1期 赵璐等:复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防效果测定及拮抗菌株鉴定 211 变性5min;94℃变性30s,51退火40s,72℃延伸的种属类别。 90s,30个循环;72℃延伸7min,最后于4℃保存。 1.3数据分析 拮抗细菌菌株的分子鉴定:采用gB基因序列 试验数据采用SPSS240软件进行统计分析,应 进行鉴定。按照DNA抽提试剂盒说明书提取DNA用最小显著差数(LSD)法进行差异显著性检验。 并检测,对具有特异性DNA条带的样品进行PCR 扩增,引物为UPlf(5′- GAAGTCATCATGACCGT 2结果与分析 TCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3)和UP2r2.1KMM对苹果再植病害的生防效果 (5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNAC 盆栽试验结果表明,KMM处理对尖孢镰刀菌 RTCNGCRTCNGTCAT-3)。25山反应体系:DNA菌株HS2引起的苹果再植病害防治效果达8778%, 模板1μL、10 umol/L UPIf0.5uL、10mol/LUP2r显著优于化学对照(恶霉灵)及空白对照(表1)。在 0.5L、5U|L7aq酶0.3μ、10× Buffer(缓冲液)对再植海棠苗的生长促进方面,KMM处理的叶面 25μ、10mmol/ L dNTP0.5u,补dHO至25L。积为10.36cm2,显著优于空白对照和恶霉灵对照的 扩增程序:95℃预变性4min;95℃变性1min,58°℃366cm2和443cm2,是后二者的2.83倍和2.34倍。 退火lmin,72℃延伸2min,进行34个循环;最后KMM处理的海棠苗株高可达1412cm,茎粗为 72℃延伸10min,4C临时保存。 020cm,分别为空白对照的1.51倍和200倍,为恶 经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,然后分别将具有霉灵对照的1.53倍和200倍,均差异显著;KMM处 IS序列目的条带、gB阳性克隆条带的PCR产物理的干、鲜重均显著高于空白对照和恶霉灵对照,分 送北京华大基因有限公司进行测序。将测序所得序别是空白对照的574倍和521倍,恶霉灵对照的 列与 Gen Bank中所有已报道的序列进行 BLAST比467倍和429倍,后二者之间在植株的叶面积、株 对,根据比对结果获得相似性高的菌株序列,用高、茎粗、干重及鲜重等生长指标上均无显著差异。 Mega6软件以邻接法构建系统发育树,确定该菌株表明KMM对海棠苗的生长促进作用显著。 表1木美土里复合微生物菌剂对再植盆栽八棱海棠的防病促生作用 Table 1 The control and growth-promoting effect of Kimidori microbial manure against replant disease of Malus robusta in pot experiment 处理 叶面积株高(cm)茎粗(cm)干重(g)鲜重死亡率(%)防治效果(%) Treatment (cm2) (g) Mortality Control Leaf area diameter ght Fresh weight seedlings efficacy 空白对照 Blank cK366±0.20b9.33026b0.10±0.00b0.27±0.0lb0.140.05b63.33±248a 木美土里KMM10.36+0.35a14.12±045a020±0.00a1.544009a0.7340.06a7.37+0.54b87.78±5.74a 恶霉灵 Hymexazol4430.18b9.24024b0.10±000b0.33±0.02b0.17±0.05b5926±364a5.550.25b 表中数据为平均数±标准误。同列不同字母表示经LSD法检验在P<005水平差异显著。 Data are mean+SE. Different let ters in the same column indicate significant difference at P<0.05 level by lsd test. 22KMM菌悬液对菌株HS2的拮抗效果 过8074%(表2),下一步将对这3株菌进行生理生 KKM中的微生物菌群能有效抑制尖孢镰刀菌化特性测定及种类鉴定。 菌株HS2的生长,抑制率可达68.59%,与恶霉灵对2.4拮抗菌株的鉴定 照处理的6681%无显著差异,且形成03cm的抑菌2..1形态学鉴定结果 圈,说明抑菌效果较好。 菌株MMIL-1在PDA培养基上菌落为白色,菌 23KMM可培养微生物的拮抗效果 丝粗而长,长势迅速,菌落较大,分生孢子近球形至 从KKM中共分离到7个真菌分离物和3个细椭圆形,成熟分生孢子呈浅绿色,大小为25~3.5pm 菌分离物,可培养真菌和细菌的含量分别为1.70×2.1~3.0μm(图1-A~C),表现出木霉属的特征。菌株 10°CFU/g和1.84×10CFU/g。对分离微生物的抑BM-01(图1-D)和BM03(图1-E)的菌落表面粗糙, 菌试验结果表明,所有可培养微生物对尖孢镰刀菌典型的火山口状,不透明,污白色或微黄色,较干燥 菌株HS2均有抑制效果,抑制率为488%%~822%,边缘不整齐;菌株BM-01(图1-F)和BM-03(图1-G 其中菌株MMTL-1、BM0和BM-03的抑制率均超均为革兰氏阳性菌,菌体杆状,芽孢较小,椭圆或柱1期 赵 璐等：复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防效果测定及拮抗菌株鉴定 211 变性5 min；94℃变性30 s，51℃退火40 s，72℃延伸 90 s，30个循环；72℃延伸7 min，最后于4℃保存。 拮抗细菌菌株的分子鉴定：采用gyrB基因序列 进行鉴定。按照DNA抽提试剂盒说明书提取DNA 并检测，对具有特异性 DNA 条带的样品进行 PCR 扩增，引物为 UP1f（5ʹ -GAAGTCATCATGACCGT￾TCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3ʹ）和 UP2r （5ʹ -AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNAC - RTCNGCRTCNGTCAT-3ʹ）。25 μL 反应体系：DNA 模板 1 μL、10 μmol/L UP1f 0.5 μL、10 μmol/L UP2r 0.5 μL、5 U/μL Taq 酶 0.3 μL、10×Buffer（缓冲液） 2.5 μL、10 mmol/L dNTP 0.5 μL，补ddH2O至25 μL。 扩增程序：95℃预变性4 min；95℃变性1 min，58℃ 退火 1 min，72℃延伸 2 min，进行 34 个循环；最后 72℃延伸10 min，4℃临时保存。 经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，然后分别将具有 ITS序列目的条带、gyrB阳性克隆条带的PCR产物 送北京华大基因有限公司进行测序。将测序所得序 列与GenBank中所有已报道的序列进行BLAST比 对，根据比对结果获得相似性高的菌株序列，用 Mega 6软件以邻接法构建系统发育树，确定该菌株 的种属类别。 1.3 数据分析 试验数据采用SPSS 24.0软件进行统计分析，应 用最小显著差数（LSD）法进行差异显著性检验。 2 结果与分析 2.1 KMM对苹果再植病害的生防效果 盆栽试验结果表明，KMM 处理对尖孢镰刀菌 菌株HS2引起的苹果再植病害防治效果达87.78%， 显著优于化学对照（恶霉灵）及空白对照（表1）。在 对再植海棠苗的生长促进方面，KMM 处理的叶面 积为10.36 cm2 ，显著优于空白对照和恶霉灵对照的 3.66 cm2 和 4.43 cm2 ，是后二者的 2.83 倍和 2.34 倍。 KMM 处理的海棠苗株高可达 14.12 cm，茎粗为 0.20 cm，分别为空白对照的 1.51 倍和 2.00 倍，为恶 霉灵对照的1.53倍和2.00倍，均差异显著；KMM处 理的干、鲜重均显著高于空白对照和恶霉灵对照，分 别是空白对照的 5.74 倍和 5.21 倍，恶霉灵对照的 4.67 倍和 4.29 倍，后二者之间在植株的叶面积、株 高、茎粗、干重及鲜重等生长指标上均无显著差异。 表明KMM对海棠苗的生长促进作用显著。 表1 木美土里复合微生物菌剂对再植盆栽八棱海棠的防病促生作用 Table 1 The control and growth-promoting effect of Kimidori microbial manure against replant disease of Malus robusta in pot experiment 处理 Treatment 空白对照Blank CK 木美土里KMM 恶霉灵Hymexazol 叶面积 （cm2 ） Leaf area 3.66±0.20 b 10.36±0.35 a 4.43±0.18 b 株高（cm） Plant height 9.33±0.26 b 14.12±0.45 a 9.24±0.24 b 茎粗（cm） Stem diameter 0.10±0.00 b 0.20±0.00 a 0.10±0.00 b 干重（g） Dry weight 0.27±0.01 b 1.54±0.09 a 0.33±0.02 b 鲜重 （g） Fresh weight 0.14±0.05 b 0.73±0.06 a 0.17±0.05 b 死亡率（%） Mortality of seedlings 63.33±2.48 a 7.37±0.54 b 59.26±3.64 a 防治效果（%） Control efficacy - 87.78±5.74 a 5.55±0.25 b 表中数据为平均数±标准误。同列不同字母表示经LSD法检验在P<0.05水平差异显著。Data are mean±SE. Different let￾ters in the same column indicate significant difference at P<0.05 level by LSD test. 2.2 KMM菌悬液对菌株HS2的拮抗效果 KKM中的微生物菌群能有效抑制尖孢镰刀菌 菌株 HS2 的生长，抑制率可达 68.59%，与恶霉灵对 照处理的66.81%无显著差异，且形成0.3 cm的抑菌 圈，说明抑菌效果较好。 2.3 KMM可培养微生物的拮抗效果 从 KKM 中共分离到 7 个真菌分离物和 3 个细 菌分离物，可培养真菌和细菌的含量分别为 1.70× 104 CFU/g 和 1.84×106 CFU/g。对分离微生物的抑 菌试验结果表明，所有可培养微生物对尖孢镰刀菌 菌株HS2均有抑制效果，抑制率为48.89%~82.22%， 其中菌株MMTL-1、BM-01和BM-03的抑制率均超 过 80.74%（表 2），下一步将对这 3 株菌进行生理生 化特性测定及种类鉴定。 2.4 拮抗菌株的鉴定 2.4.1 形态学鉴定结果 菌株MMTL-1在PDA培养基上菌落为白色，菌 丝粗而长，长势迅速，菌落较大，分生孢子近球形至 椭圆形，成熟分生孢子呈浅绿色，大小为2.5~3.5 μm× 2.1~3.0 μm（图1-A~C），表现出木霉属的特征。菌株 BM-01（图1-D）和BM-03（图1-E）的菌落表面粗糙， 典型的火山口状，不透明，污白色或微黄色，较干燥， 边缘不整齐；菌株BM-01（图1-F）和BM-03（图1-G） 均为革兰氏阳性菌，菌体杆状，芽孢较小，椭圆或柱