性同位素标记的某种ddNTP,通过凝胶电泳和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。 Sanger测序技术由于操作快速、简单，准确率高和有较长读长的优势而被广泛应用，人类基因组测序正是基于该技 术而完成的。但这一技术容易受到成本低、速度慢和通量低等因素的限制，无法满足大型基因组组装方面的需要。 3'-.CAGTGAATTCGAGCTCGC.-5DNA模板 5'-..GTCAC 引物 ...GTCACT* ..GTCACTT* .GTCACTTA* ...GTCACTTAA* ...GTCACTTAAG* ...GTCACTTAAGC ...GTCACTTAAGCT* ...GTCACTTAAGCTC* 凝胶电泳和放射自显影 图S2-6 Sanger测序法原理 第二代测序技术：随着人类基因组计划的完成，人们进入了后基因组时代，即功能基因组时代，传统的测序方 法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求，这促使了新一代DNA测序技术的诞生。新一代 测序技术也称为第二代测序技术，主要包括罗氏454公司的GS FLX测序平台、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer测序平台和ABI公司的SOLiD测序平台。454生命科学公司测序技术采用的是焦磷酸测序原理，主要步骤 包括：①文库准备，将基因组DNA打碎成300~800bp长的片段，在单链DNA的3'-端和5'-端分别连上不同的接 头。②连接，带有接头的单链DNA被固定在DNA捕获磁珠上，每一个磁珠携带一个单链DNA片段，扩增试剂将 磁珠乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了许多个包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。③扩增，每个独 特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增（乳液PCR,emulsion PCR),从而排除了其它序列的竞争。整个DNA 片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言，扩增产生几百万个相同拷贝。乳液PC终止后，扩增的片段仍 然结合在磁珠上。④测序，携带DNA的捕获磁珠被放入PTP板中进行测序。PTP孔的直径(29)只能容纳一 个磁珠(20um)。放置在4个单独的试剂瓶里的4种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次 只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在ATP硫酸化酶和荧光素酶的作用下，释 放出光信号，并实时地被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子 的光信号：由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。第二代测序技术最显著的特征是高通量， 一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序，但是其较短读长不利于生物信息学分析，而且，扩增PCR前 99 性同位素标记的某种 ddNTP，通过凝胶电泳和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测分子的 DNA 序列。 Sanger 测序技术由于操作快速、简单，准确率高和有较长读长的优势而被广泛应用，人类基因组测序正是基于该技 术而完成的。但这一技术容易受到成本低、速度慢和通量低等因素的限制，无法满足大型基因组组装方面的需要。 图 S2-6 Sanger 测序法原理 第二代测序技术：随着人类基因组计划的完成，人们进入了后基因组时代，即功能基因组时代，传统的测序方 法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求，这促使了新一代 DNA 测序技术的诞生。新一代 测序技术也称为第二代测序技术，主要包括罗氏 454 公司的 GS FLX 测序平台、Illumina 公司的 Solexa Genome Analyzer 测序平台和 ABI 公司的 SOLiD 测序平台。454 生命科学公司测序技术采用的是焦磷酸测序原理，主要步骤 包括：①文库准备，将基因组 DNA 打碎成 300～800 bp 长的片段，在单链 DNA 的 3’-端和 5’-端分别连上不同的接 头。②连接，带有接头的单链 DNA 被固定在 DNA 捕获磁珠上，每一个磁珠携带一个单链 DNA 片段，扩增试剂将 磁珠乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了许多个包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。③扩增，每个独 特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增（乳液 PCR，emulsion PCR），从而排除了其它序列的竞争。整个 DNA 片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言，扩增产生几百万个相同拷贝。乳液 PCR 终止后，扩增的片段仍 然结合在磁珠上。④测序，携带 DNA 的捕获磁珠被放入 PTP 板中进行测序。PTP 孔的直径（29 μm）只能容纳一 个磁珠（20 μm）。放置在 4 个单独的试剂瓶里的 4 种碱基，依照 T、A、C、G 的顺序依次循环进入 PTP 板，每次 只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在 ATP 硫酸化酶和荧光素酶的作用下，释 放出光信号，并实时地被仪器配置的高灵敏度 CCD 捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子 的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。第二代测序技术最显著的特征是高通量， 一次能对几十万到几百万条 DNA 分子进行序列测序，但是其较短读长不利于生物信息学分析，而且，扩增 PCR 前