应用预防医学2016年10月第22卷第5期 J Applied Prev Med. October2016.Vdl22Na 387 气单胞菌感染的暴发屡有报道。由于气单胞菌在物公司完成。采用 DNAStar软件中的 Seqman对4株 分类上较复杂,使其菌种鉴定较为困难,使用商气单胞菌的grB和roB基因双向测序结果拼接为 业化的系统生化鉴定,其鉴定度不高。在分子单一序列。将4株菌株grB和roB基因序列分别 鉴定方面,使用16 SrrNA基因序列在部分气单胞与 Gen Bank中已报道的核酸序列进行在线 Blast分 菌中表现出较高的同源性,亦不能很好地解决气析(htt/ blast ncbinlm nih.gov),下载与4株菌株 单胞菌的鉴定问题。近年来在气单胞菌中开始使grB和moB基因序列同源性在99%以上的核酸序 用gyrB、mpoB等管家基因进行分子鉴定。本研究为列及气单胞菌属不同种的gyrB和roB基因序列。 了对4株气单胞菌临床分离株的种型进行准确鉴将以上序列使用Mega40进行序列比对,计算各序 定,选用rpoB基因和grB基因进行PCR扩增和测列间同源性和差异性,并采用NJ法 序,结合序列构建的系统发育树进行分子鉴定,为( Neighbor- JoIing.邻近法)构建系统发育树,通过 气单胞菌引起的感染性腹泻诊断提供病原学依据。自举分析( Bootstrap)进行置信度检测,自举次数 1材料与方法 1000次。 11菌株来源4株气单胞菌菌株分离自2013年2结果 贵州省某幼儿园腹泻患儿的菌株,菌株编号为2.14株气单胞菌株ηoB和grB基因PCR扩增结 GZ2013-0131-01~03、GZ2013-0131-06。经 APINE果对生化鉴定为气单胞菌的4株菌株进行moB和 系统生化鉴定,4株气单胞菌株均鉴定为嗜水气单gyrB基因PCR扩增,结果显示4株菌株均扩增出单 胞菌豚鼠气单胞菌(鉴定度为999%),由本中心一的扩增条带,mpoB和gyrB基因分别获得10l 肠道病原菌检测实验室鉴定保存。 (grB)和560bp(mpoB)特异性扩增片断,而阴性 1.2主要试剂和仪器2× easy tag mIx、10Obp对照无条带扩增。见图1。 Marker( TaKaRa,大连宝生物),PCR梯度扩增仪 ( Biometra,德国),凝胶成像仪 Gel dos2000型 (Bio-Rad,美国),引物合成及PCR产物测序由大 连宝生物公司完成。 1.3DNA提取将系统生化鉴定符合气单胞菌的 菌株和标准菌株接种至血琼脂平板培养18h后,采 用水煮法提取细菌基因组DNA,95℃10min后, 100 12000r/min离心5min,取上清作为PCR反应模板。 500 14gyB和roB基因PCR扩增按照文献提供的50 grB、mpoB基因引物序列和反应参数对4株气单胞 菌株核酸进行扩增,超纯水作为阴性对照。PCR图14株气单胞菌菌株η∽B、grB基因PCR扩增结果 产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳,Bio-Rad凝胶 注:M:20 pArker,1-4lane为4株气单胞菌ro 成像仪中观察特异性扩增条带。 基因扩增结果,5-9lane为4株气单胞菌gB基因扩增结 果,9lane为阴性对照 表1gB基因和poB基因PCR及测序用引物 物 22gyB和rpoB序列同源性搜索结果4株菌株 gyrB-F 5 *TCCGGCGGTCTGCACGGCGT 3 1100bp gyrB基因测序结果经校正后获得1050bp序列,与 gyrB-R 5'TTGTCCGGGTTGTACTCGTC 3 GenBank中已报道的多株豚鼠气单胞菌和嗜水气单 rpoB-F5‘ GCAGTGAAAGARTTCTTTGGTTC3’560bp 胞菌的grB基因序列同源性较高,相似性为 rpoB-R 5'GTTGCATGTTNGNACCCAT 99%;mpoB基因测序结果经校正后获得517bp序 列,与 Gen bank中已报道的多株豚鼠气单胞菌的 1.5基因测序分析PCR扩增产物经纯化后,用rpoB基因序列高度同源,序列相似性在99% 扩增引物进行测序,产物纯化及测序由大连宝生100%,4株气单胞菌分离株之间的差异性在000~应用预防医学 2016年10月第 22 卷第5期 J Applied Prev Med, October 2016, Vol 22 No.5 气单胞菌感染的暴发屡有报道。由于气单胞菌在 分类上较复杂，使其菌种鉴定较为困难，使用商 业化的系统生化鉴定，其鉴定度不高[2-3] 。在分子 鉴定方面，使用 16SrRNA 基因序列在部分气单胞 菌中表现出较高的同源性，亦不能很好地解决气 单胞菌的鉴定问题[4] 。近年来在气单胞菌中开始使 用gyrB、rpoB等管家基因进行分子鉴定。本研究为 了对 4 株气单胞菌临床分离株的种型进行准确鉴 定，选用rpoB基因和gyrB基因进行PCR扩增和测 序，结合序列构建的系统发育树进行分子鉴定，为 气单胞菌引起的感染性腹泻诊断提供病原学依据。 1 材料与方法 1.1 菌株来源 4 株气单胞菌菌株分离自 2013 年 贵州省某幼儿园腹泻患儿的菌株，菌株编号为 GZ2013-0131-01～03、GZ2013-0131-06。经APINE 系统生化鉴定，4株气单胞菌株均鉴定为嗜水气单 胞菌/豚鼠气单胞菌 （鉴定度为99.9%），由本中心 肠道病原菌检测实验室鉴定保存。 1.2 主要试剂和仪器 2× easy taq mix、100bp Marker （TaKaRa，大连宝生物），PCR梯度扩增仪 （Biometra， 德 国）， 凝 胶 成 像 仪 Gel Doc2000 型 （Bio-Rad，美国），引物合成及PCR产物测序由大 连宝生物公司完成。 1.3 DNA提取 将系统生化鉴定符合气单胞菌的 菌株和标准菌株接种至血琼脂平板培养18h后，采 用水煮法提取细菌基因组 DNA，95℃10min 后， 12 000r/min离心5min，取上清作为PCR反应模板。 1.4 gyrB和rpoB基因PCR扩增 按照文献[5-6] 提供的 gyrB、rpoB基因引物序列和反应参数对4株气单胞 菌株核酸进行扩增，超纯水作为阴性对照。PCR 产物于 1%琼脂糖凝胶中进行电泳，Bio-Rad 凝胶 成像仪中观察特异性扩增条带。 1.5 基因测序分析 PCR 扩增产物经纯化后，用 扩增引物进行测序，产物纯化及测序由大连宝生 物公司完成。采用DNAStar软件中的Seqman对4株 气单胞菌的gyrB 和rpoB 基因双向测序结果拼接为 单一序列。将 4 株菌株 gyrB 和 rpoB 基因序列分别 与 GenBank 中已报道的核酸序列进行在线 Blast 分 析 （http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）,下载与 4 株菌株 gyrB 和 rpoB 基因序列同源性在 99%以上的核酸序 列及气单胞菌属不同种的 gyrB 和 rpoB 基因序列。 将以上序列使用Mega4.0进行序列比对，计算各序 列 间 同 源 性 和 差 异 性 ， 并 采 用 ＮＪ 法 （Neighbor-joining,邻近法） 构建系统发育树，通过 自举分析 （Bootstrap） 进行置信度检测，自举次数 1 000次。 2 结果 2.1 4株气单胞菌株rpoB和gyrB基因PCR扩增结 果 对生化鉴定为气单胞菌的4株菌株进行rpoB和 gyrB基因PCR扩增，结果显示4株菌株均扩增出单 一的扩增条带， rpoB和gyrB基因分别获得1100bp （gyrB）和560bp（rpoB）特异性扩增片断，而阴性 对照无条带扩增。见图1。 2.2 gyrB 和 rpoB 序列同源性搜索结果 4 株菌株 gyrB基因测序结果经校正后获得1 050 bp序列，与 GenBank中已报道的多株豚鼠气单胞菌和嗜水气单 胞 菌 的 gyrB 基 因 序 列 同 源 性 较 高 ， 相 似 性 为 99%；rpoB 基因测序结果经校正后获得 517 bp 序 列，与 GenBank 中已报道的多株豚鼠气单胞菌的 rpoB 基因序列高度同源，序列相似性在 99%～ 100%，4株气单胞菌分离株之间的差异性在0.00～ 表1 gyrB基因和rpoB基因PCR及测序用引物 图1 4株气单胞菌菌株rpoB、gyrB基因PCR扩增结果 注：M：2 000bpMarker, 1-4 lane 为 4 株气单胞菌 rpoB 基因扩增结果，5-9 lane 为 4 株气单胞菌 gyrB 基因扩增结 果，9 lane为阴性对照 387