分子生物学实验报告三 实验名称三、条浒苔总RNA的提取和反转录 专业班级: 姓名 学号: Email: 实验日期 同组者 一,实验名称:PCR扩增 二,实验目的和要求 1学习和掌握植物总RNA的提取方法 2学习和掌握反转录PCR的方法 三,实验仪器设备与材料 l0叫移液枪、10叫移液枪、条浒苔、RNA提取液、PCR仪 四实验原理 RT-PCR是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法,主要 用于对表达信息进行检测或定量分析还可以用来检测基因表达差异而不必构建cDNA文库 克隆cDNA。 RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用 逆转录酶,以随机引物、 oligo(dn或基因特异性的引物(GsSP)起始。在实际应用中,RT PCR又常常分为一步法RT一PCR和两步法 RT-PCR 五,实验步骤 ①液氮研磨藻体,分装到1.5ml离心管中末 ②向离心管中加入 Iml trizol,充分振荡 ③1200mp/l0min取上清 ④加200微升氯仿,充分振荡15秒,静置2分钟 ⑤12000pm/15分钟,取上清 ⑥加500微升异丙醇,混匀,静置10分钟,12000pm/10分钟 ⑦去上清,加lml75%酒精,混匀,7500rpm/5分钟; ⑧晾晒RNA ⑨30微升DEPC处理水溶解RNA 制备0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,取8μDNA溶液并与1.5μ上样缓冲液混 合,用移液枪加入凝胶孔。电泳缓冲液为05×TBE溶液,电泳结束后用凝胶呈像系统观 察,并拍照记录 A.反转录反应 1按下列组成配制反转录反应液 IOXRNA PCR Buffer MgCl2(25mM 2叫 DNTP Mixture(10mM) 1叫 AMV Reverse Transcriptase XL (SU/HD) RNase Inhibitor (40U/HI) 0.25叫 Oligo Dt-3sites Adaptor Primer(2.5-M) 0.5叫 Positive Control rNa(2X10° copies/叫) 0.5叫 RNase Free dH,O 4.25凹 2按以下条件进行反转录反应 30℃10min分子生物学实验报告三 实验名称: 三、条浒苔总 RNA 的提取和反转录 专业班级: 姓名: 学号： Email: 实验日期: 同组者: 一,实验名称：PCR 扩增 二,实验目的和要求： 1.学习和掌握植物总 RNA 的提取方法 2.学习和掌握反转录 PCR 的方法 三,实验仪器,设备与材料 10µl 移液枪、100µl 移液枪、条浒苔、RNA 提取液、PCR 仪 四,实验原理 RT—PCR 是一种将 cDNA 合成与 PCR 技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要 用于对表达信息进行检测或定量分析,还可以用来检测基因表达差异而不必构建 cDNA 文库 克隆 cDNA。RT-PCR 的模板可以为总 RNA 或 poly(A)+选择性 RNA。逆转录反应可以使用 逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。在实际应用中，RT —PCR 又常常分为一步法 RT—PCR 和两步法 RT—PCR。 五,实验步骤 ①液氮研磨藻体，分装到 1.5ml 离心管中末 ②向离心管中加入 1ml TRIzol，充分振荡； ③12000rmp/10min 取上清 ④加 200 微升氯仿，充分振荡 15 秒，静置 2 分钟 ⑤12000rpm/15 分钟，取上清 ⑥加 500 微升异丙醇，混匀，静置 10 分钟，12000rpm/10 分钟； ⑦去上清，加 1ml 75%酒精，混匀，7500rpm/5 分钟； ⑧晾晒 RNA ⑨30 微升 DEPC 处理水溶解 RNA； 制备 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，取 8µlDNA 溶液并与 1.5µl 上样缓冲液混 合，用移液枪加入凝胶孔。电泳缓冲液为 0.5×TBE 溶液，电泳结束后用凝胶呈像系统观 察，并拍照记录。 A.反转录反应 1 按下列组成配制反转录反应液： 10XRNA PCR Buffer 1µl MgCl2 (25mM) 2µl DNTP Mixture (10mM) 1µl AMV Reverse Transcriptase XL (5U/µl) 0.5µl RNase Inhibitor (40U/µl) 0.25µl Oligo Dt-3sites Adaptor Primer (2.5µM) 0.5µl Positive Control RNA (2X105 copies/µl) 0.5µl RNase Free dH2O 4.25µl 2 按以下条件进行反转录反应 30℃ 10min