应用预防医学2016年10月第22卷第5期 J Applied Prev Med. October2016.vd22Na5 论著· 文章编号:1673-758X201605-0386-04 中图分类号:R117 文献标识码:A 4株气单胞菌临床分离株基于gyB和rpoB基因序列的分子鉴定 韦小瑜',游旅',田克诚',朱琳,张仁俊3,吉光辉3,唐光鵬',王定明 1贵州省疾病预防控制中心传染病防治研究所(贵州贵阳50004) 2贵州省遵义市疾病预防控制中心(貴州遵义563000 [摘要]目的对4株气单胞菌临床分离株进行菌种的分子鉴定,为气单胞菌的种型鉴定提供病原学依据。方法对 4株系统生化鉴定为气单胞菌的菌株,提取核酸作为模板,分别使用srB、叩oB基因进行扩增及产物测序,将所得序 列在 GenBank中进行同源性搜索,与 Genbank中已经公布的同源性较高的气单胞菌序列比较构建系统发育树并进行分 析。结果4株气单胞菌gyTB基因序列经同源性搜索,与多株嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌同源性为99%,moB基因 序列则与多株豚鼠气胞菌同源性为99%~100%,对rB基因和rpoB基因序列分别进行系统发育树分析显示,4株气 单胞菌菌株在grB基因系统发育树中与多株嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌聚为一簇,而在oB基因系统发育树中与 多株豚鼠气单胞菌聚在同一分枝内。结论4株气单胞菌经mpoB基因测序分析明确鉴定为豚鼠气单胞菌,grB基因测 序分析不能有效鉴定其种型。 [关键词]气单胞菌;基因种;鉴定 Molecular identification of 4 clinical Aeromonas isolates by gyrB and rpoB gene sequencing WEI Xiao-yu, YOU Lv, and TIAN Ke-cheng, et al. Research Institute of Infectious Disease Control and Preventie Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention, Guiyang 550004. China: Zuiyi Center for Disease Control and Prevention. Zunyi 563000. China [Abstract] Objective To identify the gene species of 4 clinical Aeromonas isolates and to provide the etiologic basis for the identification of Aeromonas species. Methods The isolates were identified as Aeromonas by conventional biochemical methods. The DNA of Aeromonas isolates was extracted as the template of PCR. The gyrB and rpoB gene were amplified and sequenced. Two sequence homology searches were conducted on Gen Bank and selected closely homology strains. Two molecular phylogenetic trees were constructed for analyze. Results The sequence homology of gyrB gene was 99%o among Aeromonas isolates, Aeromonas hydrophila and Aeromonas caviae strains, 99%100%(rpoB) among Aeromonas isolates and Aeromonas caviae strains. The phylogenetic tree of gyrB gene showed that 4 Aeromonas isolates, Aeromonas caviae strains and Aeromonas hydrophila strains wer clustered in the same group. While 4 Aeromonas isolates fell into the same branch with Aeromonas caviae strains the phylogenetic tree of rpoB gene. Conclusions Four Aeromonas isolates were identified as Aeromonas caviae by rpoB gene sequence. Aeromonas species could not be identified by gyrB gene sequence [Key Words] Aeromonas: genospecies; identification 基金项目:国家科技重大专项(2012ZX10004-212);贵州 气单胞菌属是一类革兰阴性杆菌,常引起鱼 省优秀青年科技人才培养对象专项资金项目黔科合人字 (2015)09号;贵州省疾病预防控制中心科技基金 类、鸟类及哺乳类等多种动物发病及感染人类引起 (2015-E2-3)联合资助 腹泻、败血症等,属典型的人兽共患病病原菌 作者简介:韦小瑜(1978—),女(苗族,贵州遵义人,副气单胞菌引起的败血症,主要发生于肝硬化及恶 主任医师,主要从事肠道传染病的实验室诊断和分子流行性肿瘤等免疫功能低下的患者,预后差,病死率 高。随着旅游业的发展和海产品食用量的增加
应用预防医学 2016年10月第 22 卷第5期 J Applied Prev Med, October 2016, Vol 22 No.5 韦小瑜1 ，游旅1 ，田克诚 1 ，朱琳2 ，张仁俊2 ，吉光辉2 ，唐光鹏1 ，王定明1 1 贵州省疾病预防控制中心传染病防治研究所（贵州 贵阳 550004） 2 贵州省遵义市疾病预防控制中心（贵州 遵义 563000） 4株气单胞菌临床分离株基于gyrB和rpoB基因序列的分子鉴定 文章编号：1673 - 758X(2016)05 - 0386 - 04 中图分类号：R 117 文献标识码：A ·论著· [摘要] 目的 对4株气单胞菌临床分离株进行菌种的分子鉴定，为气单胞菌的种型鉴定提供病原学依据。方法 对 4株系统生化鉴定为气单胞菌的菌株，提取核酸作为模板，分别使用gyrB、rpoB基因进行扩增及产物测序，将所得序 列在GenBank中进行同源性搜索，与GenBank中已经公布的同源性较高的气单胞菌序列比较构建系统发育树并进行分 析。结果 4株气单胞菌gyrB基因序列经同源性搜索，与多株嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌同源性为99%，rpoB基因 序列则与多株豚鼠气胞菌同源性为99%～100%，对gyrB基因和rpoB基因序列分别进行系统发育树分析显示，4株气 单胞菌菌株在gyrB基因系统发育树中与多株嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌聚为一簇，而在rpoB基因系统发育树中与 多株豚鼠气单胞菌聚在同一分枝内。结论 4株气单胞菌经rpoB基因测序分析明确鉴定为豚鼠气单胞菌，gyrB基因测 序分析不能有效鉴定其种型。 [关键词] 气单胞菌；基因种；鉴定 基金项目：国家科技重大专项 （2012ZX10004-212）；贵州 省优秀青年科技人才培养对象专项资金项目[黔科合人字 （2015） 09 号]； 贵 州 省 疾 病 预 防 控 制 中 心 科 技 基 金 （2015-E2-3）联合资助。 作者简介：韦小瑜 （1978—），女(苗族)，贵州遵义人，副 主任医师，主要从事肠道传染病的实验室诊断和分子流行 病学研究。 Molecular identification of 4 clinical Aeromonas isolates by gyrB and rpoB gene sequencing WEI Xiao-yu, YOU Lv, and TIAN Ke-cheng, et al. Research Institute of Infectious Disease Control and Prevention, Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention, Guiyang 550004, China; Zuiyi Center for Disease Control and Prevention, Zunyi 563000, China [Abstract] Objective To identify the gene species of 4 clinical Aeromonas isolates and to provide the etiologic basis for the identification of Aeromonas species. Methods The isolates were identified as Aeromonas by conventional biochemical methods. The DNA of Aeromonas isolates was extracted as the template of PCR. The gyrB and rpoB gene were amplified and sequenced. Two sequence homology searches were conducted on GenBank and selected closely homology strains. Two molecular phylogenetic trees were constructed for analyze. Results The sequence homology of gyrB gene was 99% among Aeromonas isolates、 Aeromonas hydrophila and Aeromonas caviae strains,99%～100%(rpoB) among Aeromonas isolates and Aeromonas caviae strains. The phylogenetic tree of gyrB gene showed that 4 Aeromonas isolates、Aeromonas caviae strains and Aeromonas hydrophila strains were clustered in the same group. While 4 Aeromonas isolates fell into the same branch with Aeromonas caviae strains in the phylogenetic tree of rpoB gene.Conclusions Four Aeromonas isolates were identified as Aeromonas caviae by rpoB gene sequence. Aeromonas species could not be identified by gyrB gene sequence [Key Words] Aeromonas; genospecies; identification 气单胞菌属是一类革兰阴性杆菌，常引起鱼 类、鸟类及哺乳类等多种动物发病及感染人类引起 腹泻、败血症等，属典型的人兽共患病病原菌[1] 。 气单胞菌引起的败血症，主要发生于肝硬化及恶 性肿瘤等免疫功能低下的患者，预后差，病死率 高。随着旅游业的发展和海产品食用量的增加， 386
应用预防医学2016年10月第22卷第5期 J Applied Prev Med. October2016.Vdl22Na 387 气单胞菌感染的暴发屡有报道。由于气单胞菌在物公司完成。采用 DNAStar软件中的 Seqman对4株 分类上较复杂,使其菌种鉴定较为困难,使用商气单胞菌的grB和roB基因双向测序结果拼接为 业化的系统生化鉴定,其鉴定度不高。在分子单一序列。将4株菌株grB和roB基因序列分别 鉴定方面,使用16 SrrNA基因序列在部分气单胞与 Gen Bank中已报道的核酸序列进行在线 Blast分 菌中表现出较高的同源性,亦不能很好地解决气析(htt/ blast ncbinlm nih.gov),下载与4株菌株 单胞菌的鉴定问题。近年来在气单胞菌中开始使grB和moB基因序列同源性在99%以上的核酸序 用gyrB、mpoB等管家基因进行分子鉴定。本研究为列及气单胞菌属不同种的gyrB和roB基因序列。 了对4株气单胞菌临床分离株的种型进行准确鉴将以上序列使用Mega40进行序列比对,计算各序 定,选用rpoB基因和grB基因进行PCR扩增和测列间同源性和差异性,并采用NJ法 序,结合序列构建的系统发育树进行分子鉴定,为( Neighbor- JoIing.邻近法)构建系统发育树,通过 气单胞菌引起的感染性腹泻诊断提供病原学依据。自举分析( Bootstrap)进行置信度检测,自举次数 1材料与方法 1000次。 11菌株来源4株气单胞菌菌株分离自2013年2结果 贵州省某幼儿园腹泻患儿的菌株,菌株编号为2.14株气单胞菌株ηoB和grB基因PCR扩增结 GZ2013-0131-01~03、GZ2013-0131-06。经 APINE果对生化鉴定为气单胞菌的4株菌株进行moB和 系统生化鉴定,4株气单胞菌株均鉴定为嗜水气单gyrB基因PCR扩增,结果显示4株菌株均扩增出单 胞菌豚鼠气单胞菌(鉴定度为999%),由本中心一的扩增条带,mpoB和gyrB基因分别获得10l 肠道病原菌检测实验室鉴定保存。 (grB)和560bp(mpoB)特异性扩增片断,而阴性 1.2主要试剂和仪器2× easy tag mIx、10Obp对照无条带扩增。见图1。 Marker( TaKaRa,大连宝生物),PCR梯度扩增仪 ( Biometra,德国),凝胶成像仪 Gel dos2000型 (Bio-Rad,美国),引物合成及PCR产物测序由大 连宝生物公司完成。 1.3DNA提取将系统生化鉴定符合气单胞菌的 菌株和标准菌株接种至血琼脂平板培养18h后,采 用水煮法提取细菌基因组DNA,95℃10min后, 100 12000r/min离心5min,取上清作为PCR反应模板。 500 14gyB和roB基因PCR扩增按照文献提供的50 grB、mpoB基因引物序列和反应参数对4株气单胞 菌株核酸进行扩增,超纯水作为阴性对照。PCR图14株气单胞菌菌株η∽B、grB基因PCR扩增结果 产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳,Bio-Rad凝胶 注:M:20 pArker,1-4lane为4株气单胞菌ro 成像仪中观察特异性扩增条带。 基因扩增结果,5-9lane为4株气单胞菌gB基因扩增结 果,9lane为阴性对照 表1gB基因和poB基因PCR及测序用引物 物 22gyB和rpoB序列同源性搜索结果4株菌株 gyrB-F 5 *TCCGGCGGTCTGCACGGCGT 3 1100bp gyrB基因测序结果经校正后获得1050bp序列,与 gyrB-R 5'TTGTCCGGGTTGTACTCGTC 3 GenBank中已报道的多株豚鼠气单胞菌和嗜水气单 rpoB-F5‘ GCAGTGAAAGARTTCTTTGGTTC3’560bp 胞菌的grB基因序列同源性较高,相似性为 rpoB-R 5'GTTGCATGTTNGNACCCAT 99%;mpoB基因测序结果经校正后获得517bp序 列,与 Gen bank中已报道的多株豚鼠气单胞菌的 1.5基因测序分析PCR扩增产物经纯化后,用rpoB基因序列高度同源,序列相似性在99% 扩增引物进行测序,产物纯化及测序由大连宝生100%,4株气单胞菌分离株之间的差异性在000~
应用预防医学 2016年10月第 22 卷第5期 J Applied Prev Med, October 2016, Vol 22 No.5 气单胞菌感染的暴发屡有报道。由于气单胞菌在 分类上较复杂，使其菌种鉴定较为困难，使用商 业化的系统生化鉴定，其鉴定度不高[2-3] 。在分子 鉴定方面，使用 16SrRNA 基因序列在部分气单胞 菌中表现出较高的同源性，亦不能很好地解决气 单胞菌的鉴定问题[4] 。近年来在气单胞菌中开始使 用gyrB、rpoB等管家基因进行分子鉴定。本研究为 了对 4 株气单胞菌临床分离株的种型进行准确鉴 定，选用rpoB基因和gyrB基因进行PCR扩增和测 序，结合序列构建的系统发育树进行分子鉴定，为 气单胞菌引起的感染性腹泻诊断提供病原学依据。 1 材料与方法 1.1 菌株来源 4 株气单胞菌菌株分离自 2013 年 贵州省某幼儿园腹泻患儿的菌株，菌株编号为 GZ2013-0131-01～03、GZ2013-0131-06。经APINE 系统生化鉴定，4株气单胞菌株均鉴定为嗜水气单 胞菌/豚鼠气单胞菌 （鉴定度为99.9%），由本中心 肠道病原菌检测实验室鉴定保存。 1.2 主要试剂和仪器 2× easy taq mix、100bp Marker （TaKaRa，大连宝生物），PCR梯度扩增仪 （Biometra， 德 国）， 凝 胶 成 像 仪 Gel Doc2000 型 （Bio-Rad，美国），引物合成及PCR产物测序由大 连宝生物公司完成。 1.3 DNA提取 将系统生化鉴定符合气单胞菌的 菌株和标准菌株接种至血琼脂平板培养18h后，采 用水煮法提取细菌基因组 DNA，95℃10min 后， 12 000r/min离心5min，取上清作为PCR反应模板。 1.4 gyrB和rpoB基因PCR扩增 按照文献[5-6] 提供的 gyrB、rpoB基因引物序列和反应参数对4株气单胞 菌株核酸进行扩增，超纯水作为阴性对照。PCR 产物于 1%琼脂糖凝胶中进行电泳，Bio-Rad 凝胶 成像仪中观察特异性扩增条带。 1.5 基因测序分析 PCR 扩增产物经纯化后，用 扩增引物进行测序，产物纯化及测序由大连宝生 物公司完成。采用DNAStar软件中的Seqman对4株 气单胞菌的gyrB 和rpoB 基因双向测序结果拼接为 单一序列。将 4 株菌株 gyrB 和 rpoB 基因序列分别 与 GenBank 中已报道的核酸序列进行在线 Blast 分 析 （http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）,下载与 4 株菌株 gyrB 和 rpoB 基因序列同源性在 99%以上的核酸序 列及气单胞菌属不同种的 gyrB 和 rpoB 基因序列。 将以上序列使用Mega4.0进行序列比对，计算各序 列 间 同 源 性 和 差 异 性 ， 并 采 用 ＮＪ 法 （Neighbor-joining,邻近法） 构建系统发育树，通过 自举分析 （Bootstrap） 进行置信度检测，自举次数 1 000次。 2 结果 2.1 4株气单胞菌株rpoB和gyrB基因PCR扩增结 果 对生化鉴定为气单胞菌的4株菌株进行rpoB和 gyrB基因PCR扩增，结果显示4株菌株均扩增出单 一的扩增条带， rpoB和gyrB基因分别获得1100bp （gyrB）和560bp（rpoB）特异性扩增片断，而阴性 对照无条带扩增。见图1。 2.2 gyrB 和 rpoB 序列同源性搜索结果 4 株菌株 gyrB基因测序结果经校正后获得1 050 bp序列，与 GenBank中已报道的多株豚鼠气单胞菌和嗜水气单 胞 菌 的 gyrB 基 因 序 列 同 源 性 较 高 ， 相 似 性 为 99%；rpoB 基因测序结果经校正后获得 517 bp 序 列，与 GenBank 中已报道的多株豚鼠气单胞菌的 rpoB 基因序列高度同源，序列相似性在 99%～ 100%，4株气单胞菌分离株之间的差异性在0.00～ 表1 gyrB基因和rpoB基因PCR及测序用引物 图1 4株气单胞菌菌株rpoB、gyrB基因PCR扩增结果 注：M：2 000bpMarker, 1-4 lane 为 4 株气单胞菌 rpoB 基因扩增结果，5-9 lane 为 4 株气单胞菌 gyrB 基因扩增结 果，9 lane为阴性对照 387
应用预防医学2016年10月第22卷第5期 J Applied Prev Med.. October2016.Val22No.5 0.01之间存在序列差异 临床重要病原菌,引起肠道内的感染常见于5岁以 2.3grB和rpo序列系统发育树的构建及分析分下的儿童和成人,是夏季腹泻的常见病原菌之 别选取并下载同源性在99%以上的菌株序列,采 。目前文献报道气单胞菌属有24个种,其中嗜 用N法构建grB基因和rpoB基因序列系统发育水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌及中 树,结果见图2和图3。从gyrB基因序列系统发育间气单胞菌是引起人类腹泻、伤口及软组织感 树分析,4株气单胞菌株与嗜水气单胞菌KAE5、染、菌血症的常见临床种型。近年来在我国因气 KAE23及豚鼠气单胞菌 Aeromonas caviae bl4聚为胞菌感染引起感染性腹泻和食物中毒事件屡见报 支,不能有效鉴定其种型;从叩oB基因序列系道門。贵州省2010年也曾报道因气单胞菌感染引起 统发育树分析,4株气单胞菌分离菌株与豚鼠气单的食物中毒事件,且2010年贵州腹泻症候群细 胞菌 Aeromonas caviae atcc5468以及 Kupfer等m菌类病原监测发现气单胞菌检出率仅次于沙门氏 报道的多株豚鼠气单胞菌 Aeromonas caviae菌,监测结果显示,气单胞菌也是目前引起贵州 F507C、V83、V30和V97的ηpoB基因序列聚为一省腹泻的主要病原菌"。因此,对其病原进行准确 支,有较近的亲缘关系。故依据rpB基因系统发的种型鉴定和分型是进行暴发疫情应急检测、流 育分析,将4株气单胞菌分离株鉴定为豚鼠气单胞行病学调查及日常监测的基础 菌( Aeromonas caviae)。 在气单胞菌的种型鉴定中,由于气单胞菌属 内某些种的生化反应谱相同,传统的生化方法对 种的鉴定度较低。细菌16 SrRNA基因分子结构 上的高度保守性、分布的普遍性及其所含的大量 信息,使其成为较理想的基因分类靶序列。然而 16 SrrNA常不能反映关系较近的种间关系,只能 在属的水平上区分细菌。在属以下分类单元的系 统发育分析和分类中,编码蛋白质的管家基因 ATOC 4370oT gyrB和mpoB基因被认为是一种比16 SrrNA更好的 分子靶标"。gyrB为促旋酶的B亚单位基因,属于 ophio KAE23 信息通路中与DNA复制、限制、修饰或修复有关 的蛋白编码基因,基因是一种蛋白编码基因,存 图24株气单胞菌分离株B基因序列系统发育树 在于大多数细菌中,并且不会发生频繁的水平转 移。因此grB基因在细菌的系统发育学,特别是在 ne F507C 近缘种的菌株的区分及鉴定方面受到高度关注叫。 aeromonas canae v97 rpoB基因编码RNA聚合酶的B亚基,在转录中负 责RNA的合成,现已用于临床微生物中细菌的分 A28 子鉴定。邛poB基因是细菌的一个核心基因,该基 因能区分气单胞菌属内关系相近的种吗。 Kupfer 曾对分离自人、动物、环境标本的气单胞菌进行 C33658 l6 SrrNA、grB和moB基因测序的相关性研究, 结果表明,16 SrRNA只能鉴定到属的水平 MGz和rpoB基因测序能够满足对气单胞菌种水平的鉴 图34株气单胞菌分离株oB基因序列系统发育树 定。Shin采用 MALDI- TOF MS、管家基因(gyrB、 rpoB)测序和16SrNA测序方法对气单胞菌临床分 离株进行种型鉴定比较,结果显示气单胞菌管家 3讨论 基因测序系统发育分析方法在气单胞菌的种型鉴 气单胞菌是一种可以引起胃肠炎和败血症的定中是最有效的方法
应用预防医学 2016年10月第 22 卷第5期 J Applied Prev Med, October 2016, Vol 22 No.5 0.01之间存在序列差异。 2.3 gyrB和 rpoB序列系统发育树的构建及分析 分 别选取并下载同源性在 99%以上的菌株序列，采 用 NJ 法构建 gyrB 基因和 rpoB 基因序列系统发育 树，结果见图2和图3。从gyrB基因序列系统发育 树分析，4 株气单胞菌株与嗜水气单胞菌 KAE15、 KAE23 及豚鼠气单胞菌 Aeromonas caviae B14 聚为 一支，不能有效鉴定其种型；从 rpoB 基因序列系 统发育树分析，4株气单胞菌分离菌株与豚鼠气单 胞菌 Aeromonas caviae ATCC15468 以及 Kupfer 等[7] 报 道 的 多 株 豚 鼠 气 单 胞 菌 Aeromonas caviae F507C、V83、V30 和 V97 的 rpoB 基因序列聚为一 支，有较近的亲缘关系。 故依据rpoB基因系统发 育分析，将4株气单胞菌分离株鉴定为豚鼠气单胞 菌（Aeromonas caviae）。 3 讨论 气单胞菌是一种可以引起胃肠炎和败血症的 临床重要病原菌，引起肠道内的感染常见于5岁以 下的儿童和成人，是夏季腹泻的常见病原菌之 一。目前文献报道气单胞菌属有24个种，其中嗜 水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌及中 间气单胞菌是引起人类腹泻、伤口及软组织感 染、菌血症的常见临床种型[8] 。近年来在我国因气 胞菌感染引起感染性腹泻和食物中毒事件屡见报 道[9] 。贵州省2010年也曾报道因气单胞菌感染引起 的食物中毒事件[10] ，且 2010 年贵州腹泻症候群细 菌类病原监测发现气单胞菌检出率仅次于沙门氏 菌，监测结果显示，气单胞菌也是目前引起贵州 省腹泻的主要病原菌[11] 。因此，对其病原进行准确 的种型鉴定和分型是进行暴发疫情应急检测、流 行病学调查及日常监测的基础。 在气单胞菌的种型鉴定中，由于气单胞菌属 内某些种的生化反应谱相同，传统的生化方法对 种的鉴定度较低[12-13] 。细菌16S rRNA基因分子结构 上的高度保守性、分布的普遍性及其所含的大量 信息，使其成为较理想的基因分类靶序列。然而 16S rRNA 常不能反映关系较近的种间关系，只能 在属的水平上区分细菌[14] 。在属以下分类单元的系 统发育分析和分类中，编码蛋白质的管家基因 gyrB和rpoB基因被认为是一种比16S rRNA更好的 分子靶标[15] 。gyrB 为促旋酶的B亚单位基因，属于 信息通路中与DNA复制、限制、修饰或修复有关 的蛋白编码基因，基因是一种蛋白编码基因，存 在于大多数细菌中，并且不会发生频繁的水平转 移。因此gyrB基因在细菌的系统发育学，特别是在 近缘种的菌株的区分及鉴定方面受到高度关注[16] 。 rpoB基因编码RNA聚合酶的β亚基，在转录中负 责RNA的合成，现已用于临床微生物中细菌的分 子鉴定。rpoB 基因是细菌的一个核心基因，该基 因能区分气单胞菌属内关系相近的种[13] 。Kupfer[7] 曾对分离自人、动物、环境标本的气单胞菌进行 16S rRNA、gyrB 和 rpoB 基因测序的相关性研究， 结果表明，16S rRNA 只能鉴定到属的水平，gyrB 和 rpoB 基因测序能够满足对气单胞菌种水平的鉴 定。Shin[17] 采用 MALDI-TOF MS、管家基因（gyrB、 rpoB）测序和16S rRNA 测序方法对气单胞菌临床分 离株进行种型鉴定比较，结果显示气单胞菌管家 基因测序系统发育分析方法在气单胞菌的种型鉴 定中是最有效的方法。 图2 4株气单胞菌分离株gyrB基因序列系统发育树 图3 4株气单胞菌分离株rpoB基因序列系统发育树 388
应用预防医学2016年10月第22卷第5期 J Applied Prev Med. October2016.Vdl22Na 本研究选用管家基因gB基因和roB基因作7] KUPFER M. KUHNERT P. KORCZAK BM,etal. Genetic 为靶基因,对临床分离到的4株气单胞菌株进行扩 relationships of Aeromonas strains inferred from 16S rRNA 增及测序,通过与 Genbank中的相似性较高的气单 gyrB and rpoB gene sequences[J] Int J Syst Evol MicrobioL, 胞菌种及气单胞菌其他种进行同源性及系统发育 2006,5612:2743-2751 树分析,结果发现4株气单胞菌B基因分析与嗜8] JANDA JM, ABBOTT SIThe genus Aeromonas: taxonomy 水气单胞菌KAE5、KAE23及豚鼠气单胞菌 pathogenicity, and infection. Clin Microbiol Rev, 2010, 23 (1) Aeromonas caviae B14聚为一支,不能有效鉴定其p张利焱一起由气单胞菌引起食物中毒事件的调查分析 种型,而叩PoB基因与 Genbank中多株豚鼠气单胞 门医学动物防制,2011,27(3);264-264 菌在同一分枝内,根据ηoB基因系统发育分析结[1o黄艳,韦小瑜,吴成梅,等.一起嗜水气单胞菌引起 果可明确4株气单胞菌分离株为豚鼠气单胞菌。是 的食物中毒调查[中国食品卫生杂志,2012,24 否rpoB基因对气单胞菌的种型鉴定优于grB基 因,由于本研究样本量较少,还需我们加大样本1韦小瑜,田克诚,游旅,等.贵阳市2010年感染性腹 量进行进一步研究。 泻细菌病原学检测分析J现代预防医学,2012,39 (20):5351-5352 参考文献 [12 ABBOTT SL CHEUNG WK, JANDA JM. The genus ]韦信贤,杨先乐,童桂香,等.四重PCR检测致病性 嗜水气单胞菌中国人兽共患病学报,2013,29 and phenotypic identification shemes[J]. J Clin Microbiol. (6):587-93 2348-57 2] ABBOTT SL, CHEUNG WK, JANDA JM. The genus [13 ORMEN O, GRANUM PE. LASSEN J et al. Lack of agree cs. atyp ment between biochemical and genetic identification of and phenotypic identification shemes[J]. J Clin Microbiol Aeromonas spp[J]. APMIS, 2005, 113(3): 203-7. 2003.41(6:2348-2357 14]郝云婕,韩素贞.grB基因在细菌系统发育分析中的 3 ORMENO, GRANUM PE, LASSEN J FIGUERAS MJ 应用生物技术通报,2008(2):39-41 Lack of agreement between biochemical and genetic ident-lS郭晓琳,王多春,阚飙,等.克雷伯菌16 SednA和 fication of Aeromonas spp[J]. APMIS, 2005, 113(3): 203-20 poB基因系统进化及序列特征分析U中华微生物学 4]郭睿,刘年锋,江小斌,等.6株鱼源嗜水气单胞菌 和免疫学杂志,2009,29(2):97-102. 的分子鉴定与毒力基因分析检测福建水产,2014.16安然,易图永,肖启明,等.gB基因在细菌分类和 36(2):87-95. 检测中的应用江西农业学报,2010,22(4) 5] nez MA, Catal a n V, Apr a iz D, et al. Phylogeneti analysis of members of the genus Aeromonas based on gyrB [17 SHIN HB. YOON J, LEE Y, et al. Comparison of MAL- gene sequences[J]. Int J Syst Evol Microbiol. 2003. 53: DI-TOF MS, housekeeping gene sequencing, and 16s 875-883 rRNA genesequencing for identification of Aeromonas clin [6]KORCZAK B. CHRISTENSEN H, EMLER S, et al. Phylog- ical isolates[J]. Yonsei Med J2015 56(2): 550-555 eny of the family Pasteurellaceae based on rpoB sequences 收稿日期:2016-07-05编辑:黄勇俐 [I. Int J Syst Evol Microbiol, 2004: 54: 1393-1399
应用预防医学 2016年10月第 22 卷第5期 J Applied Prev Med, October 2016, Vol 22 No.5 本研究选用管家基因gyrB 基因和rpoB基因作 为靶基因，对临床分离到的4株气单胞菌株进行扩 增及测序，通过与GenBank中的相似性较高的气单 胞菌种及气单胞菌其他种进行同源性及系统发育 树分析，结果发现4株气单胞菌gyrB 基因分析与嗜 水 气 单 胞 菌 KAE15、 KAE23 及 豚 鼠 气 单 胞 菌 Aeromonas caviae B14 聚为一支，不能有效鉴定其 种型，而 rpoB 基因与 GenBank 中多株豚鼠气单胞 菌在同一分枝内，根据 rpoB 基因系统发育分析结 果可明确4株气单胞菌分离株为豚鼠气单胞菌。是 否 rpoB 基因对气单胞菌的种型鉴定优于 gyrB 基 因，由于本研究样本量较少，还需我们加大样本 量进行进一步研究。 参考文献 [1] 韦信贤，杨先乐，童桂香，等．四重PCR检测致病性 嗜水气单胞菌[J]．中国人兽共患病学报，2013，29 （6）：587-93. [2] ABBOTT SL, CHEUNG WK, JANDA JM. The genus Aeromonas: biochemical characteristics, atypical reactions, and phenotypic identification shemes[J]. J Clin Microbiol, 2003,41(6):2348-2357. [3] ORMENO, GRANUM PE, LASSEN J, FIGUERAS MJ. Lack of agreement between biochemical and genetic identification of Aeromonas spp[J]. APMIS ,2005,113(3):203-207. [4] 郭睿，刘年锋，江小斌，等．6株鱼源嗜水气单胞菌 的分子鉴定与毒力基因分析检测[J]．福建水产，2014, 36（2）：87-95. [5] Yáñez MA, Catalán V, Apráiz D, et al. Phylogenetic analysis of members of the genus Aeromonas based on gyrB gene sequences[J]. Int J Syst Evol Microbiol. 2003, 53: 875-883. [6] KORCZAK B, CHRISTENSEN H, EMLER S, et al. Phylogeny of the family Pasteurellaceae based on rpoB sequences [J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2004: 54:1393-1399. [7] KÜPFER M, KUHNERT P, KORCZAK BM, et al. Genetic relationships of Aeromonas strains inferred from 16S rRNA, gyrB and rpoB gene sequences[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2006, 56(12):2743-2751. [8] JANDA JM, ABBOTT SL.The genus Aeromonas: taxonomy, pathogenicity, and infection. Clin Microbiol Rev,2010,23(1): 35-73. [9] 张利焱. 一起由气单胞菌引起食物中毒事件的调查分析 [J].医学动物防制，2011，27（3）；264-264. [10] 黄艳，韦小瑜，吴成梅，等．一起嗜水气单胞菌引起 的食物中毒调查[J]．中国食品卫生杂志，2012，24 （4）：391-393. [11] 韦小瑜，田克诚，游旅，等．贵阳市2010年感染性腹 泻细菌病原学检测分析[J]．现代预防医学，2012，39 （20）：5351-5352. [12] ABBOTT SL, CHEUNG WK, JANDA JM. The genus Aeromonas: biochemical characteristics, atypical reactions, and phenotypic identification shemes[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(6): 2348-57. [13] ORMEN O, GRANUM PE, LASSEN J, et al. Lack of agreement between biochemical and genetic identification of Aeromonas spp[J]. APMIS, 2005,113(3): 203-7. [14] 郝云婕，韩素贞．gyrB基因在细菌系统发育分析中的 应用[J]．生物技术通报，2008（2）：39-41. [15] 郭晓琳，王多春，阚飙，等．克雷伯菌 16SrDNA 和 rpoB基因系统进化及序列特征分析[J]．中华微生物学 和免疫学杂志，2009，29（2）：97-102. [16] 安然，易图永，肖启明，等．gyrB基因在细菌分类和 检测中的应用[J]．江西农业学报，2010，22（4）： 18-20. [17] SHIN HB, YOON J, LEE Y, et al. Comparison of MALDI-TOF MS, housekeeping gene sequencing, and 16S rRNA genesequencing for identification of Aeromonas clinical isolates[J].Yonsei Med J.2015 56(2):550-555. 收稿日期：2016-07-05 编辑：黄勇俐 389