非CPE病击 风疹病寺 扇病毒 (2)红细胞吸附现象(Hemadsorptionphenomenon)流感病毒和某些副粘病击感染细胞后24-48小时，以细胞膜上出现病毒的血凝素，能 吸附豚鼠、鸡等动物及人的红细跑，发生红细胞吸附现象。若加入相应的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制红细抱吸附现象的发生，称为红细 跑吸附抑制试验。这一现象不仅可作为这类病毒增殖的指征，还可作为初步鉴定。 (3)千扰现象Interference phenom co)一种病毒感染细胞后可以干扰另一种病毒在该细胞中的增殖，这种现象叫干扰现象，前者为不产 生CPE的病毒（如风疹病吉）但能干扰以后进入的病毒（如ECHO病毒）增殖，使后者进入宿主细胞不再生产CPE, 】。东声感染性的定量测定 空拼形成单位(P1ague.forming unit,P℉U)测定这是一种测定病毒感染性比较准确的方法。将适当浓度的病击悬液接种到生长单层细饱的玻 璃平皿或扁瓶中，当病毒吸附于细胞上后，再在其上复盖一层溶化的半固体营养琼脂层，待凝固后，孵育培养。当病毒在细孢内复制增殖后， 每一个感染性病毒颗拉在单层细电中产生一个局限性的感染细胞病灶，病灶逐新扩大，若用中性红等活性染料若色，在红色的的背景中显出没 有着色的空斑”，清楚可见。由于每个空斑由单个病毒颗粒复制形成，所以病毒悬液的滴金可以用每毫升空斑形成单位（℉U)来表示 (2)50%致死量(LD50)或30%组织细胞感染量(TCID50)的测定本法可估计所含病志的感染量，方法是测定病毒感染鸡胚，易感动物 或组织培养后，引起50%发生死亡或病变的最小病击量，即将病毒悬液作10信连续稀释，接种于上述鸡胚，易感动物或组织培养中，经一定时 间后，观察细胞或鸡还病变，如绒毛尿囊膜上产生痘斑或尿囊液有血疑特性，或易感动物发病而死亡等，经统计学方法计算出50%感染量或 50%组织细孢感染量，可获得比较准确的病毒感染性滴度。 。病毒形态与结构的观察病毒悬液经高度浓缩和纯化后，借助磷钨酸负染及电子显微镜可直接观察到病毒颗粒，根据大小、形态可初步判 断病毒属那一科。还可用分子生物学技术分析病毒核酸组成、基因组织构。序列同源性比较加以鉴定， 4.血清学鉴定用已知的诊新血清来鉴定，补体结合试验可鉴定病志科属：中和试验或血凝捣蛋制试验可鉴定病声种、型及亚型。从病人检 材中分离出病毒株，应结合临床症状，检材来源及流行季节等加以综合分析，并应注意混杂病毒、隐性感染或潜伏病毒的混淆，须用病人急性 与恢复期双份血清作血洁学试验，血洁抗体滴度有≥4倍以上增高，才有意义 三、病毒核酸及抗原的直接检出 ,病毒D 在原位进行酸变 处理后 的已知病毒DNA片段杂 两条单股核 按险基 补原则结合成双股 经放射自显影 NA结合到要上 阳性结果出现斑点状杂交信 二，使用轮状病击 体外转录的故射标记探针做斑点杂交，敏感性高于ELS入 两也可用旦补的DNA针员京 日前核酸分子杂交不但用来检测急性病人标本中的病DNA 也用于检测不易分商培养的慢性感染、 潜伏感染、整合感染病人标本中的病 毒DNA ,多聚酶链反应(Polymerase chain reaction,.PCR)一种体外基因扩增法。先将待检标本DNA热变性为单股DNA做为模板，加一对人工合 成的与模板DNA两端各20个检基互补的引物，在耐热DNA多聚酶作用下，使四种脱氧核苷按模板3端写引物向5端延伸D小NA链，经20~40个 环，可使1个拷贝的核酸扩增至106以上，经琼脂糖电泳，可见到溴化乙染色的核酸条带，扩增片段的大小取决于两引物的间距。此法较核酸 杂交感 快速，已用于肝炎 ADS瓶病毒感染诊断，尤其适用于不易分离培养及含量极少的病毒标本，有较大应用前景 (二)直接检测病毒抗原 1,免疫荧光(F)技术如前所述F可用于细胞培养病毒的鉴定，也适用检测临床标本中病毒抗原，具有快速、特异的优点。直接免疫荧光 技术是用荧光素直接标记特异性抗体，检测病毒抗原：间接免疫荧光技术是先用特异性抗体与标本中抗原结合，再用荧光素标记的抗体与特异 性抗体结合，从而间接识别抗原。可取喝脱落细跑，检测呼吸道合抱病毒、流感及副流感病毒抗原：取病灶刮片或脑活检标本，检测单纯海 德病毒抗原；取尿沉渣检测巨细胞病毒抗原等。近年来使用单克隆抗体大大提高了检测的灵敏度和准确性。 2,免疫酶法(E)原理与应用范因同免疫荧光技术，EA是用酶（通常是过氧化物酶）取代荧光素标记抗体，酶住化底物形成有色户 物，在普通光学显微镜下清断可见，不需荧光显微镜，便于推广使用， .放射免疫测定法(RIA)有亮争RIA和因相RNA二种方法。亮急RIA是同位素标记的已知抗原与标本中未标记的待检抗原竞争性结合特 异性抗体的试验，将形成的复合物分离出来，用放射免疫检测仪测定放射活性，同时与系列稀释的标准抗原测定结果进行比较，确定出待检扩 原的浓度。因相R八是用特异性抗体包被因相以捕获标本中的抗原，然后加入放射性标记的特异性抗体与抗原结合，测定放射活性，得知抗原 的量。R八是最敏感的方法，已用于测定粪使中甲肝病毒、轮状病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原。 4。薛联免疫吸附试验(ELS)先将特异性抗体包被（吸附）到塑料微培板孔中以捕捉标本中相应抗原，然后加入萌标持异性抗体，相应 抗原被夹在抗体之间，当加入隋的底物后显色，显色程度直接反映了标本中病毒抗原的量。因其敏感性接近RI“,又不接触放射性物质，已被 多数实验室采用， 此外，对难以分离培养，形态特殊且病毒数量较多的标本，可用电镜或免疫电镜法直接观察，是一种快速诊断与鉴定病毒的方法，如轮状 病毒、乙肝病毒. 四、待异性抗体的检测特异性抗体的检测 非CPE病毒 正粘病毒 副粘病毒 风疹病毒 鼻病毒 （2）红细胞吸附现象（Hemadsorptionphenomenon） 流感病毒和某些副粘病毒感染细胞后24-48小时，以细胞膜上出现病毒的血凝素，能 吸附豚鼠、鸡等动物及人的红细胞，发生红细胞吸附现象。若加入相应的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制红细胞吸附现象的发生，称为红细 胞吸附抑制试验。这一现象不仅可作为这类病毒增殖的指征，还可作为初步鉴定。 （3）干扰现象(Interference phenomenon)一种病毒感染细胞后可以干扰另一种病毒在该细胞中的增殖，这种现象叫干扰现象。前者为不产 生CPE的病毒（如风疹病毒）但能干扰以后进入的病毒（如ECHO病毒）增殖，使后者进入宿主细胞不再生产CPE。 2．病毒感染性的定量测定 空斑形成单位 (Plaque-forming unit ,PFU)测定这是一种测定病毒感染性比较准确的方法。将适当浓度的病毒悬液接种到生长单层细胞的玻 璃平皿或扁瓶中，当病毒吸附于细胞上后，再在其上复盖一层溶化的半固体营养琼脂层，待凝固后，孵育培养。当病毒在细胞内复制增殖后， 每一个感染性病毒颗粒在单层细胞中产生一个局限性的感染细胞病灶，病灶逐渐扩大，若用中性红等活性染料着色，在红色的的背景中显出没 有着色的“空斑”，清楚可见。由于每个空斑由单个病毒颗粒复制形成，所以病毒悬液的滴度可以用每毫升空斑形成单位（PFU）来表示。 （2）50%致死量（LD50）或50%组织细胞感染量（TCID50）的测定本法可估计所含病毒的感染量。方法是测定病毒感染鸡胚，易感动物 或组织培养后，引起50%发生死亡或病变的最小病毒量，即将病毒悬液作10倍连续稀释，接种于上述鸡胚，易感动物或组织培养中，经一定时 间后，观察细胞或鸡胚病变，如绒毛尿囊膜上产生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感动物发病而死亡等，经统计学方法计算出50%感染量或 50%组织细胞感染量，可获得比较准确的病毒感染性滴度。 3．病毒形态与结构的观察病毒悬液经高度浓缩和纯化后，借助磷钨酸负染及电子显微镜可直接观察到病毒颗粒，根据大小、形态可初步判 断病毒属那一科。还可用分子生物学技术分析病毒核酸组成、基因组织构、序列同源性比较加以鉴定。 4．血清学鉴定用已知的诊断血清来鉴定。补体结合试验可鉴定病毒科属；中和试验或血凝捣蛋制试验可鉴定病毒种、型及亚型。从病人检 材中分离出病毒株，应结合临床症状，检材来源及流行季节等加以综合分析，并应注意混杂病毒、隐性感染或潜伏病毒的混淆，须用病人急性 期与恢复期双份血清作血清学试验，血清抗体滴度有≥4倍以上增高，才有意义。 三、病毒核酸及抗原的直接检出 （一）直接检出病毒核酸 1．标本滴加到硝酸纤维素膜上，病毒DNA结合到膜上，在原位进行硷变性处理后，有放射标记的已知病毒DNA片段杂并，两条单股核酸 按硷基到补原则结合成双股，经放射自显影，阳性结果出现斑点状杂交信号。含轮状病毒的粪便标本经热变性处理，点到膜上，使用轮状病毒 体外转录的放射标记探针做斑点杂交，敏感性高于ELISA。肠道病毒也可用互补的DNA探针做斑点杂交。 目前核酸分子杂交不但用来检测急性病人标本中的病毒DNA，也用于检测不易分离培养的慢性感染、潜伏感染、整合感染病人标本中的病 毒DNA。 2．多聚酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR) 一种体外基因扩增法。先将待检标本DNA热变性为单股DNA做为模板，加一对人工合 成的与模板DNA两端各20个硷基互补的引物，在耐热DNA多聚酶作用下，使四种脱氧核苷按模板3ˊ端引物向5ˊ端延伸DNA链，经20～40个循 环，可使1个拷贝的核酸扩增至106以上，经琼脂糖电泳，可见到溴化乙锭染色的核酸条带，扩增片段的大小取决于两引物的间距。此法较核酸 杂交敏感、快速，已用于肝炎、AIDS、疱疹病毒感染诊断，尤其适用于不易分离培养及含量极少的病毒标本，有较大应用前景。 （二）直接检测病毒抗原 1．免疫荧光（IF）技术如前所述IF可用于细胞培养病毒的鉴定，也适用检测临床标本中病毒抗原，具有快速、特异的优点。直接免疫荧光 技术是用荧光素直接标记特异性抗体，检测病毒抗原；间接免疫荧光技术是先用特异性抗体与标本中抗原结合，再用荧光素标记的抗体与特异 性抗体结合，从而间接识别抗原。可取咽喉脱落细胞，检测呼吸道合胞病毒、流感及副流感病毒抗原；取病灶刮片或脑活检标本，检测单纯疱 疹病毒抗原；取尿沉渣检测巨细胞病毒抗原等。近年来使用单克隆抗体大大提高了检测的灵敏度和准确性。 2．免疫酶法（IEA）原理与应用范围同免疫荧光技术，IEA是用酶（通常是过氧化物酶）取代荧光素标记抗体，酶催化底物形成有色产 物，在普通光学显微镜下清晰可见，不需荧光显微镜，便于推广使用。 3．放射免疫测定法（RIA）有竞争RIA和因相RNA二种方法。竞急RIA是同位素标记的已知抗原与标本中未标记的待检抗原竞争性结合特 异性抗体的试验，将形成的复合物分离出来，用放射免疫检测仪测定放射活性，同时与系列稀释的标准抗原测定结果进行比较，确定出待检抗 原的浓度。因相RIA是用特异性抗体包被因相以捕获标本中的抗原，然后加入放射性标记的特异性抗体与抗原结合，测定放射活性，得知抗原 的量。RIA是最敏感的方法，已用于测定粪便中甲肝病毒、轮状病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原。 4．酶联免疫吸附试验（ELISA）先将特异性抗体包被（吸附）到塑料微培板孔中以捕捉标本中相应抗原，然后加入酶标特异性抗体，相应 抗原被夹在抗体之间，当加入酶的底物后显色，显色程度直接反映了标本中病毒抗原的量。因其敏感性接近RIA，又不接触放射性物质，已被 多数实验室采用。 此外，对难以分离培养，形态特殊且病毒数量较多的标本，可用电镜或免疫电镜法直接观察，是一种快速诊断与鉴定病毒的方法，如轮状 病毒、乙肝病毒。 四、特异性抗体的检测特异性抗体的检测