1期 赵璐等:复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防效果测定及拮抗菌株鉴定 我国是全球最大的苹果种植国,自1992年产量 木美土里复合微生物菌剂( Kimidori microbial 超过美国之后,一直排名世界第一,种植面积和产量 manure,KMM)是一种复合型微生物生物肥料。该 占世界苹果种植面积和产量的一半以上(刘婧,微生物菌剂在对苹果锈果病及腐烂病的防控中均表 2009;赵玉山,2014)。但我国苹果的品种和树龄结现出较好的效果(李丙智等,2013;胡清玉等,2015)。 构却并不合理,富士品种¨一家独大”,而树龄在20年但该菌剂是否能够控制苹果再植病害还缺乏系统研 以上的果园占总种植面积的60%以上(姜远茂和葛究,且该菌剂的原始菌种从国外引进,其种类组成并 顺峰,2016)。因此,近年来,我国已经开始对苹果种不明确,作用机理也缺乏报道。本课题组自2012年 植结构和品种结构进行调整,导致苹果园种植模式开始在田间测试了木美土里复合微生物菌剂对苹果 更新加快和品种更新周期缩短,受制于可耕作土地再植病害的防治效果,获得了显著的防治效果(未发 的限制,苹果再植病害已经成为生产上的重要问题。表)。因此,本研究通过盆栽试验、室内对峙及拮抗 在世界范围内,一般认为多种真菌如柱孢菌 Cylin-菌株分离鉴定,在可控条件下研究木美土里复合微 drocarpon spp.、丝核菌 Rhizoctonia spp.镰孢菌F-生物菌剂对苹果再植病害的防治效果,并明确该菌 sanlu spp、茎点霉 Phoma spp.和几种卵菌如腐霉剂中的拮抗菌株,以期为进一步研究复合微生物菌 Pythium spp.和恶疫霉 Phytophthora cactorum单独剂的防病机理奠定基础。 侵染或者复合侵染均能引起苹果再植病害( Braun 99 Mazzola,1998)。邹庆甲等(2014)对分离自河1材料与方法 北省不同地区苹果再植土壤中的21株病原真菌进1.1材料 行了鉴定,明确了镰孢菌属真菌是引起河北省苹果 供试植物和菌株:八棱海棠 Malus robusta re- 再植病害的主要致病菌,其中,尖孢镰刀菌 F oxys- hd.种子购自河北省怀来县好运八棱海棠苗木基地, 分离频率最高,致病力最强 温室条件下,在蛭石:营养土为1:1的培养基中培养 虽然土壤熏蒸剂如溴甲烷、氯化苦、棉隆等都是至4叶期;苹果再植病害主要致病菌——尖孢镰刀 控制苹果再植病害的有效药剂,但其高毒性以及对菌菌株HS2由河北农业大学植物病害流行与综合 环境的毒害导致这些化学熏蒸剂日益受到抵制,其防治实验室分离鉴定并保存(邹庆甲等,2014)。 中溴甲烷已经在世界范围内被禁用。利用生物制剂 供试肥料和药剂:木美土里复合微生物菌剂,陕 替代化学熏蒸剂防治再植病害已经得到了越来越多西枫丹百丽生物科技有限公司,其中有效活菌数≥ 的关注( Kandula et al.,2010)。日前,一些能拮抗病20亿个/g;99.99%恶霉灵( hymexazol)原药,威海韩 原真菌的菌株已被发现并用于防治苹果再植病害,孚生化药业有限公司。 如细菌中的芽胞杆菌 Bacillus spp、假单胞菌Psev 培养基:马铃薯葡萄糖琼脂( potato dextrose lomonas spp,真菌中的木霉 Trichoderma、丛枝菌根agar,PDA)培养基:马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂 真菌以及放线菌中的链霉菌 Streptomyce等(Mani-粉15g、水1000mL;马丁氏培养基: KH PO41g、 ci et al,20l5; Forge et al,206)。 Biro et al.(1998)MgSO4HO0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂15g 发现枯草芽胞杆菌B. subtilis及聚团肠杆菌 Entero-蒸馏水1000mL,此培养基1000mL加人1%孟加拉 bacter agglomerans可用来防治苹果再植病害,减轻红水溶液3.3mL,使用前临时加入1%链霉素0.03mL 某些再植病害的症状; Caska& Hudska(1993)通过牛肉膏蛋白胨( beef peptone dextrose agar,BPDA)培 温室盆栽试验发现,根部接种放射形土壤杆菌Ago-养基:牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15g、 bacterium radiobacter可以减少苹果幼树的死亡,促蒸馏水1000mL;玉米粉( corn meal agar,CMA)培 进幼树生长;刘力伟等(2016)研究发现,荧光假单胞养基:玉米粉200g、琼脂20g、蒸馏水1000mL(程 菌 Pseudomonas fluorescens菌株SS101对不同苹果丽娟和薛泉宏,2012)。 产区病原菌具有抑制作用,该菌株不但可以显著缓 试剂及仪器:真菌基因组抽提试剂盒,北京全式 解再植病害的影响,而且具有促进生长和增产的效金生物技术有限公司;细菌基因组抽提试剂盒,生工 果。综合来看,目前关于苹果再植病害的生物防治生物工程(上海)股份有限公司;10× Loading buffer、 大多停留在利用单一菌株进行防治的层面上,而且 Ex Taq,日本 TaKaRa公司;其余试剂均为国产分析 这些测试菌株绝大多数尚未获得商业化应用,还缺纯。JA1003型电子分析天平,上海精密科学仪器有 乏利用已商品化的生物菌剂防治该病害的报道。限公司;DYY4型稳压稳流电泳仪,北京六一仪器1期 赵 璐等：复合微生物菌剂对苹果再植病害的生防效果测定及拮抗菌株鉴定 209 我国是全球最大的苹果种植国，自1992年产量 超过美国之后，一直排名世界第一，种植面积和产量 占世界苹果种植面积和产量的一半以上（刘婧， 2009；赵玉山，2014）。但我国苹果的品种和树龄结 构却并不合理，富士品种“一家独大”，而树龄在20年 以上的果园占总种植面积的60%以上（姜远茂和葛 顺峰，2016）。因此，近年来，我国已经开始对苹果种 植结构和品种结构进行调整，导致苹果园种植模式 更新加快和品种更新周期缩短，受制于可耕作土地 的限制，苹果再植病害已经成为生产上的重要问题。 在世界范围内，一般认为多种真菌如柱孢菌 Cylin￾drocarpon spp.、丝核菌 Rhizoctonia spp.、镰孢菌 Fu￾sarium spp.、茎点霉 Phoma spp. 和几种卵菌如腐霉 Pythium spp. 和恶疫霉 Phytophthora cactorum 单独 侵染或者复合侵染均能引起苹果再植病害（Braun， 1995；Mazzola，1998）。邹庆甲等（2014）对分离自河 北省不同地区苹果再植土壤中的21株病原真菌进 行了鉴定，明确了镰孢菌属真菌是引起河北省苹果 再植病害的主要致病菌，其中，尖孢镰刀菌F. oxys￾porum分离频率最高，致病力最强。 虽然土壤熏蒸剂如溴甲烷、氯化苦、棉隆等都是 控制苹果再植病害的有效药剂，但其高毒性以及对 环境的毒害导致这些化学熏蒸剂日益受到抵制，其 中溴甲烷已经在世界范围内被禁用。利用生物制剂 替代化学熏蒸剂防治再植病害已经得到了越来越多 的关注（Kandula et al.，2010）。目前，一些能拮抗病 原真菌的菌株已被发现并用于防治苹果再植病害， 如细菌中的芽胞杆菌 Bacillus spp.、假单胞菌 Pseu￾domonas spp.，真菌中的木霉Trichoderma、丛枝菌根 真菌以及放线菌中的链霉菌Streptomyces等（Mani￾ci et al.，2015；Forge et al.，2016）。Biro et al.（1998） 发现枯草芽胞杆菌B. subtilis及聚团肠杆菌Entero￾bacter agglomerans可用来防治苹果再植病害，减轻 某些再植病害的症状；Catska & Hudska（1993）通过 温室盆栽试验发现，根部接种放射形土壤杆菌Agro￾bacterium radiobacter可以减少苹果幼树的死亡，促 进幼树生长；刘力伟等（2016）研究发现，荧光假单胞 菌 Pseudomonas fluorescens 菌株 SS101 对不同苹果 产区病原菌具有抑制作用，该菌株不但可以显著缓 解再植病害的影响，而且具有促进生长和增产的效 果。综合来看，目前关于苹果再植病害的生物防治 大多停留在利用单一菌株进行防治的层面上，而且 这些测试菌株绝大多数尚未获得商业化应用，还缺 乏利用已商品化的生物菌剂防治该病害的报道。 木美土里复合微生物菌剂（Kimidori microbial manure，KMM）是一种复合型微生物生物肥料。该 微生物菌剂在对苹果锈果病及腐烂病的防控中均表 现出较好的效果（李丙智等，2013；胡清玉等，2015）。 但该菌剂是否能够控制苹果再植病害还缺乏系统研 究，且该菌剂的原始菌种从国外引进，其种类组成并 不明确，作用机理也缺乏报道。本课题组自2012年 开始在田间测试了木美土里复合微生物菌剂对苹果 再植病害的防治效果，获得了显著的防治效果（未发 表）。因此，本研究通过盆栽试验、室内对峙及拮抗 菌株分离鉴定，在可控条件下研究木美土里复合微 生物菌剂对苹果再植病害的防治效果，并明确该菌 剂中的拮抗菌株，以期为进一步研究复合微生物菌 剂的防病机理奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 供试植物和菌株：八棱海棠 Malus robusta Re￾hd.种子购自河北省怀来县好运八棱海棠苗木基地， 温室条件下，在蛭石∶营养土为1∶1的培养基中培养 至4叶期；苹果再植病害主要致病菌——尖孢镰刀 菌菌株 HS2 由河北农业大学植物病害流行与综合 防治实验室分离鉴定并保存（邹庆甲等，2014）。 供试肥料和药剂：木美土里复合微生物菌剂，陕 西枫丹百丽生物科技有限公司，其中有效活菌数≥ 2.0亿个/g；99.99%恶霉灵（hymexazol）原药，威海韩 孚生化药业有限公司。 培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂 粉 15 g、水 1 000 mL；马丁氏培养基：KH2PO4 1 g、 MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、琼脂15 g、 蒸馏水1 000 mL，此培养基1 000 mL加入1%孟加拉 红水溶液3.3 mL，使用前临时加入1%链霉素0.03 mL； 牛肉膏蛋白胨（beef peptone dextrose agar，BPDA）培 养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂15 g、 蒸馏水 1 000 mL；玉米粉（corn meal agar，CMA）培 养基：玉米粉200 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL（程 丽娟和薛泉宏，2012）。 试剂及仪器：真菌基因组抽提试剂盒，北京全式 金生物技术有限公司；细菌基因组抽提试剂盒，生工 生物工程（上海）股份有限公司；10×Loading Buffer、 Ex Taq，日本TaKaRa公司；其余试剂均为国产分析 纯。JA1003型电子分析天平，上海精密科学仪器有 限公司；DYY-4型稳压稳流电泳仪，北京六一仪器