《湖南农业大学学报（自然科学版）》：外源蛋白合成抑制剂对杂交水稻种子耐贮藏能力的影响

湖南农业大学学报(自然科学版)2020,46(5):501-506DO1:10.13331/ cnki, jhau.2020.05001 Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences) 引用格式: 杨天姝,高家东,戴彰言,贝锦龙,张琪,陈中健,刘军,付华,陈光辉.外源蛋白合成抑制剂对杂交水 稻种子耐贮藏能力的影响[,湖南农业大学学报(自然科学版),2020,46(5):501-506 YANG TS, GAO JD, DAI Z Y, BEI J L, ZHANG Q, CHEN Z J, LIU J, FU H, CHEN G H. Effects of exogenous protein synthesis inhibitors on hybrid rice seed storability]. Journal of Hunan Agricultural Univer Sciences),2020,46(5).501-506. 投稿网址:htp/ b hunau. edu.cn 外源蛋白合成抑制剂对杂交水稻种子耐贮藏能力的影响 杨天姝123,高家东23,戴彰言2,贝锦龙23,张琪23,陈中健23,刘军23,付华4,陈光辉 (1湖南农业大学农学院,湖南长沙410128:2广东省农作物种质资源保存与利用重点实验室广东广州510640: 3广东省农业科学院农业生物基因研究中心,广东广州510640:4广东省农业科学院水稻研究所,广东广州 510640) 摘要:以不耐贮藏杂交水稻Ⅱ优998种子及博优998(对照)种子为材料,采用门RAQ定量蛋白质组学的方法 鉴定2种不同耐贮藏能力种子贮藏前后的差异蛋白,共鉴定出5210个蛋白,其中差异显著的蛋白100个:Ⅱ优 998种子在贮藏期间的差异蛋白数量显著高于对照种子的差异蛋白数;通过 Pathway显著性富集的方法,确定差 异蛋白参与的主要代谢途径是 Ribosome途径:Ⅱ优98种子在自然条件贮藏期间有大量的核糖体蛋白变化差异 表明蛋白质生物合成可能与种子耐贮藏能力有关。灌浆期利用3种外源蛋白合成抑制剂(农用链霉素、春雷霉素和 广谱性农药咪鲜胺)喷施种子,结果表明,喷施农用链霉素可以提高杂交水稻种子自然条件下的耐贮藏能力。 关键词:水稻:种子;耐贮藏能力:核糖体蛋白:外源蛋白合成抑制剂:发芽率 中图分类号:S511.093 文献标志码:A文章编号:1007-1032(20205-0501-06 Effects of exogenous protein synthesis inhibitors on hybrid rice seed storability YANG Tianshu'2,, GAO Jiadong 2 3, DAI Zhangyan?2, BEI Jinglong23, ZHANG Qi2, CHEN Zhongjian, LIU Jun23, FU Hua", CHEN Guanghui' (1. College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory for Crop Germplasm Resources Preservation and Utilization, Guangzhou, Guangdong 51 China; 3. Agro-biological Gene Research ngdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou, 510640, China; 4. Rice Research uangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China) Abstract: In this study, a quantitative proteomics of iTRAQ was conducted for rice seeds before and after 24-month natural storage on two hy brid rice cultivars, II You 998 with low storability and the control Boyou 998. More than 5 210 proteins were identified, of which 100 differentially expressed protein(DEP)were significant different. Interestingly, the amount of differentially expressed proteins in the storage period of the seeds with poor storability was significantly higher than that of the control seeds. Furthermore, ribosome pathway was determined to be the main metabolic pathway involved in regulation of seed storability by pathway significant enrichment. Our data showed that more ribosomal 收稿日期:2019-11-04 修回日期:2019-12-23 基金项目:国家自然科学基金项目(31871716、31371715):广东省科技项目(2018B020202004、2019KJ06):广州市科技项目(20190902000 201807010114) 作者简介:杨天姝(1993-),女,黑龙江哈尔滨人,硕士研究生,主要从事种子科学与技术研究,1290989730@ qq com:#共同第一作者 高家东(177一),男,湖南永州人,助理研究员,主要从事种子生物学研究, gaoyao26@139com;#共同第一作者,戴彰言(1985), 男,广东广州人,助理研究员,主要从事生物信息学研究, baizhangyan@ aerogen ac cn:·通信作者,付华,副研究员,主要从 事水稻分子育种研究,13825164071@139com;*通信作者,陈光辉,博士,教授,主要从事种子科学与技术研究,cgh68@163.com

湖南农业大学学报(自然科学版) 2020, 46(5):501–506. DOI:10.13331/j.cnki.jhau.2020.05.001 Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences) 引用格式： 杨天姝，高家东，戴彰言，贝锦龙，张琪，陈中健，刘军，付华，陈光辉．外源蛋白合成抑制剂对杂交水 稻种子耐贮藏能力的影响[J]．湖南农业大学学报(自然科学版)，2020，46(5)：501–506． YANG T S, GAO J D, DAI Z Y, BEI J L, ZHANG Q, CHEN Z J, LIU J, FU H, CHEN G H. Effects of exogenous protein synthesis inhibitors on hybrid rice seed storability[J]. Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(5): 501–506. 投稿网址：http://xb.hunau.edu.cn 外源蛋白合成抑制剂对杂交水稻种子耐贮藏能力的影响 杨天姝 1,2,3，高家东 2,3#，戴彰言 2,3#，贝锦龙 2,3，张琪 2,3，陈中健 2,3，刘军 2,3，付华 4*，陈光辉 1* (1.湖南农业大学农学院，湖南 长沙 410128；2.广东省农作物种质资源保存与利用重点实验室 广东 广州 510640； 3.广东省农业科学院农业生物基因研究中心，广东 广州 510640；4.广东省农业科学院水稻研究所，广东 广州 510640) 摘 要：以不耐贮藏杂交水稻 II 优 998 种子及博优 998(对照)种子为材料，采用 iTRAQ 定量蛋白质组学的方法， 鉴定 2 种不同耐贮藏能力种子贮藏前后的差异蛋白，共鉴定出 5 210 个蛋白，其中差异显著的蛋白 100 个；II 优 998 种子在贮藏期间的差异蛋白数量显著高于对照种子的差异蛋白数；通过 Pathway 显著性富集的方法，确定差 异蛋白参与的主要代谢途径是 Ribosome 途径；II 优 998 种子在自然条件贮藏期间有大量的核糖体蛋白变化差异， 表明蛋白质生物合成可能与种子耐贮藏能力有关。灌浆期利用 3 种外源蛋白合成抑制剂(农用链霉素、春雷霉素和 广谱性农药咪鲜胺)喷施种子，结果表明，喷施农用链霉素可以提高杂交水稻种子自然条件下的耐贮藏能力。 关 键 词：水稻；种子；耐贮藏能力；核糖体蛋白；外源蛋白合成抑制剂；发芽率 中图分类号：S511.093 文献标志码：A 文章编号：1007−1032(2020)05−0501−06 Effects of exogenous protein synthesis inhibitors on hybrid rice seed storability YANG Tianshu1,2,3, GAO Jiadong2,3#, DAI Zhangyan2,3#, BEI Jinglong2,3, ZHANG Qi2,3, CHEN Zhongjian2,3, LIU Jun2,3, FU Hua4*, CHEN Guanghui1* (1.College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China;2.Guangdong Provincial Key Laboratory for Crop Germplasm Resources Preservation and Utilization, Guangzhou, Guangdong 510640, China; 3.Agro-biological Gene Research Center, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou, Guangdong 510640, China; 4.Rice Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou, Guangdong 510640, China) Abstract: In this study, a quantitative proteomics of iTRAQ was conducted for rice seeds before and after 24-month natural storage on two hybrid rice cultivars, II You 998 with low storability and the control Boyou 998. More than 5 210 proteins were identified, of which 100 differentially expressed protein (DEP) were significant different. Interestingly, the amount of differentially expressed proteins in the storage period of the seeds with poor storability was significantly higher than that of the control seeds. Furthermore, ribosome pathway was determined to be the main metabolic pathway involved in regulation of seed storability by pathway significant enrichment. Our data showed that more ribosomal                                                              收稿日期：2019–11–04 修回日期：2019–12–23 基金项目：国家自然科学基金项目(31871716、31371715)；广东省科技项目(2018B020202004、2019KJ106)；广州市科技项目(201909020001、 201807010114) 作者简介：杨天姝(1993—)，女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，主要从事种子科学与技术研究，1290989730@qq.com；#共同第一作者， 高家东(1977—)，男，湖南永州人，助理研究员，主要从事种子生物学研究，gaogao126@139.com；#共同第一作者，戴彰言(1985—)， 男，广东广州人，助理研究员，主要从事生物信息学研究，daizhangyan@agrogene.ac.cn；*通信作者，付华，副研究员，主要从 事水稻分子育种研究，13825164071@139.com；*通信作者，陈光辉，博士，教授，主要从事种子科学与技术研究，cgh68@163.com

502 湖南农业大学学报(自然科学版)htp/ b hunau.edu. cn 2020年10月 proteins were synthesized in the seeds which were not resistant to storage, suggesting that protein biosynthesis might be related to the storage tolerance of seeds. And, the germination percentages of hybrid rice seeds treated with different ogenous protein synthesis inhibitors during the filling stage significantly varied after 2 years storage under natural conditions. Our study showed that treatment of agro-streptomycin, during the filling stage could effectively enhance rice seed storability under natural storage conditions Keywords: Or=a sativa, seed, storability; ribosomal protein, exogenous protein synthesis inhibitors germination percentage 种子是遗传物质的载体,也是植物种质资源长加入5倍体积的冷丙酮,于-20℃过夜,沉降蛋白 期保存和物种多样性保存的重要材料。由于种子生4℃8000g离心20min;收集沉淀,干燥后,加入 产的不确定性,常需要对种子进行短期贮藏,但水约50μLTAB溶解蛋白,超声15min:加入胰蛋白 稻种子在南方高温高湿条件下容易劣变而丧失活酶 Trypsin Gold酶与蛋白的质量比为l:20),37℃ 力,对农业生产造成巨大损失-2 酶解,过夜。 种子耐贮藏能力受遗传、种子发育期间的环境 参照YANG等的方法进行iRAQ定量蛋白质 条件及贮藏条件等因素影响可。长期以来,国内组学分析。 外主要通过工程技术途径(如低温低湿技术)解决种 采用 Applied Biosystems的4- plex itRAQ分别 子安全贮藏问题,但即使使用低温冷库,也无法从标记酶解后的肽段,将少量标记样品混合,用质谱 根本上解决种子老化劣变引起的种子活力下降与仪( Thermo Orbitrap Fusion)测定肽段标记的效率。 寿命丧失问题:因此,了解相应的调控机制,寻标记检测无异常后,再将全部的标记样品等量混 找更有效的调控方法,提升种子的耐贮藏能力已成合。参照说明书,通过C1SPE柱( CI8 Cartridge Solid 为研究的热点 Phase extraction)去除已标记肽段混合液中的盐离 本研究中,采用 ITRAQ定量蛋白质组学技术子。利用 Thermo rslc3000仪器结合 XterraMs c 获得差异蛋白,探索蛋白质的生物合成与杂交稻种柱(3.5um,21mmx150mm, Waters对混合后的肽 子耐贮藏能力的关系,旨在筛选能够有效延长杂交段进行预分离,分级为12个组分。对每个组分进行 稻种子耐贮藏能力的外源调控产品 液相串联质谱①C-MS/MS)分析,基本条件如下: 高效液相色谱仪, Thermo Scientific RSLC Nano 1材料与方法 3000;富集柱, ThermoPepMap u- precolumn(5um, 1.1材料 300m×5mm);分析柱, PepMap C1反相纳升柱(3 以不耐贮藏的杂交稻Ⅱ优9g种子为材料,以生um,75um×150mm, Dionex):主要有机相梯度, 产中大面积应用的相对耐贮藏的博优98种子为对4%~90%乙腈(含01%甲酸)洗脱13min:流速,300 照。2种材料均来自广东省金稻种业有限公司。 nL/min;上样量,1μg;质谱仪, ThermoOrbitrap Fusion;喷雾电压,1.9kV:离子传输管温度,275 12方法 ℃:扫描模式,正离子;碰撞能量,40%HCD:分 1.2.1种子胚 iTRAQ定量蛋白质组学分析 辨率设置,一级120000m/2200),二级30000m 首先参照GAO等P的方法提取种子胚蛋白质,200:母离子扫描范围:m=350~1550:子离子扫 然后开展蛋白质酶解和质谱检测 描范围,自动。对质谱下机的原始文件进行峰识别, 将保存于冰箱的蛋白质干粉溶于适量裂解缓得到峰列表。利用蛋白质数据库检索软件 MASCOT 冲液(7mo尿素、2mo硫脲、4% CHAPS、40进行肽段及蛋白质的鉴定,比较各蛋白在各样品之 mmo/ L Tris-HC,pH85),200W超声15min。4℃间相对含量的关系,从而获得一些重要的蛋白。 30000离心20min,得上清液:用 Bradford试剂盒样品编号:贮藏前博优998种子用S1表示,贮 测量蛋白浓度。加入DTT,使其浓度为10mmoL,藏后博优998种子用S2表示;贮藏前Ⅱ优98种子用 于37℃保持4h:冷却至室温,加入0.55moL的碘S3表示,贮藏后Ⅱ优998种子用S4表示。每个样本3 乙酰胺,使其浓度为55 mmol/L,避光反应1h;再次重复

502 湖南农业大学学报(自然科学版) http://xb.hunau.edu.cn 2020 年 10 月 proteins were synthesized in the seeds which were not resistant to storage, suggesting that protein biosynthesis might be related to the storage tolerance of seeds. And, the germination percentages of hybrid rice seeds treated with different exogenous protein synthesis inhibitors during the filling stage significantly varied after 2 years storage under natural conditions. Our study showed that treatment of agro-streptomycin, during the filling stage could effectively enhance rice seed storability under natural storage conditions. Keywords: Oryza sativa; seed; storability; ribosomal protein; exogenous protein synthesis inhibitors; germination percentage 种子是遗传物质的载体，也是植物种质资源长 期保存和物种多样性保存的重要材料。由于种子生 产的不确定性，常需要对种子进行短期贮藏，但水 稻种子在南方高温高湿条件下容易劣变而丧失活 力，对农业生产造成巨大损失[1–2]。 种子耐贮藏能力受遗传、种子发育期间的环境 条件及贮藏条件等因素影响[1–6]。长期以来，国内 外主要通过工程技术途径(如低温低湿技术)解决种 子安全贮藏问题，但即使使用低温冷库，也无法从 根本上解决种子老化劣变引起的种子活力下降与 寿命丧失问题[7]；因此，了解相应的调控机制，寻 找更有效的调控方法，提升种子的耐贮藏能力已成 为研究的热点。 本研究中，采用 iTRAQ 定量蛋白质组学技术 获得差异蛋白，探索蛋白质的生物合成与杂交稻种 子耐贮藏能力的关系，旨在筛选能够有效延长杂交 稻种子耐贮藏能力的外源调控产品。 1 材料与方法 1.1 材料 以不耐贮藏的杂交稻II优998种子为材料，以生 产中大面积应用的相对耐贮藏的博优998种子为对 照。2种材料均来自广东省金稻种业有限公司。 1.2 方法 1.2.1 种子胚 iTRAQ 定量蛋白质组学分析 首先参照GAO等[2]的方法提取种子胚蛋白质， 然后开展蛋白质酶解和质谱检测。 将保存于冰箱的蛋白质干粉溶于适量裂解缓 冲液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、40 mmol/L Tris–HCl，pH 8.5)，200 W超声15 min。4 ℃ 30 000g离心20 min，得上清液；用Bradford试剂盒 测量蛋白浓度。加入DTT，使其浓度为10 mmol/L， 于37 ℃保持4 h；冷却至室温，加入0.55 mol/L的碘 乙酰胺，使其浓度为55 mmol/L，避光反应1 h；再 加入5倍体积的冷丙酮，于–20 ℃过夜，沉降蛋白， 4 8 000 ℃ g离心20 min；收集沉淀，干燥后，加入 约50 µL TEAB溶解蛋白，超声15 min；加入胰蛋白 酶Trypsin Gold(酶与蛋白的质量比为1∶20)，37 ℃ 酶解，过夜。 参照YANG等[8]的方法进行iTRAQ定量蛋白质 组学分析。 采用Applied Biosystems的4–plex iTRAQ分别 标记酶解后的肽段，将少量标记样品混合，用质谱 仪(Thermo Orbitrap Fusion)测定肽段标记的效率。 标记检测无异常后，再将全部的标记样品等量混 合。参照说明书，通过C18SPE柱(C18 Cartridge Solid Phase Extraction)去除已标记肽段混合液中的盐离 子。利用Thermo RSLC 3000仪器结合XterraMs C18 柱(3.5 µm, 2.1 mm×150 mm, Waters)对混合后的肽 段进行预分离，分级为12个组分。对每个组分进行 液相串联质谱(LC−MS/MS)分析，基本条件如下： 高效液相色谱仪，Thermo Scientific RSLC Nano 3000；富集柱，ThermoPepMap u–precolumn(5 µm, 300 µm×5 mm)；分析柱，PepMap C18反相纳升柱(3 µm, 75 µm×150 mm, Dionex)；主要有机相梯度， 4%～90%乙腈(含0.1%甲酸)洗脱135 min；流速，300 nL/min；上样量，1 µg；质谱仪，ThermoOrbitrap Fusion；喷雾电压，1.9 kV；离子传输管温度，275 ℃；扫描模式，正离子；碰撞能量，40% HCD；分 辨率设置，一级120 000(m/z 200)，二级30 000(m/z 200)；母离子扫描范围：m/z 350～1550；子离子扫 描范围，自动。对质谱下机的原始文件进行峰识别， 得到峰列表。利用蛋白质数据库检索软件MASCOT 进行肽段及蛋白质的鉴定，比较各蛋白在各样品之 间相对含量的关系，从而获得一些重要的蛋白。 样品编号：贮藏前博优998种子用S1表示，贮 藏后博优998种子用S2表示；贮藏前Ⅱ优998种子用 S3表示，贮藏后Ⅱ优998种子用S4表示。每个样本3 次重复

第46卷第5期杨天姝等外源蛋白合成抑制剂对杂交水稻种子耐贮藏能力的影响 1.2.2田间制种及种子寿命调控剂处理 以所有鉴定到的蛋白为背景,对不同类型的差异蛋 参照吴玉坤等的方法进行田间制种,灌浆期白进行KEG富集度分析,采用 KOBAS的富集模块 适时喷施多效唑。在种子收获前12d或喷施“九二计算不同KEGG通路的富集情况。 O”后7d,分别喷施外源蛋白质合成抑制剂农用链 采用 Excel2007进行数据处理与分析:运用 霉素、春雷霉素和广谱性农药咪鲜胺等调控剂。以 Sigma plot绘图 喷施清水为对照 2结果与分析 1.2.3种子人工老化处理 参照刘军等和CHEN等的方法进行种子21不同种子贮藏前后的差异蛋白质鉴定 工老化处理。 利用 MASCOT共鉴定出二级谱图545722个,特 老化处理前准备3个密封的干燥器,其中1个加有肽段序列74651个,5210个蛋白质(表1)。使用 入过饱和MgCl溶液,置于20℃人工气候箱或者烘 Perseus件进行统计分析,共鉴定出100个差异表 箱,其余2个各加入过饱和的KC溶液,分别置于25达蛋白质(DEP)。其中,不同比较方案的平均差异 ℃和40℃人工气候箱或者烘箱。将收获的水稻种子蛋白分别为19、2975、23和2838种(表2)从表2可 分别装于网袋,放于密封干燥器(加入过饱和的KCl以看出,Ⅱ优998贮藏前后(S3与S4)2倍差异以上的 溶液,25℃,相对湿度85%,预处理3d:转移至蛋白平均为28.33个(4个下调,2433个上调):对照 已经平衡好的干燥器中(加入过饱和的KC溶液,40博优998贮藏前后(S1与S2)2倍差异以上的蛋白19个 ℃,相对湿度83%)处理8d:再置于干燥器(加入过(平均767个上调,113个下调)。不同耐贮藏能力 饱和MgCl2溶液,20℃,相对湿度33%)干燥3d,密种子贮藏前后的差异蛋白质变化较大。贮藏前S1与 封,贮藏于-20℃的冰箱,备用 S3的差异蛋白为2975个,其中S3中丰度高的差异蛋 1.2.4种子自然老化处理 白质仅有275个,而对照S1中丰度高的差异蛋白较 参照GAO等的方法,将收获的水稻种子分别 多,为27个。贮藏后比较S2与S4,与贮藏前的结果 用网袋装好,于自然条件贮藏2年后取样,测定发 相反,不耐贮藏的Ⅱ优998老化种子中丰度高的差异 蛋白为19.33个,多于S2中的 1不同水稻种子贮藏前后蛋白质组TRAQ鉴定结 1.2.5种子发芽率的测定 Table I ITRAQ analysis results of different rice seeds before 称取干燥后的种子,每个处理15g,充分吸水 12h。倒掉多余水分后,将种子置于底部垫有2层发 二级谱图( Total Spect 545722 芽纸的发芽皿中进行萌发(每盒发芽皿100粒)。萌发 经质量控制后的谱图( Spectra) 100688 时采用1500kx光照培养箱(12h光照,12h黑暗) 肽段( Peptide) 保持发芽纸湿润且无积水。统计萌发7d的发芽率 特有肽段序列 Unique Peptide 74651 蛋白质( Protein) 次重复。 13数据处理 表2差异蛋白数量统讠 able 2 The amount of differentially expressed proteins 采用 Perseus软件进行差异蛋白数据处理与统 比较类型 蛋白数 下调蛋白数 计分析12。根据蛋白丰度差异显著性筛选出不同类 SI与S2 S与S3 2.75 型的差异蛋白,当蛋白丰度差异倍数达到2倍以上 s2与S4 19.33 且P<0.05时,视为差异蛋白。 运用 KOBAS20进行KEGG( Kyoto Encyclopedia 表中数据为3次重 复的平均值 of Genes and genomes)通路( pathway)富集分析时

第 46 卷 第 5 期 杨天姝等 外源蛋白合成抑制剂对杂交水稻种子耐贮藏能力的影响 503 1.2.2 田间制种及种子寿命调控剂处理 参照吴玉坤等[9]的方法进行田间制种，灌浆期 适时喷施多效唑。在种子收获前12 d或喷施“九二 〇”后7 d，分别喷施外源蛋白质合成抑制剂农用链 霉素、春雷霉素和广谱性农药咪鲜胺等调控剂。以 喷施清水为对照。 1.2.3 种子人工老化处理 参照刘军等[10]和CHEN等[11]的方法进行种子人 工老化处理。 老化处理前准备3个密封的干燥器，其中1个加 入过饱和MgCl2溶液，置于20 ℃人工气候箱或者烘 箱，其余2个各加入过饱和的KCl溶液，分别置于25 ℃和40 ℃人工气候箱或者烘箱。将收获的水稻种子 分别装于网袋，放于密封干燥器(加入过饱和的KCl 溶液，25 ℃，相对湿度85%)，预处理3 d；转移至 已经平衡好的干燥器中(加入过饱和的KCl溶液，40 ℃，相对湿度83%)处理8 d；再置于干燥器(加入过 饱和MgCl2溶液，20 ℃，相对湿度33%)干燥3 d，密 封，贮藏于–20 ℃的冰箱，备用。 1.2.4 种子自然老化处理 参照GAO等[2]的方法，将收获的水稻种子分别 用网袋装好，于自然条件贮藏2年后取样，测定发 芽率。 1.2.5 种子发芽率的测定 称取干燥后的种子，每个处理15 g，充分吸水 12 h。倒掉多余水分后，将种子置于底部垫有2层发 芽纸的发芽皿中进行萌发(每盒发芽皿100粒)。萌发 时采用15 000 lx光照培养箱(12 h光照，12 h黑暗)， 保持发芽纸湿润且无积水。统计萌发7 d的发芽率。 3次重复。 1.3 数据处理 采用Perseus软件进行差异蛋白数据处理与统 计分析[12]。根据蛋白丰度差异显著性筛选出不同类 型的差异蛋白，当蛋白丰度差异倍数达到2倍以上， 且P＜0.05时，视为差异蛋白。 运用KOBAS 2.0进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路(pathway)富集分析[13]。 以所有鉴定到的蛋白为背景，对不同类型的差异蛋 白进行KEGG富集度分析，采用KOBAS的富集模块 计算不同KEGG通路的富集情况。 采用Excel 2007进行数据处理与分析；运用 Sigma Plot绘图。 2 结果与分析 2.1 不同种子贮藏前后的差异蛋白质鉴定 利用MASCOT共鉴定出二级谱图545 722个，特 有肽段序列74 651个，5 210个蛋白质(表1)。使用 Perseus软件进行统计分析，共鉴定出100个差异表 达蛋白质(DEP)。其中，不同比较方案的平均差异 蛋白分别为19、29.75、23和28.33种(表2)。从表2可 以看出，Ⅱ优998贮藏前后(S3与S4)2倍差异以上的 蛋白平均为28.33个(4个下调，24.33个上调)；对照 博优998贮藏前后(S1与S2)2倍差异以上的蛋白19个 (平均7.67个上调，11.33个下调)。不同耐贮藏能力 种子贮藏前后的差异蛋白质变化较大。贮藏前S1与 S3的差异蛋白为29.75个，其中S3中丰度高的差异蛋 白质仅有2.75个，而对照S1中丰度高的差异蛋白较 多，为27个。贮藏后比较S2与S4，与贮藏前的结果 相反，不耐贮藏的II优998老化种子中丰度高的差异 蛋白为19.33个，多于S2中的。 表1 不同水稻种子贮藏前后蛋白质组iTRAQ鉴定结果 Table 1 ITRAQ analysis results of different rice seeds before and after storage 类 别 数量/个 二级谱图(Total Spectra) 545 722 经质量控制后的谱图(Spectra) 100 688 肽段(Peptide) 86 956 特有肽段序列(Unique Peptide) 74 651 蛋白质(Protein) 5 210 表2 差异蛋白数量统计 Table 2 The amount of differentially expressed proteins 比较类型 上调蛋白数 下调蛋白数 S1 与 S2 7.67 11.33 S1 与 S3 2.75 27.00 S2 与 S4 19.33 3.67 S3 与 S4 24.33 4.00 表中数据为3次重复的平均值

04 湖南农业大学学报(自然科学版)htp/ b hunau.edu. cn 2020年10月 22不同种子贮藏后的差异蛋白质比较 表3列出了Ⅱ优998种子在贮藏前后(S3与S4)出 现的代表性差异蛋白。从表3可以看出,在Ⅱ优998 采用KEGG通路( Pathway)显著性富集分析上述 种子中,丰度较高的蛋白绝大部分是核糖体蛋白 差异表达蛋白参与的最主要代谢途径和信号转导而这些核糖体蛋白的绝大部分87)是贮藏后种子 途径。在所有的比较类型中,3种比较(S1与S3、S2(s4)中丰度高的差异蛋白。说明Ⅱ优9种子在自然 与S4、S3与S4)都仅有1条通路具有统计学意义,且老化过程中大量的核糖体蛋白丰度上调,有较多的 均为 Ribosome途径,而S1与S2的比较也是 Ribosome蛋白质合成代谢 途径排名第 表3Ⅱ优998种子在贮藏前后出现的代表性差异蛋白 Table 3 A list of differential expressed proteins with high abundance in the poor storability seeds before and after storage(S3-s4) 蛋白名称 序号蛋白ID 中文名称 英文名称 1Q840W3推测核糖体蛋白L32 2Q75GN640s核糖体蛋白S26 40S ribosomal protein $26 60S核糖体蛋白L7a-1 推测核糖体蛋白L34 Putative ribosomal protein L34 5Q6k8U8推测核糖体蛋白L35A Putative ribosomal protein L35A 6Q7XM1O04g0376000蛋白 Os04g0376000 protein 7P4919940s核糖体蛋白S8 8Q6K4T160s核糖体蛋白L27 60S ribosomal protein L27 9A2Y0T460s核糖体蛋白L10-2(蛋白质QM1) S ribosomal protein L10-2 ( Protein QMi) 10Q8LH9740S核糖体蛋白S6 OS ribosomal protein S6 11Q84MQ4推测60S核糖体蛋白L27a-050390408300蛋白)60 S ribosomal protein127a-3, putative, expressed (推测的核糖体蛋白L2 (Os03g0408300 protein)(Putative ribosomal protein L27a) 12Q5WMY3细胞质核糖体蛋白L18(O805g0155100蛋白) otein) 13Q10LN7推测60S核糖体蛋白L18(O503g034110联白)6 S ribosomal protein L18. putative, expressed (Os03g0341 100 protein 14Q8GsE9O07g0613200蛋白(推测60S核糖体蛋白L27a)O07g0613200 protein( Putative60 s ribosomal protein L27a) 15Q7XSA640S核糖体蛋白S14(OJ026139蛋白) 40S ribosomal protein S14(OJ000126_ 13.9 protein) (Os02g0534800 protein) YZ2O08g0559200蛋白(推测的40s核糖体蛋白S250508g05592 PS25B) (RPS25B) 17A6MZM940s核糖体蛋白S13 18Q69UI140s核糖体蛋白Sl3-2 40S ribosomal protein S13-2 19Q2QNF360s核糖体蛋白L2(推测表达的60S核糖体蛋白L2)60 S ribosomal protein L2 I protein L2, Os12g0567700蛋白质) putative, expressed)(Os12g 20A2ZB0040S核糖体蛋白S16 40S ribosomal protein S16 21Q10LR6核糖体蛋白L19 22Q6K85340sS核糖体蛋白S30 40S ribosomal protein $30 23Q7XEQ3推测的40S核糖体蛋白S17-4(0s10g0411800蛋白)40 S ribosomal protein S7-4, putative, expressed 24Q7XUC9组蛋白H4 Histone H4 23灌浆期外源调控剂对人工老化种子发芽率的显著差异,表明各调控剂处理对种子初始发芽率的 影响不明显 影响 人工老化8d后,外源蛋白质合成抑制剂春雷霉 从图1可以看出,种子入库时,不同外源调控素处理的种子发芽率可达80%,显著高于对照的发 剂处理的种子发芽率都为96%左右,处理与对照无芽率,比对照的高565%,表明春雷霉素能够提高

504 湖南农业大学学报(自然科学版) http://xb.hunau.edu.cn 2020 年 10 月 2.2 不同种子贮藏后的差异蛋白质比较 采用KEGG通路(Pathway)显著性富集分析上述 差异表达蛋白参与的最主要代谢途径和信号转导 途径。在所有的比较类型中，3种比较(S1与S3、S2 与S4、S3与S4)都仅有1条通路具有统计学意义，且 均为Ribosome途径，而S1与S2的比较也是Ribosome 途径排名第一。 表3列出了Ⅱ优998种子在贮藏前后(S3与S4)出 现的代表性差异蛋白。从表3可以看出，在II优998 种子中，丰度较高的蛋白绝大部分是核糖体蛋白， 而这些核糖体蛋白的绝大部分(87%)是贮藏后种子 (S4)中丰度高的差异蛋白。说明Ⅱ优998种子在自然 老化过程中大量的核糖体蛋白丰度上调，有较多的 蛋白质合成代谢。 表3 Ⅱ优998种子在贮藏前后出现的代表性差异蛋白 Table 3 A list of differential expressed proteins with high abundance in the poor storability seeds before and after storage (S3–S4) 蛋白名称 序号 蛋白ID 中文名称 英文名称 1 Q84QW3 推测核糖体蛋白 L32 Putative ribosomal protein L32 2 Q75GN6 40S 核糖体蛋白 S26 40S ribosomal protein S26 3 P35685 60S 核糖体蛋白 L7a–1 60S ribosomal protein L7a–1 4 Q6ZD96 推测核糖体蛋白 L34 Putative ribosomal protein L34 5 Q6K8U8 推测核糖体蛋白 L35A Putative ribosomal protein L35A 6 Q7XMJ1 Os04g0376000 蛋白 Os04g0376000 protein 7 P49199 40S 核糖体蛋白 S8 40S ribosomal protein S8 8 Q6K4T1 60S 核糖体蛋白 L27 60S ribosomal protein L27 9 A2Y0T4 60S 核糖体蛋白 L10–2(蛋白质 QM1) 60S ribosomal protein L10–2 (Protein QM1) 10 Q8LH97 40S 核糖体蛋白 S6 40S ribosomal protein S6 11 Q84MQ4 推测 60S 核糖体蛋白 L27a–3(Os03g0408300 蛋白) (推测的核糖体蛋白 L27a) 60S ribosomal protein L27a–3, putative, expressed (Os03g0408300 protein) (Putative ribosomal protein L27a) 12 Q5WMY3 细胞质核糖体蛋白 L18(Os05g0155100 蛋白) Cytoplasmic ribosomal protein L18 (Os05g0155100 protein) 13 Q10LN7 推测 60S 核糖体蛋白 L18(Os03g0341100 蛋白) 60S ribosomal protein L18, putative, expressed (Os03g0341100 protein) 14 Q8GSE9 Os07g0613200 蛋白(推测 60S 核糖体蛋白 L27a) Os07g0613200 protein (Putative 60S ribosomal protein L27a) 15 Q7XSA6 40S 核糖体蛋白 S14(OJ000126_13.9 蛋白) (Os02g0534800 蛋白质) 40S ribosomal protein S14 (OJ000126_13.9 protein) (Os02g0534800 protein) 16 Q6YZI2 Os08g0559200 蛋白(推测的 40S 核糖体蛋白 S25 (RPS25B) Os08g0559200 protein (Putative 40S ribosomal protein S25 (RPS25B) 17 A6MZM9 40S 核糖体蛋白 S13 40S ribosomal protein S13 18 Q69UI1 40S 核糖体蛋白 S13–2 40S ribosomal protein S13–2 19 Q2QNF3 60S 核糖体蛋白 L2(推测表达的 60S 核糖体蛋白 L2) (Os12g0567700 蛋白质) 60S ribosomal protein L2 (60S ribosomal protein L2, putative, expressed)(Os12g0567700 protein) 20 A2ZB00 40S 核糖体蛋白 S16 40S ribosomal protein S16 21 Q10LR6 核糖体蛋白 L19 Ribosomal protein L19 22 Q6K853 40S 核糖体蛋白 S30 40S ribosomal protein S30 23 Q7XEQ3 推测的 40S 核糖体蛋白 S17–4(Os10g0411800 蛋白) 40S ribosomal protein S17–4, putative, expressed (Os10g0411800 protein) 24 Q7XUC9 组蛋白 H4 Histone H4 2.3 灌浆期外源调控剂对人工老化种子发芽率的 影响 从图1可以看出，种子入库时，不同外源调控 剂处理的种子发芽率都为96%左右，处理与对照无 显著差异，表明各调控剂处理对种子初始发芽率的 影响不明显。 人工老化8 d后，外源蛋白质合成抑制剂春雷霉 素处理的种子发芽率可达80%，显著高于对照的发 芽率，比对照的高5.65%，表明春雷霉素能够提高

第46卷第5期 杨天姝等外源蛋白合成抑制剂对杂交水稻种子耐贮藏能力的影响 505 种子人工老化后的出芽能力。与对照相比,农用链蛋白(如谷氧还蛋白,乙二醛酶等)、DNA损伤修复 霉素处理的发芽率略有增加,咪酰胺处理的发芽率蛋白以及Lea蛋白等,且不耐贮藏种子在贮藏过程 有所下降,但均与对照无显著差异 中的差异蛋白数量远远高于相对耐贮藏种子的。本 研究采用RAQ技术鉴定出5200多个总蛋白,同 咪酰胺 样发现种子自然贮藏过程中不耐贮藏种子的差异 蛋白数高于耐贮藏种子中的数量,2种方法鉴定结 果基本一致。 本研究中,发现不耐贮藏种子在贮藏过程中有 核糖体蛋白的剧烈变化,表明蛋白质的生物合成可 人工老化8d的种子 “·”表示差异显著(P∞005) 能与种子贮藏寿命有关。基于蛋白质翻译合成可能 图1不同处理种子人工老化前后的发芽率 与种子贮藏寿命有关的结果,推测不耐贮藏种子在 Fig. I Germination percentages of the rice seeds before and 老化期间可能有较多的蛋白质合成。本研究中,通 after artificial aging 过喷施外源蛋白合成抑制剂来调控水稻种子的耐 24灌浆期外源调控剂处理对自然老化种子发芽贮藏能力,发现农用链霉素能够提髙自然贮藏2年 率的影响 的种子的发芽率,即提高了种子的耐贮藏能力,但 从图2可以看出,自然贮藏2年后,农用链霉素其作用机理还需进一步研究 处理的种子的发芽率(7625%极显著高于对照处理参考文献: 的(6679%);春雷霉素处理的种子发芽率与对照无 []傅家瑞.种子生理M].北京:科学出版社,1985. 显著差异:咪酰胺处理的种子的发芽率仅为 FUJR. Seed Physiology[M]. Beijing: Science Press, 43.50%,极显著低于对照种子的发芽率。表明农用 链霉素处理可以有效提高种子的耐贮藏能力 2]GAO了D,FUH,zHOUⅹQ,etal ■农用链霉素 proteomic analysis of seed embryo proteins associated 春C素 with seed storability in rice(Oryza sativa L ) during natural aging]. Plant Physiology and biochemistry 2016,103:31 3 VENTURA L, DONA M, MACOVEI A, et al Understanding the molecular pathways associated with seed vigor[]. Plant Physiology and Biochemistry, 2012 老化前种子 自然贮藏2年的种子 60:196206 “”表示差异极显著(P<001 14 WALTERS C, WHEELER L M, GROTENHUIS J M 图2不同处理种子自然老化前后的发芽率 Longevity of seeds stored in a genebank: species Fig 2 Germination percentages of the rice seeds before and characteristics]. Seed Science Research, 2005, 15(1): after natural aging 5 YAN SJ, HUANG WJ, GAO J D, et al. Comparative 3结论与讨论 metabolomic analysis of seed metabolites associated with seed storability in rice(Oryza sativa L )during natural 为探索水稻种子劣变过程中响应各种胁迫的 aging]. Plant Physiology and Biochemistry, 2018, 127 调控机制,本课题组前期选取不同耐贮藏能力的杂590-598. 交稻种子(用自然贮藏2年后种子发芽率衡量种子6杨亚平,姜孝成,陈良碧,等水稻种子老化的生理机 的耐贮藏能力),利用基于双向电泳的蛋白质组学方 制叮湖南农业大学学报(自然科学版),2008,34(3) 265-269 法对种胚的蛋白质差异进行比较,发现与自然贮藏 YANG Y P, JIANG X C, Chen L B, et al. Study on 老化过程种子耐贮藏有关的蛋白包括氧化还原调节 a m m in aging of rice seeds]

第 46 卷 第 5 期 杨天姝等 外源蛋白合成抑制剂对杂交水稻种子耐贮藏能力的影响 505 种子人工老化后的出芽能力。与对照相比，农用链 霉素处理的发芽率略有增加，咪酰胺处理的发芽率 有所下降，但均与对照无显著差异。 老化前种子 人工老化 8 d 的种子 “*”表示差异显著(P<0.05)。 图 1 不同处理种子人工老化前后的发芽率 Fig.1 Germination percentages of the rice seeds before and after artificial aging 2.4 灌浆期外源调控剂处理对自然老化种子发芽 率的影响 从图2可以看出，自然贮藏2年后，农用链霉素 处理的种子的发芽率(76.25%)极显著高于对照处理 的(66.79%)；春雷霉素处理的种子发芽率与对照无 显著差异；咪酰胺处理的种子的发芽率仅为 43.50%，极显著低于对照种子的发芽率。表明农用 链霉素处理可以有效提高种子的耐贮藏能力。 老化前种子 自然贮藏 2 年的种子 “**”表示差异极显著(P<0.01)。 图 2 不同处理种子自然老化前后的发芽率 Fig.2 Germination percentages of the rice seeds before and after natural aging 3 结论与讨论 为探索水稻种子劣变过程中响应各种胁迫的 调控机制，本课题组前期选取不同耐贮藏能力的杂 交稻种子(用自然贮藏 2 年后种子发芽率衡量种子 的耐贮藏能力)，利用基于双向电泳的蛋白质组学方 法对种胚的蛋白质差异进行比较，发现与自然贮藏 老化过程种子耐贮藏有关的蛋白包括氧化还原调节 蛋白(如谷氧还蛋白，乙二醛酶等)、DNA 损伤修复 蛋白以及 Lea 蛋白等，且不耐贮藏种子在贮藏过程 中的差异蛋白数量远远高于相对耐贮藏种子的[2]。本 研究采用 iTRAQ 技术鉴定出 5 200 多个总蛋白，同 样发现种子自然贮藏过程中不耐贮藏种子的差异 蛋白数高于耐贮藏种子中的数量，2 种方法鉴定结 果基本一致。 本研究中，发现不耐贮藏种子在贮藏过程中有 核糖体蛋白的剧烈变化，表明蛋白质的生物合成可 能与种子贮藏寿命有关。基于蛋白质翻译合成可能 与种子贮藏寿命有关的结果，推测不耐贮藏种子在 老化期间可能有较多的蛋白质合成。本研究中，通 过喷施外源蛋白合成抑制剂来调控水稻种子的耐 贮藏能力，发现农用链霉素能够提高自然贮藏 2 年 的种子的发芽率，即提高了种子的耐贮藏能力，但 其作用机理还需进一步研究。 参考文献： [1] 傅家瑞．种子生理[M]．北京：科学出版社，1985． FU J R．Seed Physiology[M]．Beijing：Science Press， 1985． [2] GAO J D，FU H，ZHOU X Q，et al．Comparative proteomic analysis of seed embryo proteins associated with seed storability in rice(Oryza sativa L.) during natural aging[J]．Plant Physiology and Biochemistry， 2016，103：31–44． [3] VENTURA L ， DONÀ M ， MACOVEI A ， et al. Understanding the molecular pathways associated with seed vigor[J]．Plant Physiology and Biochemistry，2012， 60：196–206． [4] WALTERS C，WHEELER L M，GROTENHUIS J M. Longevity of seeds stored in a genebank ： species characteristics[J]．Seed Science Research，2005，15(1)： 1–20． [5] YAN S J，HUANG W J，GAO J D，et al．Comparative metabolomic analysis of seed metabolites associated with seed storability in rice(Oryza sativa L.)during natural aging[J]．Plant Physiology and Biochemistry，2018，127： 590–598． [6] 杨亚平, 姜孝成, 陈良碧, 等. 水稻种子老化的生理机 制[J]. 湖南农业大学学报(自然科学版)，2008，34(3)： 265–269. YANG Y P，JIANG X C，CHEN L B，et al. Study on physiological mechanism in aging of rice seeds[J]. 100 90 80 70 60 发芽率/% 100 90 80 70 60 50 40 发芽率/% 对照 CK 春雷霉素 农用链霉素 咪酰胺 农用链霉素 对照 CK 春雷霉素 咪酰胺

06 湖南农业大学学报(自然科学版)htp/ b hunau.edu. cn 2020年10月 Journal of Hunan Agricultural University(Natural LIU J, HUANGSZ, FUJR. Synthesis of heat shock Sciences),2008,34(3):265-269. protein in maize seed embryo with different vigor during 7]卢新雄,辛霞,尹广鹍,等.中国作物种质资源安全 germination]. Acta Botanica Sinica, 2000, 42(3) 保存理论与实践.植物遗传资源学报,2019,20(1): 253-257 [11 CHEN HH, CHU P, ZHOU Y L, et al. Overexpression LU XX, XIN X, YINGK, et al. Theory and practice of AtoGGl, a dna glycosylase/AP lyase, enhances seed of the safe conservation of crop germplasm resources in longevity and abiotic stress tolerance in Arabidopsis] China]. Journal of Plant Genetic Resources, 2019 Journal of Experimental Botany, 2012, 63(11):4107- 20(1):1-10 4121 8 YANG Q S, WU JH, LI C Y, et al. Quantitative [12 TYANOVA S, COX J. Perseus: a bioinformatics platform proteomic analysis reveals that antioxidation mechanisms for integrative analysis of proteomics data in cancer contribute to cold tolerance in plantain( Musa paradisiaca research[M/ON STECHOW L. Cancer Systems L. ABB Group) seedlings]. Molecular Cellular Biology. Methods in Molecular Biology. New Yorl Proteomics,2012,11(12):1853-1869 Humana Press, 2018: 133-148 9]吴玉坤,陈国荣,黄健文,等,优质高产杂交稻新组[13XIEC, MAOXZ, HUANG JJ,etal. KOBAS2.0:a 合天优98制种技术[杂交水稻,2005,20(1):31-32 web server for annotation and identification of enriched WU Y K, CHEN R, HUANG J W, et al. Seed pathways and diseases]. Nucleic Acids Research, 2011 production techniques of Tianyou 998, a new good 39 suppl2):W316-W322 quality and high yield hybrid rice combination!]. Hybrid Rice,2005,20(1):31-32 责任编辑:毛友纯 [0]刘军,黄上志,傅家瑞.不同活力玉米种子胚萌发期 英文编辑:柳正 间热激蛋白的合成[.植物学报,2000,42(3):253-257

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