可影响反应的特异性和产率。 Taq dna聚合酶具有Mg2依赖 性,因而PCR反应对Mg2有较 高要求。Mg2浓度低时,Taq酶 活性较低:一般认为在20mM 时,Taq酶具有最大活性;更高 浓度的Mg2对Taq酶具有抑制 作用。并且会导致反应特异性降 低,一个不容忽视的问题就是 Taq酶的活性增高会降低反应 的特异性,因而市售的1aq酶 般都有现成的、含有Mg2的 缓冲液,一般为1.5mM。Mg2 本身又受到很多因素的影响,可 与EDTA或其它螯合物结合。 因此在使用高浓度的模板DNA 或过量的dNIP时,要相应增加 Mg2浓度。现在又有一种新的 观点,即退火温度越高,Mg2+ 浓度应相应增加,已有人将 Mg2浓度增至6mM。 2.2.2.2PCR循环参数 2.2.2.2.1温度和变性 变性失败是最终导致PCR 失败的一个常见原因 PCR反应循环开始,先进 行变性,将双链模板变性解离为 单链。温度是变性的条件,一般 采用94℃,2-5分钟。而时间的 长短则由模板和PCR仪来确 定,如模板欠佳或GC含量过 高,应相应延长时间。温度过高 或时间过长会对Taq酶活性和 dNTP造成损害。Taq酶可以在 这时加入,也可以在最初加好之 后进入PCR循环,即94℃变性 1分钟,退火1分钟和72℃延伸 1分钟,常规进行25~35个循环。 最后,进一步完善PCR反应可影响反应的特异性和产率。 Taq DNA 聚合酶具有 Mg2+依赖 性，因而 PCR 反应对 Mg2+有较 高要求。Mg2+浓度低时，Taq 酶 活性较低；一般认为在 2.0mM 时，Taq 酶具有最大活性；更高 浓度的 Mg2+对 Taq 酶具有抑制 作用。并且会导致反应特异性降 低，一个不容忽视的问题就是 Taq 酶的活性增高会降低反应 的特异性，因而市售的 Taq 酶 一般都有现成的、含有 Mg2+的 缓冲液，一般为 1.5mM。Mg2+ 本身又受到很多因素的影响，可 与 EDTA 或其它螯合物结合。 因此在使用高浓度的模板 DNA 或过量的 dNTP 时，要相应增加 Mg2+浓度。现在又有一种新的 观点，即退火温度越高，Mg2+ 浓度应相应增加，已有人将 Mg2+浓度增至 6mM。 2.2.2.2 PCR 循环参数 2.2.2.2.1 温度和变性 变性失败是最终导致 PCR 失败的一个常见原因 PCR 反应循环开始，先进 行变性，将双链模板变性解离为 单链。温度是变性的条件，一般 采用 94℃，2~5 分钟。而时间的 长短则由模板和 PCR 仪来确 定，如模板欠佳或 GC 含量过 高，应相应延长时间。温度过高 或时间过长会对 Taq 酶活性和 dNTP 造成损害。Taq 酶可以在 这时加入，也可以在最初加好之 后进入 PCR 循环，即 94℃变性 1 分钟，退火 1 分钟和 72℃延伸 1分钟，常规进行25~35个循环。 最后，进一步完善 PCR 反应