 蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280-0.74A2)×稀释倍数
◼ 5、溶液中可溶性蛋白含量测定： 分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml 按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公 式计算蛋白质浓度. 提取液稀释:50 × 粗酶液稀释:20 × 酶液稀释:10 × 蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280 – 0.74A260) ×稀释倍数
6、计算: 酶活力单位Uml=2(OD1-OD2)×5/0 (1m应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达 到80%时的酶量 总活力U=活力单位×总体积 比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度 纯化倍数一粗酶液(酶液)比活力提取液比活力 回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力 7,试验结果讨论
◼ 6、计算： 酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1 (1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达 到80%时的酶量) 总活力U=活力单位×总体积 比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度 纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力 回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力 7,试验结果讨论