第一章蛋白质化学 第一章蛋白质化学 蛋白质( Protein)是生物体的基本组成成份。蛋白质英文一词“ protein”,是 荷兰化学家 Mulder首先使用的,来自于希腊语“ protos”意为“第一”和“最 重要的”。在机体内蛋白质的含量很多,约占机体固体成分的45%,它的分布 很广,几乎所有的器官组织都含蛋白质,并且它又与所有的生命活动密切联 第一节概述 、蛋白质的生物学意义 酶的催化作用,已知酶有2000多种 2.运输和储藏作用 3.激素的调节作用,肽类和氨基酸类、蛋白类 4.运动功能,肌肉收缩: 5.结构成分和机械支持物,胶原蛋白和弹性蛋白 6.免疫功能,抗体(免疫球蛋白); 7.构成生物膜,体现膜功能,膜蛋白、载体、受体 8.毒素的强调节作用,毒蛋白 9.与动物生长生殖相关,蛋白质有功能大分子之称。 、蛋白质的分类 蛋白质的种类繁多,结构复杂,迄今为止没有一个理想的分类方法。着 眼的侧面不同,分类也就不同,例如从蛋白质形状上,可将它们分为球状蛋 白质及纤维状蛋白质:从组成上可分为单纯蛋白质(分子中只含氨基酸残基) 及结合蛋白质(分子中除氨基酸外还有非氨基酸物质,后者称辅基):单纯蛋白 质又可根据理化性质及来源分为清蛋白(又名白蛋白, albumin)、球蛋白 ( globulin)、谷蛋白( glutelin)、醇溶谷蛋白( prolamine)、精蛋白( protamine)、组 蛋白( histone)、硬蛋白( scleroprotein)等。结合蛋白又可按其辅基的不同分为核 蛋白( nucleoprotein)、磷蛋白( phosphoprotein)、金属蛋白( metalloprotein)、色蛋 白( chromoprotein)等 此外,还可以按蛋白质的功能将其分为活性蛋白质(如酶、激素蛋白质、 运输和贮存蛋白质、运动蛋白质、受体蛋白质、膜蛋白质等)和非活性蛋白质(如 胶原、角蛋白等)两大类。 三种方法 ①.根据组成 简单蛋白一一蛋白质完全由AA组成。Eg.核糖核酸酶、胰岛素 结合蛋白一一除了蛋白质部分外,还有非蛋白质成分(辅基、配基) eg血红蛋白、核蛋白 ②.根据分子的形状 球状蛋白质一一分子对称性佳,外形接近球状或椭球状,溶解度较好
第一章 蛋白质化学 1 第一章 蛋白质化学 蛋白质(Protein)是生物体的基本组成成份。蛋白质英文一词“protein”，是 荷兰化学家 Mulder 首先使用的，来自于希腊语“protos”意为“第一”和“最 重要的”。在机体内蛋白质的含量很多，约占机体固体成分的 45%，它的分布 很广，几乎所有的器官组织都含蛋白质，并且它又与所有的生命活动密切联 系。 第一节 概 述 一、蛋白质的生物学意义 1. 酶的催化作用，已知酶有 2000 多种； 2. 运输和储藏作用； 3. 激素的调节作用，肽类和氨基酸类、蛋白类； 4. 运动功能，肌肉收缩； 5. 结构成分和机械支持物，胶原蛋白和弹性蛋白； 6. 免疫功能，抗体（免疫球蛋白）； 7. 构成生物膜，体现膜功能，膜蛋白、载体、受体； 8. 毒素的强调节作用，毒蛋白； 9. 与动物生长生殖相关，蛋白质有功能大分子之称。 二、蛋白质的分类 蛋白质的种类繁多，结构复杂，迄今为止没有一个理想的分类方法。着 眼的侧面不同，分类也就不同，例如从蛋白质形状上，可将它们分为球状蛋 白质及纤维状蛋白质；从组成上可分为单纯蛋白质(分子中只含氨基酸残基) 及结合蛋白质(分子中除氨基酸外还有非氨基酸物质，后者称辅基)；单纯蛋白 质又可根据理化性质及来源分为清蛋白(又名白蛋白，albumin)、球蛋白 (globulin)、谷蛋白(glutelin)、醇溶谷蛋白(prolamine)、精蛋白(protamine)、组 蛋白(histone)、硬蛋白(scleroprotein)等。结合蛋白又可按其辅基的不同分为核 蛋白(nucleoprotein)、磷蛋白(phosphoprotein)、金属蛋白(metalloprotein)、色蛋 白(chromoprotein)等。 此外，还可以按蛋白质的功能将其分为活性蛋白质(如酶、激素蛋白质、 运输和贮存蛋白质、运动蛋白质、受体蛋白质、膜蛋白质等)和非活性蛋白质(如 胶原、角蛋白等)两大类。 三种方法 ①．根据组成 简单蛋白――蛋白质完全由 AA 组成。Eg．核糖核酸酶、胰岛素 结合蛋白――除了蛋白质部分外，还有非蛋白质成分（辅基、配基） eg.血红蛋白、核蛋白 ②．根据分子的形状 球状蛋白质――分子对称性佳，外形接近球状或椭球状，溶解度较好
第一章蛋白质化学 能结晶。Eg血红蛋白、血清球蛋白。 纤维状蛋白质一一对称性差,分子类似细棒或纤维 可溶性纤维状蛋白质一一肌球蛋白 不溶性纤维状蛋白质一一胶原、弹性蛋白。 ③.根据功能分类 酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白质,结构蛋白质、防御蛋白质、运动蛋 表:简单蛋白质的分类 1.清蛋白( albumin):溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液。为饱和硫酸铵 所沉淀。广泛存在于生物体内,如血清清蛋白、乳清蛋白等。 2.球蛋白( globulin):为半饱和硫酸铵所沉淀。不溶于水而溶于稀盐溶 液的称拟球蛋白( euglobulin);溶于水的称拟球蛋白( pseudoglobulin)普遍 存在于生物体内,如血清球蛋白、肌球蛋白和植物种子球蛋白等。 3.谷蛋白( glutelin):不溶于水、醇及中性盐溶液,但易溶于稀酸或稀碱 如米谷蛋白( oryzenin)和麦谷蛋白( glutenin)等。 4.醇溶谷蛋白( prolamine):不溶于水及无水乙醇,但溶于70-80%乙醇 中。其特点是脯氨酸和酰胺较多,非极性侧链远较极性侧链多。这类蛋白质 主要存在于植物种子中。如玉米醇溶蛋白(zein)、麦醇溶蛋白( gliadin)等 5.组蛋白( histone):溶于水及稀酸,但为稀氨水所沉淀。分子中组氨酸、 赖氨酸较多,分子呈碱性。如小牛胸腺组蛋白等 6.鱼精蛋白( protamine):溶于水及稀酸,不溶于氨水。分子呈碱性。如 鲑精蛋白( salmin)等。 7.硬蛋白( scleroprotein):不溶于水、盐、稀酸或稀碱。这类蛋白是动 物体内作为结缔及保护功能的蛋白质。例如,角蛋白( keratin)、胶原( collagen) 网硬蛋白( reticulin)和弹性蛋白( elastin)等 表:结合蛋白质的分类 核蛋白( nucleoprotein):辅基是核酸,如脱氧核糖核蛋白、核糖体、 烟草花叶病毒等 2.脂蛋白( lipoprotein):与脂质结合的蛋白质。脂质成分有磷脂、固醇 和中性脂等。如血中的β1一脂蛋白。卵黄球蛋白( lipovitellin)等 3.糖蛋白( glycoprotein)和粘蛋白( mucoprotein)辅基成分为半乳糖、 甘露糖、己糖胺、己糖醛酸、唾液酸、硫酸或磷酸等。如卵清蛋白、γ -球蛋白,血清类粘蛋白( seromucoid)等 4.磷蛋白( phosphoprotein):磷酸基通过酯键与蛋白质中的丝氨酸或苏 氨酸残基侧链相连。如酪蛋白胃蛋白酶等 5.血红素蛋白( hemoprotein):辅基为血红素,它是卟啉类化合物,卟啉 环中心含有金属。含铁的如血红蛋白、细胞色素c,含的有叶绿蛋白,含铜的
第一章 蛋白质化学 2 能结晶。Eg.血红蛋白、血清球蛋白。 纤维状蛋白质――对称性差，分子类似细棒或纤维 可溶性纤维状蛋白质――肌球蛋白。 不溶性纤维状蛋白质――胶原、弹性蛋白。 ③．根据功能分类 酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白质，结构蛋白质、防御蛋白质、运动蛋 白质。 表：简单蛋白质的分类 1． 清蛋白（albumin）：溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液。为饱和硫酸铵 所沉淀。广泛存在于生物体内，如血清清蛋白、乳清蛋白等。 2． 球蛋白（globulin）:为半饱和硫酸铵所沉淀。不溶于水而溶于稀盐溶 液的称拟球蛋白（euglobulin）;溶于水的称拟球蛋白（pseudoglobulin）.普遍 存在于生物体内，如血清球蛋白、肌球蛋白和植物种子球蛋白等。 3．谷蛋白（glutelin）:不溶于水、醇及中性盐溶液，但易溶于稀酸或稀碱。 如米谷蛋白（oryzenin）和麦谷蛋白（glutanin）等。 4．醇溶谷蛋白（prolamine）:不溶于水及无水乙醇，但溶于 70-80%乙醇 中。其特点是脯氨酸和酰胺较多，非极性侧链远较极性侧链多。这类蛋白质 主要存在于植物种子中。如玉米醇溶蛋白（zein）、麦醇溶蛋白（gliadin）等。 5．组蛋白（histone）:溶于水及稀酸，但为稀氨水所沉淀。分子中组氨酸、 赖氨酸较多，分子呈碱性。如小牛胸腺组蛋白等。 6．鱼精蛋白（protamine）:溶于水及稀酸，不溶于氨水。分子呈碱性。如 鲑精蛋白（salmin）等。 7．硬蛋白（scleroprotain）:不溶于水、盐、稀酸或稀碱。这类蛋白是动 物体内作为结缔及保护功能的蛋白质。例如，角蛋白（keratin）、胶原（collagen）、 网硬蛋白（reticulin）和弹性蛋白（elastin）等。 表：结合蛋白质的分类 1．核蛋白（nucleoprotain）：辅基是核酸，如脱氧核糖核蛋白、核糖体、 烟草花叶病毒等。 2．脂蛋白（lipoprotain）:与脂质结合的蛋白质。脂质成分有磷脂、固醇 和中性脂等。如血中的β1－脂蛋白。卵黄球蛋白（lipovitellin）等。 3．糖蛋白（glycoprotein）和粘蛋白（mucoprotein）:辅基成分为半乳糖、 甘露糖、己糖胺、己糖醛酸、唾液酸、硫酸或磷酸等。如卵清蛋白、γ -球蛋白，血清类粘蛋白（seromucoid）等。 4．磷蛋白（phosphoprotein）：磷酸基通过酯键与蛋白质中的丝氨酸或苏 氨酸残基侧链相连。如酪蛋白胃蛋白酶等。 5．血红素蛋白（hemoprotein）:辅基为血红素，它是卟啉类化合物，卟啉 环中心含有金属。含铁的如血红蛋白、细胞色素 c，含的有叶绿蛋白，含铜的
第一章蛋白质化学 有血蓝蛋白( Hemocyanin)等。 6.黄素蛋白( flavoprotein):辅基为黄素嘌呤二核苷酸。如琥珀酸脱氢 D氨基酸氧化酶等 7.金属蛋白( metalloprotein):与金属直接结合的蛋白质。如铁蛋白 ferritin) 含铁,乙醇脱氢酶含锌,黄嘌呤氧化酶含钼和铁等。 、蛋白质的化学组成 1元素组成 C、H、O、N、S、P、Fe C:50%H:7%O:23%N:16%S:0-3%其他:微量 P:牛奶中的酪蛋白含磷;Fe:血中的血红蛋白含铁:I:甲状腺中甲状腺 球蛋白含碘。 2.蛋白质的平均含N量16% 凯氏定氮的基础 蛋白质含量=蛋白N×1/16%=蛋白N×625 3.蛋白质由20种L一型、a一AA组成的长链分子 四、蛋白质的大小与分子量 蛋白质是分子量很大的生物分子 均一的蛋白质 它的所有分子在AA的组成和顺序以及肽链的长度方面是相同的 2.寡聚蛋白质 某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过非共价结合而 成的 特点:a可解离成亚基,但相当稳定;b.可以结晶的形式从组织中分离 c.有此蛋白质以寡聚蛋白质表现其活性的 3.简单蛋白质AA残基数目的估算。 AA残基的数目=蛋白分子量/110 因为,AA残基的平均分子量=128-18=110。 第二节氨基酸 、氨基酸的结构 蛋白质可以受酸、碱或酶的作用而水解。例如,一种单纯蛋白质用6N盐 酸在真空下110℃水解约16小时,可达到完全水解(酸水解的条件下,色氨酸 酪氨酸易被破坏)。利用层析等手段分析水解液,就可证明组成蛋白质分子的 基本单位是氨基酸。构成天然蛋白质的氨基酸共20种。 这些氨基酸为La-氨基酸(L-a- amino acid),其结构通式如下: N R
第一章 蛋白质化学 3 有血蓝蛋白（Hemocyanin）等。 6．黄素蛋白（flavoprotein）:辅基为黄素嘌呤二核苷酸。如琥珀酸脱氢、 D-氨基酸氧化酶等。 7．金属蛋白（metalloprotein）:与金属直接结合的蛋白质。如铁蛋白（ferritin） 含铁，乙醇脱氢酶含锌，黄嘌呤氧化酶含钼和铁等。 三、蛋白质的化学组成 1.元素组成： C、H、O、N、S、P、Fe C：50% H：7% O：23% N：16% S：0－3% 其他：微量 P：牛奶中的酪蛋白含磷；Fe:血中的血红蛋白含铁；I：甲状腺中甲状腺 球蛋白含碘。 2．蛋白质的平均含 N 量 16% 凯氏定氮的基础 蛋白质含量＝蛋白 N×1/16%=蛋白 N×6.25 3．蛋白质由 20 种 L－型、α－AA 组成的长链分子 四、蛋白质的大小与分子量 蛋白质是分子量很大的生物分子 1．均一的蛋白质 它的所有分子在 AA 的组成和顺序以及肽链的长度方面是相同的 2．寡聚蛋白质 某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基（多肽链）通过非共价结合而 成的。 特点：a.可解离成亚基，但相当稳定；b.可以结晶的形式从组织中分离； c. 有此蛋白质以寡聚蛋白质表现其活性的。 3． 简单蛋白质 AA 残基数目的估算。 AA 残基的数目＝蛋白分子量/110 因为，AA 残基的平均分子量＝128－18＝110。 第二节 氨 基 酸 一、氨基酸的结构 蛋白质可以受酸、碱或酶的作用而水解。例如，一种单纯蛋白质用 6N 盐 酸在真空下 110℃水解约 16 小时，可达到完全水解(酸水解的条件下，色氨酸、 酪氨酸易被破坏)。利用层析等手段分析水解液，就可证明组成蛋白质分子的 基本单位是氨基酸。构成天然蛋白质的氨基酸共 20 种。 这些氨基酸为 L-α-氨基酸(L-α-amino acid)，其结构通式如下：
第一章蛋白质化学 生物界中也发现一些D系氨基酸,主要存在于某些抗菌素以及个别植物 的 生物碱中。 、氨基酸的分类 组成蛋白质的氨基酸按其a-碳原子上侧链R的结构分为20种,20种氨 基酸按R的结构和极性的不同有以下两种分类方法。 )根据R的结构不同分类 Nonpolar, aliphatic H n ar, unchanged R HN-C-H HN-C-H HN-C-H Glyeine Cysteine Methionine Isoleucine Proline Glutamine Negatively charged R group Arumat Coo H-c-H HNC-l IH N-CH HN-C-H Aspartate (二)根据侧链R的极性不同分为非极性和极性氨基酸 氨基酸的R基团不带电荷或极性极微弱的属于非极性R基氨基酸,如: 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、 脯氨酸。它们的R基团具有疏水性 氨基酸的R基团带电荷或有极性的属于极性氨基酸,它们又可分为: (1)极性R基氨基酸:R基团有极性,但不解离,或仅极弱地解离,它们 的R基团有亲水性。如:丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、 天门冬酰胺 (2)酸性R基氨基酸:R基团有极性,且解离,在中性溶液中显酸性,亲 水性强。如天门冬氨酸、谷氨酸。 3)碱性R基氨基酸:R基团有极性,且解离,在中性溶液中显碱性,亲 水性强。如组氨酸、赖氨酸、精氨酸。 (三)稀有氨基酸(P128) (四)非蛋白氨基酸(P129)
第一章 蛋白质化学 4 生物界中也发现一些 D 系氨基酸，主要存在于某些抗菌素以及个别植物 的生物碱中。 二、氨基酸的分类 组成蛋白质的氨基酸按其α-碳原子上侧链 R 的结构分为 20 种，20 种氨 基酸按 R 的结构和极性的不同有以下两种分类方法。 (一)根据 R 的结构不同分类 (二)根据侧链 R 的极性不同分为非极性和极性氨基酸 氨基酸的 R 基团不带电荷或极性极微弱的属于非极性 R 基氨基酸，如： 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、 脯氨酸。它们的 R 基团具有疏水性。 氨基酸的 R 基团带电荷或有极性的属于极性氨基酸，它们又可分为： (1)极性 R 基氨基酸：R 基团有极性，但不解离，或仅极弱地解离，它们 的 R 基团有亲水性。如：丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、 天门冬酰胺。 (2)酸性 R 基氨基酸：R 基团有极性，且解离，在中性溶液中显酸性，亲 水性强。如天门冬氨酸、谷氨酸。 (3)碱性 R 基氨基酸：R 基团有极性，且解离，在中性溶液中显碱性，亲 水性强。如组氨酸、赖氨酸、精氨酸。 （三）稀有氨基酸(P128) （四）非蛋白氨基酸(P129)
第一章蛋白质化学 、氨基酸的重要性质 (一)、物理性质 形态:均为白色结晶或粉末,不同氨基酸的晶型结构不同。 2.溶解性:一般都溶于水,不溶或微溶于醇,不溶于丙酮,在稀酸和 稀碱中溶解性好 3.熔点:氨基酸的熔点一般都比较高,一般都大于200℃,超过熔点以 上氨基酸分解产生胺和二氧化碳 4.光吸收:氨基酸在可见光范围内无光吸收,在近紫外区含苯环氨基 酸有光的吸收。 5.旋光性:除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性。 6.一般都溶于水(除胱AA和酪AA)脯AA和羟脯AA还能溶于乙醇或 乙醚中 (二)、化学性质 氨基酸的两性电离及等电点 氨基酸既含有氨基,可接受H,又含有羧基,可电离出H,所以氨基酸 具有酸碱两性性质。通常情况下,氨基酸以两性离子的形式存在,如下图所 氨基酸在酸性环境中,主要以阳离子的形式存在,在碱性环境中,主要 以阴离子的形式存在。在某一pH环境下,以两性离子(兼性离子)的形式存 在。该pH称为该氨基酸的等电点。所以氨基酸的等电点可以定义为:氨基酸 所带正负电荷相等时的溶液pH 氨基酸的水溶液既可被酸滴定,又可被碱滴定,应该具有两性电离的 性质,现以甘氨酸为例来说明氨基酸两性电离的特点。下图是甘氨酸的电离 酸碱滴定曲线,从左向右是用NaOH滴定的曲线,溶液的pH由小到大逐渐升 高;从右向左是用HCL滴定的曲线,溶液的pH由大到小逐渐降低。曲线中 从左向右第一个拐点是氨基酸羧基解离50%的状态,第二个拐点是氨基酸的 等电点,第三个拐点是氨基酸氨基解离50%的状态
第一章 蛋白质化学 5 三、氨基酸的重要性质 （一）、物理性质 1． 形态：均为白色结晶或粉末，不同氨基酸的晶型结构不同。 2． 溶解性：一般都溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于丙酮，在稀酸和 稀碱中溶解性好。 3． 熔点：氨基酸的熔点一般都比较高，一般都大于 200℃，超过熔点以 上氨基酸分解产生胺和二氧化碳。 4． 光吸收：氨基酸在可见光范围内无光吸收，在近紫外区含苯环氨基 酸有光的吸收。 5． 旋光性：除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性。 6. 一般都溶于水（除胱 AA 和酪 AA）脯 AA 和羟脯 AA 还能溶于乙醇或 乙醚中 （二）、化学性质： 1． 氨基酸的两性电离及等电点： 氨基酸既含有氨基，可接受 H+，又含有羧基，可电离出 H+，所以氨基酸 具有酸碱两性性质。通常情况下，氨基酸以两性离子的形式存在，如下图所 示： 氨基酸在酸性环境中，主要以阳离子的形式存在，在碱性环境中，主要 以阴离子的形式存在。在某一 pH 环境下，以两性离子（兼性离子）的形式存 在。该 pH 称为该氨基酸的等电点。所以氨基酸的等电点可以定义为：氨基酸 所带正负电荷相等时的溶液 pH。 氨基酸的水溶液既可被酸滴定，又可被碱滴定，应该具有两性电离的 性质，现以甘氨酸为例来说明氨基酸两性电离的特点。下图是甘氨酸的电离 酸碱滴定曲线，从左向右是用 NaOH 滴定的曲线，溶液的 pH 由小到大逐渐升 高；从右向左是用 HCL 滴定的曲线，溶液的 pH 由大到小逐渐降低。曲线中 从左向右第一个拐点是氨基酸羧基解离 50%的状态，第二个拐点是氨基酸的 等电点，第三个拐点是氨基酸氨基解离 50%的状态
第一章蛋白质化学 通过氨基酸的滴定曲线,可用下列 Henderson- Hasselbalch方程求出各解 离基团的解离常数(pK,): pH= pk+ log 根据pK,可求出氨基酸的等电点,可由其等电点左右两个pK,值的算术 平均值求出。 中性及酸性氨基酸:pl=(pK1,+pK2,)2 中性氨基酸:pK1,为a一羧基的碱性氨基酸: pl=(pK2,+pK3,)2解离常数,pK2,为a一氨基的解离常数 酸性氨基酸:pK1,为a一羧基的解离常数,pK2,为侧链羧基的解离常数。 2由a氨基参加的反应: (1)亚硝酸反应:放出氮气,氮气的一半来自氨基氮,一半来自亚硝酸, 在通常情况下测定生成的氮气的体积量可计算氨基酸的量,此反应可用于测 定蛋白质的水解程度。 (2)与甲醛的反应:用过量的中性甲醛与氨基酸反应,可游离出氢离子, 然后用NaOH滴定,从消耗的碱量可以计算出氨基酸的含量。此法称为间接 滴定法 (3)与2,4-二硝基氟苯(2,4-DNFB)的反应( Sanger反应):生成 黄色的二硝基苯一氨基酸衍生物。 (4)与苯异硫氰酸酯(PITC)反应( Edman反应):生成苯乙内酰硫脲 氨基酸。 (5)与丹磺酰氯(DNS-Cl)的反应:生成荧光物质DNS一氨基酸 (4)(5)反应用于蛋白质的N一末端的测定。 3.a-羧基参加的反应 (1)与碱反应成盐 (2)与醇反应成酯: 4a-氨基与a-羧基共同参加的反应 与茚三酮的反应:除脯氨酸与羟脯氨酸外,可与其它氨基酸生成蓝紫色 化合物;脯氨酸与羟脯氨酸为黄色化合物 5侧链反应(颜色反应) (1)Mln反应:检测Tyr或含Tyr的蛋白质的反应 Millon试剂:汞的硝酸盐与亚硝酸盐溶液。产物:红色的化合物。 (2) Folin反应:检测Tyr或含Tr的蛋白质的反应 Foin试剂:磷钼酸、磷钨酸混合溶液。产物:蓝色的钼蓝、钨蓝。 (3)坂口反应:检测Arg或含Arg的蛋白质的反应 坂口试剂:α一萘酚的碱性次溴酸钠溶液。产物:砖红色的沉淀 (4) Pauly反应:检测His、Tyr及含His、Tr蛋白质的反应
第一章 蛋白质化学 6 通过氨基酸的滴定曲线，可用下列 Henderson—Hasselbalch 方程求出各解 离基团的解离常数（pK，）： 根据 pK，可求出氨基酸的等电点，可由其等电点左右两个 pK，值的算术 平均值求出。 中性及酸性氨基酸：pI=(pK1，+pK2，)/2 中性氨基酸：pK1，为α—羧基的碱性氨基酸： pI=(pK2，+pK3，)/2 解离常数，pK2，为α—氨基的解离常数。 酸性氨基酸： pK1，为α—羧基的解离常数，pK2，为侧链羧基的解离常数。 2.由α-氨基参加的反应： （1）亚硝酸反应：放出氮气，氮气的一半来自氨基氮，一半来自亚硝酸， 在通常情况下测定生成的氮气的体积量可计算氨基酸的量，此反应可用于测 定蛋白质的水解程度。 （2）与甲醛的反应：用过量的中性甲醛与氨基酸反应，可游离出氢离子， 然后用 NaOH 滴定，从消耗的碱量可以计算出氨基酸的含量。此法称为间接 滴定法。 （3）与 2，4—二硝基氟苯（2，4—DNFB）的反应（Sanger 反应）：生成 黄色的二硝基苯—氨基酸衍生物。 （4）与苯异硫氰酸酯（PITC）反应（Edman 反应）：生成苯乙内酰硫脲 —氨基酸。 （5）与丹磺酰氯（DNS—Cl）的反应：生成荧光物质 DNS—氨基酸。 （4）（5）反应用于蛋白质的 N—末端的测定。 3.α-羧基参加的反应： （1）与碱反应成盐： （2）与醇反应成酯： 4.α-氨基与α-羧基共同参加的反应 与茚三酮的反应：除脯氨酸与羟脯氨酸外，可与其它氨基酸生成蓝紫色 化合物；脯氨酸与羟脯氨酸为黄色化合物。 5.侧链反应（颜色反应）： （1）Millon 反应：检测 Tyr 或含 Tyr 的蛋白质的反应。 Millon 试剂：汞的硝酸盐与亚硝酸盐溶液。产物：红色的化合物。 （2）Folin 反应：检测 Tyr 或含 Tyr 的蛋白质的反应。 Folin 试剂：磷钼酸、磷钨酸混合溶液。产物：蓝色的钼蓝、钨蓝。 （3）坂口反应：检测 Arg 或含 Arg 的蛋白质的反应。 坂口试剂：α—萘酚的碱性次溴酸钠溶液。产物：砖红色的沉淀。 （4）Pauly 反应：检测 His、Tyr 及含 His、Tyr 蛋白质的反应
第一章蛋白质化学 试剂:对氨基苯磺酸盐酸溶液、亚硝酸钠、碳酸钠混合溶液。 产物:橘红色的化合物。 (5)乙醛酸的反应:检测Tp或含Tp蛋白质的反应 当Trp与乙醛酸和浓硫酸在试管中叠加时,产生分层现象,界面出现紫色环 (6)Cys的反应:Cys或含Cys蛋白质与亚硝基亚铁氰酸钠在稀氨的溶 液中,产生一种红色的化合物。 第三节蛋白质的结构及其功能 蛋白质为生物高分子物质之一,具有三维空间结构,因而能执 行复杂的生物学功能。蛋白质结构与功能之间的关系非常密切。在 研究中,一般将蛋白质分子的结构分为一级结构与空间结构两类。 每一种天然的蛋白质都有自己特有的空间结构称蛋白质的构 象 肽键就是一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基脱水 缩合形成的键 肽:一个氨基酸的羧基α一羧基和另一个氨基酸分子的a一氨 基缩合失去一分子水从而形成肽,氨基酸之间通过肽键联结起来的 化合物称为肽( peptide)两个氨基酸形成的肽叫二肽,三个氨基酸形 成的肽叫三肽……,十个氨基酸形成的肽叫十肽,一般将十肽以下 称为寡肽( oligopeptide),以上者称多肽( polypeptide)或称多肽链。 组成多肽链的氨基酸在相互结合时,失去了一分子水,因此把 多肽中的氨基酸单位称为氨基酸残基( amino acid residue) 多肽链的书写与名称 在多肽链中,肽链的一端保留着一个α一氨基,另一端保留一 个α一羧基,带α一氨基的末端称氨基末端(N端):带α一羧基的末 端称羧基末端(C端)。肽链书写:一般丛N末端向C末端书写,书 写多肽链时可用略号,N端写于左侧,用H做标帜,C端于右侧用 OH表示。肽详细命名时为某某酰某某酰……某某酸 如上图中的多肽链中文名称为:苏氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮 氨酸;中文名称缩写为:苏一甘一酪一丙 英文三字母表示为 ThyG·Tyr:Ala:Leu;英文单字母表示为:T·G·Y·A·L 有一个例外,谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三个氨
第一章 蛋白质化学 7 试剂：对氨基苯磺酸盐酸溶液、亚硝酸钠、碳酸钠混合溶液。 产物：橘红色的化合物。 （5）乙醛酸的反应：检测 Trp 或含 Trp 蛋白质的反应。 当 Trp 与乙醛酸和浓硫酸在试管中叠加时，产生分层现象，界面出现紫色环。 （6）Cys 的反应：Cys 或含 Cys 蛋白质与亚硝基亚铁氰酸钠在稀氨的溶 液中，产生一种红色的化合物。 第三节 蛋白质的结构及其功能 蛋白质为生物高分子物质之一，具有三维空间结构，因而能执 行复杂的生物学功能。蛋白质结构与功能之间的关系非常密切。在 研究中，一般将蛋白质分子的结构分为一级结构与空间结构两类。 每一种天然的蛋白质都有自己特有的空间结构称蛋白质的构 象。 一、肽 肽键就是一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基脱水 缩合形成的键 肽：一个氨基酸的羧基α—羧基和另一个氨基酸分子的α—氨 基缩合失去一分子水从而形成肽，氨基酸之间通过肽键联结起来的 化合物称为肽(peptide)。两个氨基酸形成的肽叫二肽，三个氨基酸形 成的肽叫三肽……，十个氨基酸形成的肽叫十肽，一般将十肽以下 称为寡肽(oligopeptide)，以上者称多肽(polypeptide)或称多肽链。 组成多肽链的氨基酸在相互结合时，失去了一分子水，因此把 多肽中的氨基酸单位称为氨基酸残基(amino acid residue)。 多肽链的书写与名称 在多肽链中，肽链的一端保留着一个α－氨基，另一端保留一 个α－羧基，带α－氨基的末端称氨基末端(N 端)；带α－羧基的末 端称羧基末端(C 端)。肽链书写：一般丛 N 末端向 C 末端书写，书 写多肽链时可用略号，N 端写于左侧，用 H 做标帜，C 端于右侧用 OH 表示。肽详细命名时为某某酰某某酰……某某酸。 如上图中的多肽链中文名称为：苏氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮 氨酸；中文名称缩写为：苏—甘—酪—丙—亮；英文三字母表示为： Thy·Gly·Tyr·Ala·Leu；英文单字母表示为：T·G·Y·A·L。 有一个例外，谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三个氨
第一章蛋白质化学 基酸所组成的三肽,全名是γ一谷氨酰半胱氨酰甘氨酸,简称谷胱 甘肽( glutathione,简写GSH)。其中N末端的谷氨酸是通过y一羧基 与半胱氨酸的氨基相连。 、蛋白质的一级结构 蛋白质的一级结构( primary structure)就是蛋白质多肽链中氨基酸残基的 排列顺序( sequence),也是蛋白质最基本的结构。它是由基因上遗传密码的排 列顺序所决定的。各种氨基酸按遗传密码的顺序,通过肽键连接起来,成为 多肽链,故肽键是蛋白质结构中的主键。迄今已有约1000种左右蛋白质的一 级结构被研究确定,如胰岛素,胰核糖核酸酶、胰蛋白酶等 蛋白质的一级结构决定了蛋白质的二级、三级等高级结构,成百亿的天 然蛋白质各有其特殊的生物学活性,决定每一种蛋白质的生物学活性的结构 特点,首先在于其肽链的氨基酸序列,由于组成蛋白质的20种氨基酸各具特 殊的侧链,侧链基团的理化性质和空间排布各不相同,当它们按照不同的序 列关系组合时,就可形成多种多样的空间结构和不同生物学活性的蛋白质分 、蛋白质的空间结构 蛋白质分子的多肽链并非呈线形伸展,而是折叠和盘曲构成特有的比较 稳定的空间结构。蛋白质的生物学活性和理化性质主要决定于空间结构的完 整,因此仅仅测定蛋白质分子的氨基酸组成和它们的排列顺序并不能完全了 解蛋白质分子的生物学活性和理化性质。例如球状蛋白质(多见于血浆中的白 蛋白、球蛋白、血红蛋白和酶等)和纤维状蛋白质(角蛋白、胶原蛋白、肌凝蛋 白、纤维蛋白等),前者溶于水,后者不溶于水,显而易见,此种性质不能仅 用蛋白质的一级结构的氨基酸排列顺序来解释 蛋白质的空间结构就是指蛋白质的二级、三级和四级结构。如下图: structure structure Amino neid residue a helix Polypeptide chain Assembled subunits ()蛋白质的二级结构 蛋白质的二级结构 secondary structure)是指多肽链中主链原子的局部空间 排布即构象,不涉及侧链部分的构象。 1肽键平面(或称酰胺平面, amide plane)。 Pauling等人对一些简单的肽及 氨基酸的酰胺等进行了X线衍射分析,得出下图所示结构:
第一章 蛋白质化学 8 基酸所组成的三肽，全名是γ－谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，简称谷胱 甘肽(glutachione,简写 GSH)。其中 N 末端的谷氨酸是通过γ－羧基 与半胱氨酸的氨基相连。 二、蛋白质的一级结构 蛋白质的一级结构(primary structure)就是蛋白质多肽链中氨基酸残基的 排列顺序(sequence)，也是蛋白质最基本的结构。它是由基因上遗传密码的排 列顺序所决定的。各种氨基酸按遗传密码的顺序，通过肽键连接起来，成为 多肽链，故肽键是蛋白质结构中的主键。迄今已有约 1000 种左右蛋白质的一 级结构被研究确定，如胰岛素，胰核糖核酸酶、胰蛋白酶等。 蛋白质的一级结构决定了蛋白质的二级、三级等高级结构，成百亿的天 然蛋白质各有其特殊的生物学活性，决定每一种蛋白质的生物学活性的结构 特点，首先在于其肽链的氨基酸序列，由于组成蛋白质的 20 种氨基酸各具特 殊的侧链，侧链基团的理化性质和空间排布各不相同，当它们按照不同的序 列关系组合时，就可形成多种多样的空间结构和不同生物学活性的蛋白质分 子。 三、蛋白质的空间结构 蛋白质分子的多肽链并非呈线形伸展，而是折叠和盘曲构成特有的比较 稳定的空间结构。蛋白质的生物学活性和理化性质主要决定于空间结构的完 整，因此仅仅测定蛋白质分子的氨基酸组成和它们的排列顺序并不能完全了 解蛋白质分子的生物学活性和理化性质。例如球状蛋白质(多见于血浆中的白 蛋白、球蛋白、血红蛋白和酶等)和纤维状蛋白质(角蛋白、胶原蛋白、肌凝蛋 白、纤维蛋白等)，前者溶于水，后者不溶于水，显而易见，此种性质不能仅 用蛋白质的一级结构的氨基酸排列顺序来解释。 蛋白质的空间结构就是指蛋白质的二级、三级和四级结构。如下图： (一)蛋白质的二级结构 蛋白质的二级结构(secondary structure)是指多肽链中主链原子的局部空间 排布即构象，不涉及侧链部分的构象。 1.肽键平面(或称酰胺平面，amide plane)。Pauling 等人对一些简单的肽及 氨基酸的酰胺等进行了 X 线衍射分析，得出下图所示结构：
第一章蛋白质化学 是 (1)肽键中的CN键长0.132m,比相邻的NC单键(0147nm)短,而较 般C=N双键(0.128m)长,可见,肽键中-CN-键的性质介于单、双键之间, 具有部分双键的性质,因而不能旋转,这就将固定在一个平面之内。 (2)肽键的C及N周围三个键角之和均为360°,说明都处于一个平面上, 也就是说六个原子(Ca- Co-NH--Ca-)基本上同处于一个平面,这就是 肽键平面。肽链中能够旋转的只有α碳原子所形成的单键,此单键的旋转决 定两个肽键平面的位置关系,于是肽键平面成为肽链盘曲折叠的基本单位。 (3)肽键中的CN既具有双键性质,就会有顺反不同的立体异构,已证实 O和NH处于反位 2蛋白质主链构象的结构单元 1)a-螺旋 Pauling等人对a一角蛋白(a- keratin进行了X线衍射分析,从衍射图中 看到有0.5~0.55mm的重复单位,故推测蛋白质分子中有重复性结构,并认为 这种重复性结构为a一螺旋(a- helix)见下图 OR group 42 o e (3.6 residues). G 4 a-螺旋的纬构特点如下: (1)多个肽键平面通过α一碳原子旋转,相互之间紧密盘曲成稳 固的右手螺旋。 (2)主链呈螺旋上升,每36个氨基酸残基上升一圈,相当于 0.54nm,这与Ⅹ线衍射图符合
第一章 蛋白质化学 9 (1)肽键中的 C-N 键长 0.132nm，比相邻的 N-C 单键(0.147nm)短，而较一 般 C=N 双键(0.128nm)长，可见，肽键中-C-N-键的性质介于单、双键之间， 具有部分双键的性质，因而不能旋转，这就将固定在一个平面之内。 (2)肽键的 C 及 N 周围三个键角之和均为 360°，说明都处于一个平面上， 也就是说六个原子（-Cα—CO—NH—Cα-）基本上同处于一个平面，这就是 肽键平面。肽链中能够旋转的只有α碳原子所形成的单键，此单键的旋转决 定两个肽键平面的位置关系，于是肽键平面成为肽链盘曲折叠的基本单位。 (3)肽键中的 C-N 既具有双键性质，就会有顺反不同的立体异构，已证实 CO 和 NH 处于反位。 2.蛋白质主链构象的结构单元 1)α-螺旋 Pauling 等人对α－角蛋白(α－keratin)进行了 X 线衍射分析，从衍射图中 看到有 0.5～0.55nm 的重复单位，故推测蛋白质分子中有重复性结构，并认为 这种重复性结构为α－螺旋(α－helix)见下图： α-螺旋的结构特点如下： (1)多个肽键平面通过α－碳原子旋转，相互之间紧密盘曲成稳 固的右手螺旋。 (2)主链呈螺旋上升，每 3.6 个氨基酸残基上升一圈，相当于 0.54nm，这与 X 线衍射图符合
第一章蛋白质化学 (3)相邻两圈螺旋之间借肽键中C=O和H桸形成许多链内氢健,即每 个氨基酸残基中的NH和前面相隔三个残基的C=O之间形成氢键,这是稳定 a一螺旋的主要键。 (4)肽链中氨基酸侧链R,分布在螺旋外侧,其形状、大小及电荷影响a 螺旋的形成。酸性或碱性氨基酸集中的区域,由于同电荷相斥,不利于α 螺旋形成;较大的R(如苯丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸)集中的区域,也妨碍 α一螺旋形成;脯氨酸因其α一碳原子位于五元环上,不易扭转,加之它是 亚氨基酸,不易形成氢键,故不易形成上述α一螺旋;甘氨酸的R基为H 空间占位很小,也会影响该处螺旋的稳定 2)B-片层结构 Astbury等人曾对β一角蛋白进行X线衍射分析,发现具有0.7m的重复 单位。如将毛发a一角蛋白在湿热条件下拉伸,可拉长到原长二倍,这种a 螺旋的X线衍射图可改变为与β一角蛋白类似的衍射图。说明β一角蛋白 中的结构和a一螺旋拉长伸展后结构相似。两段以上的这种折叠成锯齿状的 肽链,通过氢键相连而平行成片层状的结构称为β一片层(B- pleated sheet 结构或称β一折迭,如下图: 令、 B一片层结构特点是: (1)是肽链相当伸展的结构,肽链平面之间折叠成锯齿状,相邻肽键平 面间呈110°角。氨基酸残基的R侧链伸出在锯齿的上方或下方。(2)依靠两 条肽链或一条肽链内的两段肽链间的C=O与HN形成氢键,使构象稳定。(3) 两段肽链可以是平行的,也可以是反平行的。即前者两条链从“N端”到“C 端”是同方向的,后者是反方向的。B一片层结构的形式十分多样,正、反 平行能相互交替。(4)平行的B一片层结构中,两个残基的间距为065nm 反平行的B一片层结构,则间距为0.7nm 3)B-转角 蛋白质分子中,肽链经常会出现180°的回折,在这种回折角处的构象就 是B一转角(B-tun或B-bend)。B一转角中,第一个氨基酸残基的C=O 与第四个残基的N桯形成氢键,从而使结构稳定。如下图:
第一章 蛋白质化学 10 (3)相邻两圈螺旋之间借肽键中 C＝O 和 H 桸形成许多链内氢健，即每一 个氨基酸残基中的 NH 和前面相隔三个残基的 C＝O 之间形成氢键，这是稳定 α－螺旋的主要键。 (4)肽链中氨基酸侧链 R，分布在螺旋外侧，其形状、大小及电荷影响α －螺旋的形成。酸性或碱性氨基酸集中的区域，由于同电荷相斥，不利于α －螺旋形成；较大的 R(如苯丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸)集中的区域，也妨碍 α－螺旋形成；脯氨酸因其α－碳原子位于五元环上，不易扭转，加之它是 亚氨基酸，不易形成氢键，故不易形成上述α－螺旋；甘氨酸的 R 基为 H， 空间占位很小，也会影响该处螺旋的稳定。 2)β-片层结构 Astbury 等人曾对β－角蛋白进行 X 线衍射分析，发现具有 0.7nm 的重复 单位。如将毛发α－角蛋白在湿热条件下拉伸，可拉长到原长二倍，这种α －螺旋的 X 线衍射图可改变为与β－角蛋白类似的衍射图。说明β－角蛋白 中的结构和α－螺旋拉长伸展后结构相似。两段以上的这种折叠成锯齿状的 肽链，通过氢键相连而平行成片层状的结构称为β－片层(β－pleated sheet) 结构或称β－折迭，如下图： β－片层结构特点是： （1）是肽链相当伸展的结构，肽链平面之间折叠成锯齿状，相邻肽键平 面间呈 110°角。氨基酸残基的 R 侧链伸出在锯齿的上方或下方。（2）依靠两 条肽链或一条肽链内的两段肽链间的 C＝O 与 HN 形成氢键，使构象稳定。（3） 两段肽链可以是平行的，也可以是反平行的。即前者两条链从“N 端”到“C 端”是同方向的，后者是反方向的。β－片层结构的形式十分多样，正、反 平行能相互交替。 （4）平行的β－片层结构中，两个残基的间距为 0.65nm； 反平行的β－片层结构，则间距为 0.7nm。 3)β-转角 蛋白质分子中，肽链经常会出现 180°的回折，在这种回折角处的构象就 是β－转角(β－turn 或β－bend)。β－转角中，第一个氨基酸残基的 C＝O 与第四个残基的 N 桯形成氢键，从而使结构稳定。如下图：