第四章基因 诊断技术与方 法(下) 2聚合酶链反应 1985年由美国 Cetus公司 的 Kary mullis首创了一种极为 简便和快速地能在体外进行扩 增DNA的技术,在很短时间内, 数量上仅几个拷贝的基因可放 大上百万倍,极大地提高了 DNA扩增率,这就是聚合酶链 反应( polymerase chain reaction, PCR), Mullis因此获得了1993 年诺贝尔医学奖。现在,PCR 已成为基因诊断技术中普遍应 用的技术。 2.1聚合酶链反应的基本 原理 PCR实际上是以DNA为模 板,在4种核苷酸存在的条件 下,借DNA聚合酶的作用而产 生的酶促合成反应。PCR反应 最重要的组分是引物,也就是从 模板DNA双链选取一段特定序 列再在体外合成的寡核酸链。 PCR之所以能够发生,依赖于 在加热条件下,双链DNA解离 形成单链(变性),当温度骤然 降低(复性)时,在反应环境中 的引物能特异地与这些单链相 结合,同时使4种核苷酸在 DNA聚合酶的作用下,发生以
第四章 基因 诊断技术与方 法（下） 2 聚合酶链反应 1985 年由美国 Cetus 公司 的 Kary Mullis 首创了一种极为 简便和快速地能在体外进行扩 增 DNA 的技术，在很短时间内， 数量上仅几个拷贝的基因可放 大上百万倍，极大地提高了 DNA 扩增率，这就是聚合酶链 反应(polymerase chain reaction, PCR)，Mullis 因此获得了 1993 年诺贝尔医学奖。现在，PCR 已成为基因诊断技术中普遍应 用的技术。 2.1 聚合酶链反应的基本 原理 PCR实际上是以DNA为模 板，在 4 种核苷酸存在的条件 下，借 DNA 聚合酶的作用而产 生的酶促合成反应。PCR 反应 最重要的组分是引物，也就是从 模板 DNA 双链选取一段特定序 列再在体外合成的寡核酸链。 PCR 之所以能够发生，依赖于 在加热条件下，双链 DNA 解离 形成单链（变性），当温度骤然 降低（复性）时，在反应环境中 的引物能特异地与这些单链相 结合，同时使４种核苷酸在 DNA 聚合酶的作用下，发生以
引物为起点从5→3端进行聚 合的现象,遂使DNA链不断延 伸 PCR: Polymerase Chain Reaction 30-40 cycles of 3 steps /AA①m ITITTIl I Im mITITTTTIIIllIm1 minut9℃ S m mmIT mTTIT TTMT Step 2: anealing 45 seconds54° 山D八让upmm 2 minutes72°C 八u减 only dNTP's 2.2聚合酶链反应过程 2.2.1PcR基本步骤 ①变性( denaturation):常 规采用94℃,在高温条件下使 模板DNA(待扩增DNA)氢键断 裂,解链成为单链模板:②退 火 annealing):人工合成的两个 寡聚核苷酸引物在较低温度下, 分别与单链模板DNA链形成杂 交链:③延伸( extension):在 72℃条件下,DNA聚合酶将单 核苷酸在引物3'端掺入,沿模 板5→3方向延伸,合成新的 DNA链
引物为起点从 5’→3’端进行聚 合的现象，遂使 DNA 链不断延 伸 2.2 聚合酶链反应过程 2.2.1 PCR 基本步骤 ① 变性(denaturation)：常 规采用 94℃，在高温条件下使 模板 DNA(待扩增 DNA)氢键断 裂，解链成为单链模板；② 退 火(annealing)：人工合成的两个 寡聚核苷酸引物在较低温度下， 分别与单链模板 DNA 链形成杂 交链；③ 延伸(extension)：在 72℃条件下，DNA 聚合酶将单 核苷酸在引物 3’端掺入，沿模 板 5’→3’方向延伸，合成新的 DNA 链
2.2.2PCR条件的要求和 建立 2.2.2.1PCR反应中的主 要成份 模板DNA 引物 aq dna聚合酶 PCR缓冲液 三磷酸脱氧核苷 ( dNTPs)底物 2.2.2.1.1PCR缓冲液 个标准的50~100u1反 应体系应包括: 500. 0mmol/L 100. 0mmol/L Tris·HCl(pH84) MeCl [00.0μgml 明胶或牛血清白蛋白(BSA) 4种单核苷 A(dATP+dCTP+dG TP+dTTP) 各200~250μM 2.2.2.1.1.2PCR缓冲液 PCR缓冲液是PCR扩增的 一种重要因素,尤其是Mg2+
2.2.2 PCR 条件的要求和 建立 2.2.2.1 PCR 反应中的主 要成份 模板 DNA 引物 Taq DNA 聚合酶 PCR 缓冲液 三磷酸脱氧核苷 (dNTPs) 底物 2.2.2.1.1 PCR 缓冲液 一个标准的 50~100μl 反 应体系应包括： 500.0mmol/L KCl 100.0mmol/L Tris·HCl(pH8.4) 1.5mmol/L MgCl2 [100.0μg/ml 明胶或牛血清白蛋白 (BSA)] 4 种单核苷 酸 (dATP+dCTP+dGTP+dTTP) 各 200~250μM 2.2.2.1.1.2 PCR 缓冲液 PCR 缓冲液是 PCR 扩增的 一种重要因素，尤其是 Mg2+
可影响反应的特异性和产率。 Taq dna聚合酶具有Mg2依赖 性,因而PCR反应对Mg2有较 高要求。Mg2浓度低时,Taq酶 活性较低:一般认为在20mM 时,Taq酶具有最大活性;更高 浓度的Mg2对Taq酶具有抑制 作用。并且会导致反应特异性降 低,一个不容忽视的问题就是 Taq酶的活性增高会降低反应 的特异性,因而市售的1aq酶 般都有现成的、含有Mg2的 缓冲液,一般为1.5mM。Mg2 本身又受到很多因素的影响,可 与EDTA或其它螯合物结合。 因此在使用高浓度的模板DNA 或过量的dNIP时,要相应增加 Mg2浓度。现在又有一种新的 观点,即退火温度越高,Mg2+ 浓度应相应增加,已有人将 Mg2浓度增至6mM。 2.2.2.2PCR循环参数 2.2.2.2.1温度和变性 变性失败是最终导致PCR 失败的一个常见原因 PCR反应循环开始,先进 行变性,将双链模板变性解离为 单链。温度是变性的条件,一般 采用94℃,2-5分钟。而时间的 长短则由模板和PCR仪来确 定,如模板欠佳或GC含量过 高,应相应延长时间。温度过高 或时间过长会对Taq酶活性和 dNTP造成损害。Taq酶可以在 这时加入,也可以在最初加好之 后进入PCR循环,即94℃变性 1分钟,退火1分钟和72℃延伸 1分钟,常规进行25~35个循环。 最后,进一步完善PCR反应
可影响反应的特异性和产率。 Taq DNA 聚合酶具有 Mg2+依赖 性，因而 PCR 反应对 Mg2+有较 高要求。Mg2+浓度低时，Taq 酶 活性较低；一般认为在 2.0mM 时，Taq 酶具有最大活性；更高 浓度的 Mg2+对 Taq 酶具有抑制 作用。并且会导致反应特异性降 低，一个不容忽视的问题就是 Taq 酶的活性增高会降低反应 的特异性，因而市售的 Taq 酶 一般都有现成的、含有 Mg2+的 缓冲液，一般为 1.5mM。Mg2+ 本身又受到很多因素的影响，可 与 EDTA 或其它螯合物结合。 因此在使用高浓度的模板 DNA 或过量的 dNTP 时，要相应增加 Mg2+浓度。现在又有一种新的 观点，即退火温度越高，Mg2+ 浓度应相应增加，已有人将 Mg2+浓度增至 6mM。 2.2.2.2 PCR 循环参数 2.2.2.2.1 温度和变性 变性失败是最终导致 PCR 失败的一个常见原因 PCR 反应循环开始，先进 行变性，将双链模板变性解离为 单链。温度是变性的条件，一般 采用 94℃，2~5 分钟。而时间的 长短则由模板和 PCR 仪来确 定，如模板欠佳或 GC 含量过 高，应相应延长时间。温度过高 或时间过长会对 Taq 酶活性和 dNTP 造成损害。Taq 酶可以在 这时加入，也可以在最初加好之 后进入 PCR 循环，即 94℃变性 1 分钟，退火 1 分钟和 72℃延伸 1分钟，常规进行25~35个循环。 最后，进一步完善 PCR 反应
在72℃延伸10分钟。模板DNA 的复杂程度决定了变性的温度 和时间 2.2.2.2.2温度和复性 引物长度在15~25bp 时,其退火温度 Im=4(G+C)+2(A+D) 可根据AT与GC的个 数,从其交叉点迅速查出较为合 适退火温度 寡核脱氧核苷酸的 (Oligodeoxyribonucleotides)B )3456789101112131415161718192021 3456789012 s0338斜 717375 475154576062656769 737577788081 13424649 55586063656769 5678901 445 12345 2.2.2.2.3温度和延伸 延伸温度常定为72℃,此 时 Taq dna聚合酶活性最高 延伸反应的时间,根据待扩增片
在 72℃延伸 10 分钟。模板 DNA 的复杂程度决定了变性的温度 和时间 2.2.2.2.2 温度和复性 引物长度在 15~25bp 时，其退火温度 Tm=4(G+C)+2(A+T) 可根据 AT 与 GC 的个 数，从其交叉点迅速查出较为合 适退火温度 寡 核 脱 氧 核 苷 酸 的 (Oligodeoxyribonucleotides) 的 Tm (CG)→ 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 (AT) ↓ 3 61 64 66 69 71 73 75 76 78 79 81 82 84 85 86 4 59 61 64 66 69 71 73 75 76 78 79 81 82 84 85 86 5 56 59 61 64 66 69 71 73 75 76 78 79 81 82 84 85 86 6 53 56 59 62 64 67 69 71 73 75 76 78 80 81 83 84 85 7 50 53 56 60 62 64 67 69 71 73 75 77 78 80 81 83 84 8 47 51 54 57 60 62 65 67 69 71 73 75 77 78 80 81 83 9 44 48 52 55 57 60 63 65 68 70 72 74 75 77 78 80 81 10 41 45 49 53 55 58 61 63 66 68 70 72 74 75 77 78 80 11 39 43 46 50 52 56 59 61 64 66 68 70 72 74 75 77 78 12 40 44 48 51 54 57 60 62 64 66 69 71 72 74 75 77 13 42 46 49 52 55 58 60 63 65 67 69 71 72 74 75 14 43 47 50 53 56 59 61 63 65 67 69 71 73 74 15 44 48 51 54 57 59 61 64 66 68 70 71 73 16 45 49 52 55 57 60 62 64 66 68 70 72 17 47 50 53 56 58 61 63 65 67 69 70 18 48 51 54 57 59 61 63 65 67 69 19 49 52 55 58 60 62 64 66 68 20 50 53 56 58 60 62 64 66 21 51 54 57 59 61 63 65 22 52 55 57 60 62 64 23 53 56 58 60 62 24 54 57 59 61 25 55 58 60 2.2.2.2.3 温度和延伸 延伸温度常定为 72℃，此 时 Taq DNA 聚合酶活性最高。 延伸反应的时间，根据待扩增片
段的长度确定。理论上讲,1kb 以内的片段,延伸1分钟足够了 2.2.3PCR最适合条件的 选择 提高PCR的灵敏度及特 异性是PCR能否成功的关键 提高特异性的关键是:① 退火温度应尽可能高;②引物 浓度应尽可能低:③热启动 ( hot start):在第一次DNA变性 后加入1aq酶,以避免第一次 循环前的引物错配所产生的非 特异扩增和引物二联体 2.2.4PCR产物的分析方 法 1、琼脂糖凝胶电泳:判断 扩增片段的存在及大小。 2、点杂交:更适合于扩增 产物为多条带时的测定 3、 Southern杂交:用于鉴 定扩增产物的大小和特异性其 检测敏感度可达10ng 4、酶切分析利用内切酶特 有的酶切点这一特性,达到产物 鉴定目的 5、 PCR-ELISA法:修饰 个引物5端,使其带有便于 PCR产物固定的功能基团,而 通过修饰另一引物5端使其具 有便于酶联显色检测的功能基 团,达到酶联显色
段的长度确定。理论上讲，1kb 以内的片段，延伸 1 分钟足够了 2.2.3 PCR 最适合条件的 选择 提高 PCR 的灵敏度及特 异性是 PCR 能否成功的关键 提高特异性的关键是：① 退火温度应尽可能高；② 引物 浓度应尽可能低；③ 热启动 (hot start)：在第一次 DNA 变性 后加入 Taq 酶，以避免第一次 循环前的引物错配所产生的非 特异扩增和引物二联体 2.2.4 PCR 产物的分析方 法 1、琼脂糖凝胶电泳：判断 扩增片段的存在及大小。 2、点杂交：更适合于扩增 产物为多条带时的测定。 3、Southern 杂交：用于鉴 定扩增产物的大小和特异性其 检测敏感度可达 10ng。 4、酶切分析利用内切酶特 有的酶切点这一特性，达到产物 鉴定目的。 5、PCR-ELISA 法：修饰 一个引物 5’端，使其带有便于 PCR 产物固定的功能基团，而 通过修饰另一引物 5’端使其具 有便于酶联显色检测的功能基 团，达到酶联显色
6、颜色互补分析法:用不 同荧光染料标记不同引物对的 5端,PCR扩增有不同的染料, 因此表现颜色互补而区分出来 7、PCR-HPLC(高压液相 层析)法:PCR产物通过HPLC 仪自动分析,7~8分钟即可显示 并打印结果,HPLC可检出 0.3ng的产物 8、直接检测法:PCR反应 中加入EB,随产物增加,EB 嵌入产物DNA中的量也增加, 从而得出PCR产物的量 2.3几种特殊类型的PCR 在介绍了PCR的基本知识 后,我们来熟悉一下几种特殊类 型的PCR 2.3.1锚定PCR 常采用的PCR必须知道欲 扩增DNA或RNA片段两侧的 序列,而在大多数情况下对某些 序列本身或其旁侧序列并不清 楚,这无疑限制了PCR技术的 广泛应用,“锚定PCR”可以 帮助克服序列未知或序列未全 知带来的障碍 使用一条锚定引物就一条 特异性引物扩增已知一端序列 的目的DNA
6、颜色互补分析法：用不 同荧光染料标记不同引物对的 5’端，PCR 扩增有不同的染料， 因此表现颜色互补而区分出来。 7、PCR-HPLC（高压液相 层析）法：PCR 产物通过 HPLC 仪自动分析，7~8 分钟即可显示 并打印结 果，HPLC 可 检出 0.3ng 的产物。 8、直接检测法：PCR 反应 中加入 EB，随产物增加，EB 嵌入产物 DNA 中的量也增加， 从而得出 PCR 产物的量。 2.3 几种特殊类型的 PCR 在介绍了 PCR 的基本知识 后，我们来熟悉一下几种特殊类 型的 PCR： 2.3.1 锚定 PCR 常采用的 PCR 必须知道欲 扩增 DNA 或 RNA 片段两侧的 序列，而在大多数情况下对某些 序列本身或其旁侧序列并不清 楚，这无疑限制了 PCR 技术的 广泛应用，“锚定 PCR”可以 帮助克服序列未知或序列未全 知带来的障碍 使用一条锚定引物就一条 特异性引物扩增已知一端序列 的目的 DNA
2.3.2不对称 PCR (asymmetric PCR) Gyllensten和 Erlich改进了 PCR方案。在扩增循环中引入 不同引物浓度,由此得到单链 DNA。一般采用50~-100:1比 例的引物浓度,在最初10~15 个循环中主要产物还是双链 DNA,但当低浓度引物被消耗 尽后,高浓度引物介导的PCR 反应就会产生大量单链DNA (single strand dNa, ssdNA (图2-12-5)。分离此扩增产物 中的sDNA可用原引物或第三 条内部引物直接测序。 2.3.3反向PCR( I nverse Inverse-(D)-PCR a DNA with a region of known sed and flanked by restriction sites A within re gions of unknown sequence b. Digestion with enzyme a cleaves the DNA c Ligation of the linear fragments to generate circular DNA molecules 反 d. Digestion with B opens the circular 向 DNA to recreate linear fragments where the unknown sequence is now flanked by portions of the known sequent R 的 e PCR using primers designed from the known sequence generates PRpe用 wo known sequence converged 则 at restriction site A 可 对 个已知的DNA片段两侧的未知 序列进行扩增和研究。选择已知 序列内部没有切点的限制酶对 此段DNA进行酶切,连接形成
2.3.2 不对称 PCR(asymmethic PCR) Gyllensten 和 Erlich 改进了 PCR 方案。在扩增循环中引入 不同引物浓度，由此得到单链 DNA。一般采用 50~100∶1 比 例的引物浓度，在最初 10~15 个循环中主要产物还是双链 DNA，但当低浓度引物被消耗 尽后，高浓度引物介导的 PCR 反应就会产生大量单链 DNA （single strand DNA，ssDNA） （图 2-12-5）。分离此扩增产物 中的 ssDNA 可用原引物或第三 条内部引物直接测序。 2.3.3 反向 PCR (inverse P C R ) 反 向 P C R 的 应 用 则 可 以 对 一 个已知的 DNA 片段两侧的未知 序列进行扩增和研究。选择已知 序列内部没有切点的限制酶对 此段 DNA 进行酶切，连接形成
环状DNA分子,此时选择合适 方向的与已知序列两末端互补 的引物,经PCR后,可以得到 未知序列的DNA片段(),用 此方法建立基因组步移文库,在 分子生物学研究上是非常有意 义的 右图:反向PCR示意图 2.3.4多重 PCR(multiplex PCr 即在同一试管中加入多对 引物,扩增同一模板的几个区 域。如果基因的某一区段缺失 则相应的电泳图谱上这一区带 就会消失。多重PCR反应和 Southern印迹一样可靠,但显 然要简便得多。目前报道的多重 PCR反应,最多可同时扩增12 条区带
环状 DNA 分子，此时选择合适 方向的与已知序列两末端互补 的引物，经 PCR 后，可以得到 未知序列的 DNA 片段（），用 此方法建立基因组步移文库，在 分子生物学研究上是非常有意 义的。 右图：反向 PCR 示意图 2.3.4 多重 PCR(multiplex PCR) 即在同一试管中加入多对 引物，扩增同一模板的几个区 域。如果基因的某一区段缺失， 则相应的电泳图谱上这一区带 就会消失。多重 PCR 反应和 Southern 印迹一样可靠，但显 然要简便得多。目前报道的多重 PCR 反应，最多可同时扩增 12 条区带
Multiplex Pcr Primers are picked from 100 bp from the ends of contig Primo and screened against the entire database vith a stringency of 12/20as a cutoff Primers synthesized on MerMade in 95-vell format (Average concentration is19 pmol/ul) One u l of each primer is pooled for each PCR reaction and the pool is dried and resuspended in 10 ul sdd Ho 9 C for 6 min nce nutes(once) Agarose gel 6 until analysis Cleanup with shrimp alkaline phosphatase "Extract with phenol/chloroform Precipitate vith 2.5 volumes of ethanol acetate and wash vitd n sdh, o in the original volume Tvo ul of the PCR product is thermocycled vith each of the primers individually according to the standard BigDye conditions Primers that generate sequences are removed from the pool and PCR is repeated 2.3.5着色互补 PCR (color comp l ementation assay) 荧光PCR的原理是用不同 的荧光染料,如红色的罗丹明 (6-carboxy-x-rhodamin, POX)I 绿色荧光素 (5-carboxyfluorescein, FAM)S 分别标记于不同的寡核苷酸引 物上,同时扩增多个DNA区段 反应完毕后,利用分子筛除去多 余的引物。用紫外线照射扩增产 物,就能显示某一种或几种荧光 染料颜色的组合,如果某一 DNA区带缺失,则会缺乏相应 的颜色,据此可以很快诊断是否 某种基因缺失,或是发现某些感
2.3.5 着色互补 PCR(color complementation assay) 荧光 PCR 的原理是用不同 的荧光染料，如红色的罗丹明 (6-carboxy-x-rhodamin, POX)和 绿色荧光素 (5’-carboxyfluorescein，FAM)等 分别标记于不同的寡核苷酸引 物上，同时扩增多个 DNA 区段， 反应完毕后，利用分子筛除去多 余的引物。用紫外线照射扩增产 物，就能显示某一种或几种荧光 染料颜色的组合，如果某一 DNA 区带缺失，则会缺乏相应 的颜色，据此可以很快诊断是否 某种基因缺失，或是发现某些感