11重组DNA技术 11.1重组DNA技术是基因工程的核心技术 11.2获得需要的目的基因(外源基因) 11.3构建重组质粒和基因克隆 11.4转化受体细胞和转化子的筛选 11.5转化子的分析— Southern杂交 pRC/RSV
11 重组DNA技术 11.1 重组DNA技术是基因工程的核心技术 11.2 获得需要的目的基因（外源基因） 11.3 构建重组质粒和基因克隆 11.4 转化受体细胞和转化子的筛选 11.5 转化子的分析——Southern杂交
11.1重组DNA技术是基因工程的核心技术 重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴 起,并很快产生了许多生命科学的高技术产业。 重组DNA技术,又称为基因或分子克隆技术,是基 因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生 物学操作步骤。 所谓基因工程( genetic engineering)就是有意识地把 个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中 使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物
➢ 重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴 起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。 ➢ 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基 因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生 物学操作步骤。 ➢ 所谓基因工程(genetic engineering)就是有意识地把 一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中， 使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。 11.1 重组DNA技术是基因工程的核心技术
重组DNA操作一般步骤: (1)获得目的基因 (2)与克隆载体连接,形 成新的重组DNA分子; (3)用重组DNA分子转化 受体细胞,并能在受体 细胞中复制和遗传; (4)对转化子筛选和鉴定; (5)对获得外源基因的细 8/。0 胞或生物体通过培养, 获得所需的遗传性状或 表达出所需要的产物。 目的基因表 转基因动物转基因植
➢ 重组DNA操作一般步骤： （1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形 成新的重组DNA分子； （3）用重组DNA分子转化 受体细胞，并能在受体 细胞中复制和遗传； （4）对转化子筛选和鉴定； （5）对获得外源基因的细 胞或生物体通过培养， 获得所需的遗传性状或 表达出所需要的产物
11.2获得需要的目的基因(外源基因) 获得需要的目的基因常用的方法: (1)直接从生物体中提取总DNA,构建基因文库 ( gene library),从中调用目的基因; (2)以mRNA为模板,反转录合成互补的DNA片段; (3)利用聚合酶链式反应(PCR)特异性地扩增所需 要的目的基因片段,等等
➢获得需要的目的基因常用的方法： （1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库 (gene library)，从中调用目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需 要的目的基因片段，等等。 11.2 获得需要的目的基因（外源基因）
细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建 ●细胞内总DNA的提取分离程序 加入等体积 反复颠倒 超声波破 DNA沉淀 细胞膜 充分干燥 加缓冲液 -20储存 离心 除上清液 洗涤 加2.3倍 加入等体积 100%乙 氯仿取 取上清 20c 反复颠倒混合 放置过夜 絮状DNA沉淀
细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建 ⚫ 细胞内总DNA的提取分离程序
●紫外分光光度计测定D№A溶液的纯度和浓度 DNA溶液 蛋白质溶液2 DNA提取液 波长/nm 波长/nm DNA的浓度(mg/L)=A260×50 DNA的纯度=A0/A20≥1.8
⚫ 紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度
●基因文库的构建 将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬 菌体载体上,便构成了该生物的基因文库。 嚣亳當
⚫ 基因文库的构建 将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬 菌体载体上，便构成了该生物的基因文库
反转录人工合成互补DNA 构建基因文库获取目的 基因存在的问题 DNA转录为RNA 费时费萝 RNA内含子的去除 内含子序列 ↓RNA为模板逆转录为DNA >反转录人工合成互补 DNA方法的优势 逆转录完成 获取的DNA片段往往是具有 特定功能的目的基因 以DNA为模板合成双链DNA 形成不含内含子的双链DNA
反转录人工合成互补DNA ➢ 构建基因文库获取目的 基因存在的问题—— 费时费事 内含子序列 ➢ 反转录人工合成互补 DNA方法的优势—— 获取的DNA片段往往是具有 特定功能的目的基因
聚合酶链式反应(PCR) ●PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量 扩增(包括分离)一段目的基因的技术。 加入4种物质 (1)作为模板的DNA序列; (2)与被分离的目的基因两条链各自5端序列相互补的 DNA引物(20个左右碱基的短DNA单链); (3) TaqDNA聚合酶; (4)dNTP (dATP, dTTP, dGTPTAdCTP) 9++ DNA模板4种核苷酸 引 DNA聚合酶
聚合酶链式反应（PCR） ⚫ PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量 扩增（包括分离）一段目的基因的技术。 ⚫ 加入4种物质： （1）作为模板的DNA序列； （2）与被分离的目的基因两条链 各自5’端序列相互补的 DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）； （3）TaqDNA聚合酶； （4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）
聚合酶链式反应(PCR) ●变性、退火、延伸 三步曲 十》% 上°0 引物 变性:双链DNA解链 模板4种核苷酸 DNA聚合酶 成为单链DNA 95c 退火:部分引物与 55°c 模板的单链DNA的特 定互补部位相配对 72°c 和结合 延伸:以目的基因 为模板,合成互补 的新DNA链 IIIIIIIIIIIIIII
聚合酶链式反应（PCR） ⚫变性、退火、延伸 三步曲 ➢变性：双链DNA解链 成为单链DNA ➢退火：部分引物与 模板的单链DNA的特 定互补部位相配对 和结合 ➢延伸：以目的基因 为模板，合成互补 的新DNA链