第46卷第5期杨天姝等外源蛋白合成抑制剂对杂交水稻种子耐贮藏能力的影响 1.2.2田间制种及种子寿命调控剂处理 以所有鉴定到的蛋白为背景,对不同类型的差异蛋 参照吴玉坤等的方法进行田间制种,灌浆期白进行KEG富集度分析,采用 KOBAS的富集模块 适时喷施多效唑。在种子收获前12d或喷施“九二计算不同KEGG通路的富集情况。 O”后7d,分别喷施外源蛋白质合成抑制剂农用链 采用 Excel2007进行数据处理与分析:运用 霉素、春雷霉素和广谱性农药咪鲜胺等调控剂。以 Sigma plot绘图 喷施清水为对照 2结果与分析 1.2.3种子人工老化处理 参照刘军等和CHEN等的方法进行种子21不同种子贮藏前后的差异蛋白质鉴定 工老化处理。 利用 MASCOT共鉴定出二级谱图545722个,特 老化处理前准备3个密封的干燥器,其中1个加有肽段序列74651个,5210个蛋白质(表1)。使用 入过饱和MgCl溶液,置于20℃人工气候箱或者烘 Perseus件进行统计分析,共鉴定出100个差异表 箱,其余2个各加入过饱和的KC溶液,分别置于25达蛋白质(DEP)。其中,不同比较方案的平均差异 ℃和40℃人工气候箱或者烘箱。将收获的水稻种子蛋白分别为19、2975、23和2838种(表2)从表2可 分别装于网袋,放于密封干燥器(加入过饱和的KCl以看出,Ⅱ优998贮藏前后(S3与S4)2倍差异以上的 溶液,25℃,相对湿度85%,预处理3d:转移至蛋白平均为28.33个(4个下调,2433个上调):对照 已经平衡好的干燥器中(加入过饱和的KC溶液,40博优998贮藏前后(S1与S2)2倍差异以上的蛋白19个 ℃,相对湿度83%)处理8d:再置于干燥器(加入过(平均767个上调,113个下调)。不同耐贮藏能力 饱和MgCl2溶液,20℃,相对湿度33%)干燥3d,密种子贮藏前后的差异蛋白质变化较大。贮藏前S1与 封,贮藏于-20℃的冰箱,备用 S3的差异蛋白为2975个,其中S3中丰度高的差异蛋 1.2.4种子自然老化处理 白质仅有275个,而对照S1中丰度高的差异蛋白较 参照GAO等的方法,将收获的水稻种子分别 多,为27个。贮藏后比较S2与S4,与贮藏前的结果 用网袋装好,于自然条件贮藏2年后取样,测定发 相反,不耐贮藏的Ⅱ优998老化种子中丰度高的差异 蛋白为19.33个,多于S2中的 1不同水稻种子贮藏前后蛋白质组TRAQ鉴定结 1.2.5种子发芽率的测定 Table I ITRAQ analysis results of different rice seeds before 称取干燥后的种子,每个处理15g,充分吸水 12h。倒掉多余水分后,将种子置于底部垫有2层发 二级谱图( Total Spect 545722 芽纸的发芽皿中进行萌发(每盒发芽皿100粒)。萌发 经质量控制后的谱图( Spectra) 100688 时采用1500kx光照培养箱(12h光照,12h黑暗) 肽段( Peptide) 保持发芽纸湿润且无积水。统计萌发7d的发芽率 特有肽段序列 Unique Peptide 74651 蛋白质( Protein) 次重复。 13数据处理 表2差异蛋白数量统讠 able 2 The amount of differentially expressed proteins 采用 Perseus软件进行差异蛋白数据处理与统 比较类型 蛋白数 下调蛋白数 计分析12。根据蛋白丰度差异显著性筛选出不同类 SI与S2 S与S3 2.75 型的差异蛋白,当蛋白丰度差异倍数达到2倍以上 s2与S4 19.33 且P<0.05时,视为差异蛋白。 运用 KOBAS20进行KEGG( Kyoto Encyclopedia 表中数据为3次重 复的平均值 of Genes and genomes)通路( pathway)富集分析时第 46 卷 第 5 期 杨天姝等 外源蛋白合成抑制剂对杂交水稻种子耐贮藏能力的影响 503 1.2.2 田间制种及种子寿命调控剂处理 参照吴玉坤等[9]的方法进行田间制种，灌浆期 适时喷施多效唑。在种子收获前12 d或喷施“九二 〇”后7 d，分别喷施外源蛋白质合成抑制剂农用链 霉素、春雷霉素和广谱性农药咪鲜胺等调控剂。以 喷施清水为对照。 1.2.3 种子人工老化处理 参照刘军等[10]和CHEN等[11]的方法进行种子人 工老化处理。 老化处理前准备3个密封的干燥器，其中1个加 入过饱和MgCl2溶液，置于20 ℃人工气候箱或者烘 箱，其余2个各加入过饱和的KCl溶液，分别置于25 ℃和40 ℃人工气候箱或者烘箱。将收获的水稻种子 分别装于网袋，放于密封干燥器(加入过饱和的KCl 溶液，25 ℃，相对湿度85%)，预处理3 d；转移至 已经平衡好的干燥器中(加入过饱和的KCl溶液，40 ℃，相对湿度83%)处理8 d；再置于干燥器(加入过 饱和MgCl2溶液，20 ℃，相对湿度33%)干燥3 d，密 封，贮藏于–20 ℃的冰箱，备用。 1.2.4 种子自然老化处理 参照GAO等[2]的方法，将收获的水稻种子分别 用网袋装好，于自然条件贮藏2年后取样，测定发 芽率。 1.2.5 种子发芽率的测定 称取干燥后的种子，每个处理15 g，充分吸水 12 h。倒掉多余水分后，将种子置于底部垫有2层发 芽纸的发芽皿中进行萌发(每盒发芽皿100粒)。萌发 时采用15 000 lx光照培养箱(12 h光照，12 h黑暗)， 保持发芽纸湿润且无积水。统计萌发7 d的发芽率。 3次重复。 1.3 数据处理 采用Perseus软件进行差异蛋白数据处理与统 计分析[12]。根据蛋白丰度差异显著性筛选出不同类 型的差异蛋白，当蛋白丰度差异倍数达到2倍以上， 且P＜0.05时，视为差异蛋白。 运用KOBAS 2.0进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路(pathway)富集分析[13]。 以所有鉴定到的蛋白为背景，对不同类型的差异蛋 白进行KEGG富集度分析，采用KOBAS的富集模块 计算不同KEGG通路的富集情况。 采用Excel 2007进行数据处理与分析；运用 Sigma Plot绘图。 2 结果与分析 2.1 不同种子贮藏前后的差异蛋白质鉴定 利用MASCOT共鉴定出二级谱图545 722个，特 有肽段序列74 651个，5 210个蛋白质(表1)。使用 Perseus软件进行统计分析，共鉴定出100个差异表 达蛋白质(DEP)。其中，不同比较方案的平均差异 蛋白分别为19、29.75、23和28.33种(表2)。从表2可 以看出，Ⅱ优998贮藏前后(S3与S4)2倍差异以上的 蛋白平均为28.33个(4个下调，24.33个上调)；对照 博优998贮藏前后(S1与S2)2倍差异以上的蛋白19个 (平均7.67个上调，11.33个下调)。不同耐贮藏能力 种子贮藏前后的差异蛋白质变化较大。贮藏前S1与 S3的差异蛋白为29.75个，其中S3中丰度高的差异蛋 白质仅有2.75个，而对照S1中丰度高的差异蛋白较 多，为27个。贮藏后比较S2与S4，与贮藏前的结果 相反，不耐贮藏的II优998老化种子中丰度高的差异 蛋白为19.33个，多于S2中的。 表1 不同水稻种子贮藏前后蛋白质组iTRAQ鉴定结果 Table 1 ITRAQ analysis results of different rice seeds before and after storage 类 别 数量/个 二级谱图(Total Spectra) 545 722 经质量控制后的谱图(Spectra) 100 688 肽段(Peptide) 86 956 特有肽段序列(Unique Peptide) 74 651 蛋白质(Protein) 5 210 表2 差异蛋白数量统计 Table 2 The amount of differentially expressed proteins 比较类型 上调蛋白数 下调蛋白数 S1 与 S2 7.67 11.33 S1 与 S3 2.75 27.00 S2 与 S4 19.33 3.67 S3 与 S4 24.33 4.00 表中数据为3次重复的平均值