210 植物保护学报 46卷 厂;RXZ型智能人工气候箱,宁波江南仪器厂。 有9mL灭菌水的小烧杯中,制成稀释倍数为10-的 1.2方法 稀释液,如此依次稀释到10。取103、10-4、105和 1.2.1KMM对苹果再植病害的生防效果测定 10°这4个梯度的稀释液各20μ分别涂布到马丁 尖孢镰刀菌菌株HS2在PDA培养基上扩繁后氏平板和BPDA平板上,每个稀释度3次重复。将 在菌落边缘打取3个直径为6mm的菌饼接种到马丁氏平板和BPDA平板分别置于25℃和37℃恒 CMA培养基上并于25℃培养,待菌丝长满基质时温培养箱中黑暗培养。 取出,放到通风橱中风干后备用。挑选长势一致的 真菌的纯化:挑取马丁氏平板培养10d左右的 海棠幼苗,按质量比1%接种病原菌尖孢镰刀菌菌真菌菌落尖端菌丝,接种到新的马丁氏平板上,待长 株HS2,每处理3次重复,每次重复9棵幼苗。接种岀单菌落后通过反复多次挑取尖端菌丝,进行纯化 1周后分别用KKM和恶霉灵进行处理。KMM处理培养,直到得到纯的单菌落。细菌的纯化:将在BP 方法为按质量比5%的用量施到口径16cmx高14cmDA平板培养7d左右的细菌菌落进行多次划线培 的花盆中,然后浇水1000mL;恶霉灵原药按照说养,获得单菌落。将纯化后的菌株进行编号,并于 明书稀释4000倍后取1000mL均匀浇灌于花盆中4℃保存备用 作为化学对照,以仅浇水1000mL作为空白对照,1.2.4纯化菌株的拮抗效果测定 参照 Krumholz et al(2009)致病力分级标准进行调 将1.2.3中分离纯化的菌株,真菌采用平板对峙 査,分级标准为:0级:健康植株,无症状;级:整株法、细菌采用滤纸片法分别与病原菌尖孢镰刀菌菌 无变黄叶片;级:全株1/3及以下叶片变黄干枯;株HS2进行对峙培养,每个处理3次重复,以只接种 3级:1/3<全株叶片变黄干枯比例≤1/2;4级:1/2<全菌株HS2的PDA平板作为对照,待对照菌落长满培 株叶片变黄干枯比例≤3/4;5级:全株3/4以上叶片干养皿,测量对峙病原菌半径,计算抑制率,计算方法 枯或死亡。待对照处理植株病级达到3级后统计各同1.2,2,同时测量抑菌带宽度。对于抑制率髙于 处理海棠苗的株高、茎粗、重量、叶面积等生长指标,8000%的菌株进一步开展种类鉴定。 以明确KKM对苹果再植病害的防治效果及对再植1.2.5拮抗菌株的种类鉴定 海棠的促生作用。死亡率=Σ死亡植株/∑调查植 形态特征鉴定:观察PDA平板上拮抗菌株的菌 株×100%;病情指数=Σ(病级x该病级株数)(最高丝形态及生长情况,在显微镜下观察5个视野,共测 病级κ调查株数)×100;防治效果=(对照病情指数-量100个分生孢子;观察生长于BPDA平板上的拮 处理病情指数)对照病情指数×100% 抗细菌菌落形态,鉴定拮抗细菌群体形态特征,并通 1.2.2KMM菌悬液对菌株HS2的拮抗效果测定 过革兰氏染色观察拮抗细菌个体形态特征,参考东 在25℃下培养病原菌尖孢镰刀菌菌株HS2,5d秀珠和蔡妙英(2001)方法进行鉴定。 后在菌落边缘打取直径为6mm的菌盘,在PDA平 生理生化特征测定:参考东秀珠和蔡妙英(2001) 板一侧接入病原菌菌盘。称取10gKKM加入到盛方法进行测定。采用硝酸盐还原试验、耐盐性培养 有90mL灭菌水的三角瓶中,摇匀、静置,取上清液(2%、5%、%、10%)试验、明胶液化、淀粉水解试验 即为KKM菌悬液。在另一侧相距病原菌菌盘4cm乙酰甲基甲醇试验(VP反应)、碳水化合物利用试 处放置1个牛津杯,其中加入200μKMM菌悬液。验(D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇)等进行拮抗 将培养皿置于25℃黑暗恒温培养箱中培养,以分别细菌的生理生化测定 放置200μ的无菌水、恶霉灵原药10倍稀释液的牛 拮抗真菌菌株的分子鉴定:采用转录间隔区 津杯作为空白对照和化学对照,每个处理4次重复。(ITS)序列进行鉴定。刮取覆盖PDA平板上培养的 待空白对照病原菌菌丝长满皿时,测量各处理的菌真菌新鲜菌丝,按照基因组抽提试剂盒说明书进行 落半径和抑菌带宽度,计算KMM菌悬液对菌株DNA提取。采用ITS通用引物ITS1(5- TCCGTAG HS2的抑制率。抑制率=(对照菌落半径-处理菌落 GTGAACCTGCGG-3)和IS4(5°- TCCTCCGCT 半径)对照菌落半径×100%。 TATTGATATGC-3)进行PCR扩增。25μ反应体 123KMM可培养微生物的分离和纯化 系:10× Buffer(缓冲液)2.5山、25mmol/ L MeCI2 称取1gKMM加入到盛有100mL灭菌水的三角20μ、25 mmol/L dNTP15比、5 U/uL Tag0.2uL、 瓶中,将三角瓶置于摇床上以120rmin振荡30min,10 umol/L ITS12.0L、10 umol/L ITS42.0uL、DNA 得到稀释倍数为102的悬浮液,吸取1mL加入到装模板2.0μL,补ddHO至25μ。扩增程序:94℃预210 植 物 保 护 学 报 46卷 厂；RXZ 型智能人工气候箱，宁波江南仪器厂。 1.2 方法 1.2.1 KMM对苹果再植病害的生防效果测定 尖孢镰刀菌菌株 HS2 在 PDA 培养基上扩繁后 在菌落边缘打取 3 个直径为 6 mm 的菌饼接种到 CMA 培养基上并于 25℃培养，待菌丝长满基质时 取出，放到通风橱中风干后备用。挑选长势一致的 海棠幼苗，按质量比 1% 接种病原菌尖孢镰刀菌菌 株HS2，每处理3次重复，每次重复9棵幼苗。接种 1周后分别用KKM和恶霉灵进行处理。KMM处理 方法为按质量比5%的用量施到口径16 cm×高14 cm 的花盆中，然后浇水 1 000 mL；恶霉灵原药按照说 明书稀释4 000倍后取1 000 mL均匀浇灌于花盆中 作为化学对照，以仅浇水 1 000 mL 作为空白对照， 参照 Krumholz et al.（2009）致病力分级标准进行调 查，分级标准为：0级：健康植株，无症状；1级：整株 无变黄叶片；2 级：全株 1/3 及以下叶片变黄干枯； 3级：1/3<全株叶片变黄干枯比例≤1/2；4级：1/2<全 株叶片变黄干枯比例≤3/4；5级：全株3/4以上叶片干 枯或死亡。待对照处理植株病级达到3级后统计各 处理海棠苗的株高、茎粗、重量、叶面积等生长指标， 以明确KKM对苹果再植病害的防治效果及对再植 海棠的促生作用。死亡率=∑死亡植株/∑调查植 株×100%；病情指数=∑（病级×该病级株数）（/ 最高 病级×调查株数）×100；防治效果=（对照病情指数- 处理病情指数）/对照病情指数×100%。 1.2.2 KMM菌悬液对菌株HS2的拮抗效果测定 在25℃下培养病原菌尖孢镰刀菌菌株HS2，5 d 后在菌落边缘打取直径为6 mm的菌盘，在PDA平 板一侧接入病原菌菌盘。称取10 g KKM加入到盛 有90 mL灭菌水的三角瓶中，摇匀、静置，取上清液 即为KKM菌悬液。在另一侧相距病原菌菌盘4 cm 处放置1个牛津杯，其中加入200 μL KMM菌悬液。 将培养皿置于25℃黑暗恒温培养箱中培养，以分别 放置200 μL的无菌水、恶霉灵原药10倍稀释液的牛 津杯作为空白对照和化学对照，每个处理4次重复。 待空白对照病原菌菌丝长满皿时，测量各处理的菌 落半径和抑菌带宽度，计算 KMM 菌悬液对菌株 HS2的抑制率。抑制率=（对照菌落半径-处理菌落 半径）/对照菌落半径×100%。 1.2.3 KMM可培养微生物的分离和纯化 称取1 g KMM加入到盛有100 mL灭菌水的三角 瓶中，将三角瓶置于摇床上以120 r/min振荡30 min， 得到稀释倍数为10-2 的悬浮液，吸取1 mL加入到装 有9 mL灭菌水的小烧杯中，制成稀释倍数为10-3 的 稀释液，如此依次稀释到 10-6 。取 10-3 、10-4 、10-5 和 10-6 这 4 个梯度的稀释液各 20 μL 分别涂布到马丁 氏平板和 BPDA 平板上，每个稀释度 3 次重复。将 马丁氏平板和 BPDA 平板分别置于 25℃和 37℃恒 温培养箱中黑暗培养。 真菌的纯化：挑取马丁氏平板培养10 d左右的 真菌菌落尖端菌丝，接种到新的马丁氏平板上，待长 出单菌落后通过反复多次挑取尖端菌丝，进行纯化 培养，直到得到纯的单菌落。细菌的纯化：将在BP￾DA 平板培养 7 d 左右的细菌菌落进行多次划线培 养，获得单菌落。将纯化后的菌株进行编号，并于 4℃保存备用。 1.2.4 纯化菌株的拮抗效果测定 将1.2.3中分离纯化的菌株，真菌采用平板对峙 法、细菌采用滤纸片法分别与病原菌尖孢镰刀菌菌 株HS2进行对峙培养，每个处理3次重复，以只接种 菌株HS2的PDA平板作为对照，待对照菌落长满培 养皿，测量对峙病原菌半径，计算抑制率，计算方法 同 1.2.2，同时测量抑菌带宽度。对于抑制率高于 80.00%的菌株进一步开展种类鉴定。 1.2.5 拮抗菌株的种类鉴定 形态特征鉴定：观察PDA平板上拮抗菌株的菌 丝形态及生长情况，在显微镜下观察5个视野，共测 量 100 个分生孢子；观察生长于 BPDA 平板上的拮 抗细菌菌落形态，鉴定拮抗细菌群体形态特征，并通 过革兰氏染色观察拮抗细菌个体形态特征，参考东 秀珠和蔡妙英（2001）方法进行鉴定。 生理生化特征测定：参考东秀珠和蔡妙英（2001） 方法进行测定。采用硝酸盐还原试验、耐盐性培养 （2%、5%、7%、10%）试验、明胶液化、淀粉水解试验、 乙酰甲基甲醇试验（V-P反应）、碳水化合物利用试 验（D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇）等进行拮抗 细菌的生理生化测定。 拮抗真菌菌株的分子鉴定：采用转录间隔区 （ITS）序列进行鉴定。刮取覆盖PDA平板上培养的 真菌新鲜菌丝，按照基因组抽提试剂盒说明书进行 DNA提取。采用ITS通用引物ITS1（5ʹ-TCCGTAG￾GTGAACCTGCGG - 3ʹ）和 ITS4（5ʹ - TCCTCCGCT￾TATTGATATGC-3ʹ）进行 PCR 扩增。25 μL 反应体 系：10×Buffer（缓冲液）2.5 μL、25 mmol/L MgCl2 2.0 μL、2.5 mmol/L dNTP 1.5 μL、5 U/μL Taq 0.2 μL、 10 μmol/L ITS1 2.0 μL、10 μmol/L ITS4 2.0 μL、DNA 模板 2.0 μL，补 ddH2O 至 25 μL。扩增程序：94℃预