第二篇细胞的遗传物质 第四章染色体分析相关的实验 染色体是细胞与分子联系的重要桥梁,染色体的研究在遗传学和医学研究中 被广泛重视及应用。尤其是染色体畸变有关的各类遗传病的研究使临床分析上了 一个新的台阶。 在染色体分析技术实验中,染色体非显带分析技术相对较简单,通常采用外 周血中的淋巴细胞。外周血染色体制备也是目前应用最广泛的细胞遗传学诊断技 术。此外,产前诊断时,胎儿可采用羊膜液中的羊膜细胞或胎盘绒毛膜细胞。 染色体显带技术是在非显带染色体的基础上发展起来的,它能显示染色体本 身更细微的结构,有助于准确的识别每一条染色体及诊断染色体异常疾病。G(G band ing)显带技术是目前通常采用的显带技术之一,另外,Q显带、高分辨显带、 C显带、T显带及SCE技术等也被用于染色体研究 随着分子细胞遗传学技术的应用,可利用克隆的DNA探针(含有荧光标记) 来定位染色体上特定基因和DNA序列,如荧光原位杂交(FISH)技术,可以鉴 别经典细胞遗传学方法所难以识别的微小标记染色体、微小缺失和复杂易位等 第一节人类染色体标本的制备 、概述 在一般的生理状态下,全血中含有红、白细胞二类,它们均是处于未分裂的 间期细胞。红细胞没有核无分裂能力;白细胞虽有细胞核存在,但是在外周血中 已处于休止期(G0),因此要使白细胞从间期进入分裂期必须加刺激药物。 现在最常用的促使分裂的药品是植物血凝素( phytohemagg! lutein,PHA), 它能使白细胞中的淋巴细胞和单核细胞转化为具有分裂作用的母细胞,这就为染 色体的制备创造了条件。在PHA的作用下,处在G0期的淋巴细胞可转化成淋巴 母细胞,重新进入增殖周期进行有丝分裂,当体外培养至70h左右时,大多数淋 巴细胞己处于第二増殖周期内,此时用秋水仙素( colchicine)处理细胞可使正在
1 第二篇 细胞的遗传物质 第四章 染色体分析相关的实验 染色体是细胞与分子联系的重要桥梁，染色体的研究在遗传学和医学研究中 被广泛重视及应用。尤其是染色体畸变有关的各类遗传病的研究使临床分析上了 一个新的台阶。 在染色体分析技术实验中，染色体非显带分析技术相对较简单，通常采用外 周血中的淋巴细胞。外周血染色体制备也是目前应用最广泛的细胞遗传学诊断技 术。此外，产前诊断时，胎儿可采用羊膜液中的羊膜细胞或胎盘绒毛膜细胞。 染色体显带技术是在非显带染色体的基础上发展起来的，它能显示染色体本 身更细微的结构，有助于准确的识别每一条染色体及诊断染色体异常疾病。G（G banding）显带技术是目前通常采用的显带技术之一，另外，Q 显带、高分辨显带、 C 显带、T 显带及 SCE 技术等也被用于染色体研究。 随着分子细胞遗传学技术的应用，可利用克隆的 DNA 探针(含有荧光标记) 来定位染色体上特定基因和 DNA 序列，如荧光原位杂交（FISH）技术，可以鉴 别经典细胞遗传学方法所难以识别的微小标记染色体、微小缺失和复杂易位等。 第一节 人类染色体标本的制备 一、概述 在一般的生理状态下，全血中含有红、白细胞二类，它们均是处于未分裂的 间期细胞。红细胞没有核无分裂能力；白细胞虽有细胞核存在，但是在外周血中 已处于休止期（G0），因此要使白细胞从间期进入分裂期必须加刺激药物。 现在最常用的促使分裂的药品是植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）， 它能使白细胞中的淋巴细胞和单核细胞转化为具有分裂作用的母细胞，这就为染 色体的制备创造了条件。在 PHA 的作用下，处在 G0 期的淋巴细胞可转化成淋巴 母细胞，重新进入增殖周期进行有丝分裂，当体外培养至 70 h 左右时，大多数淋 巴细胞己处于第二增殖周期内，此时用秋水仙素（colchicine）处理细胞可使正在
分裂的细胞都停止在中期,再经低渗处理、固定、染色,获取的中期分裂相细胞。 染色体标本,可在显微镜下拍照进行核型分析,或用计算机进行图像分析 、实验过程 (一)器械 超净工作台、酒精灯、5ml无菌注射器、5号针头、10ml培养瓶、橡皮塞、 75%酒精棉球、水平式离心机、定时钟、试管架、量筒、10ml刻度离心管、冰玻 片,毛细滴管、恒温水浴箱、恒温培养箱、托盘天平、光学显微镜。 (二)试剂 RPMI640、小牛血清、肝素(500U0m)、秋水仙素(5ugml)、植物血凝素 (PHA)、固定液(甲醇:冰乙酸为3:1,现用现配)、0075 moL L-KCI低渗液 Giemsa染液、pH68磷酸缓冲液、5% NaHco3 、主要步骤 (一)采血与接种 用一次性5m注射器取500U/ml的肝素0.203ml湿润针筒后,然后将多余的 肝素排除。常规消毒被检者肘部皮肤,从肘部静脉采血2ml。转动针筒以混匀肝 素;随后在超净工作台中将血液滴入盛有5m培养液(4 mI rPmi le640、lml小牛 血清,02 mI Pha,用5%的NaCO3调pH至70~74)的培养瓶内,每瓶0.3~ 0.5ml(7号针头约20滴),盖上橡皮塞,轻轻摇动以混匀 (二)培养 1.将培养瓶放在37℃恒温箱内培养72h。 2.在终止培养前2h,将5μg/ml的秋水仙素1~2滴(5号针头)加入培养瓶 内(终浓度为007μg/ml),轻轻摇匀.放回温箱内,继续培养2h。 (三)染色体标本的制备(胰蛋白酶法) 收获细胞用吸管充分吹打瓶壁,吸取培养物移入10ml刻度离心管内, 平衡后放入离心机内,离心8~10min(1000r/min),弃上清液。 2.低渗处理加8nl预温(37C)的0.075 molL-IKCI低渗液,用吸管打匀 使细胞悬浮于低渗液中,放在37℃恒温水浴锅中,静置15~20min,使白细胞膨 胀,染色体分散(精确的低渗时间应自行摸索)。 3固定 (1)预固定:低渗处理完成后,加入现配制固定液1ml,吹打均匀。1000r/min
2 分裂的细胞都停止在中期，再经低渗处理、固定、染色，获取的中期分裂相细胞。 染色体标本，可在显微镜下拍照进行核型分析，或用计算机进行图像分析。 二、实验过程 （一）器械 超净工作台、酒精灯、5m1 无菌注射器、5 号针头、10ml 培养瓶、橡皮塞、 75％酒精棉球、水平式离心机、定时钟、试管架、量筒、10ml 刻度离心管、冰玻 片，毛细滴管、恒温水浴箱、恒温培养箱、托盘天平、光学显微镜。 （二）试剂 RPMI1640、小牛血清、肝素(500U/ml)、秋水仙素(5μg/ml)、植物血凝素 （PHA）、固定液（甲醇：冰乙酸为 3∶1，现用现配）、0.075mol.L-1KCI 低渗液、 Giemsa 染液、pH6.8 磷酸缓冲液、5％NaHCO3。 三、主要步骤 （一）采血与接种 用一次性 5ml 注射器取 500U/ml 的肝素 0.2-0.3ml 湿润针筒后，然后将多余的 肝素排除。常规消毒被检者肘部皮肤，从肘部静脉采血 2ml。转动针筒以混匀肝 素；随后在超净工作台中将血液滴入盛有 5ml 培养液（4ml RPMI l640、lml 小牛 血清，0.2ml PHA，用 5％的 NaHCO3 调 pH 至 7.0～7.4）的培养瓶内，每瓶 0.3～ 0.5ml（7 号针头约 20 滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。 （二）培养 1. 将培养瓶放在 37℃恒温箱内培养 72h。 2. 在终止培养前 2h，将 5μg/ml 的秋水仙素 1～2 滴（5 号针头）加入培养瓶 内（终浓度为 0.07μg/ml），轻轻摇匀．放回温箱内，继续培养 2h。 （三）染色体标本的制备（胰蛋白酶法） 1. 收获细胞 用吸管充分吹打瓶壁，吸取培养物移入 10ml 刻度离心管内， 平衡后放入离心机内，离心 8～10min（1000r/min），弃上清液。 2. 低渗处理 加 8ml 预温（370C）的 0.075mol.L-1KCI 低渗液，用吸管打匀 使细胞悬浮于低渗液中，放在 37℃恒温水浴锅中，静置 15～20min，使白细胞膨 胀，染色体分散（精确的低渗时间应自行摸索）。 3.固定 （1）预固定：低渗处理完成后，加入现配制固定液 1ml，吹打均匀。1000 r/min
离心8~10min,弃去上清液。 (2)固定:沿离心管壁加入新配固定液8ml打匀,1000r/min再离心8~ l0min,弃去上清液 (3)再固定:再加入新配固定液8m,打匀(静置30min),1000r/min离 心8~10min,弃去上清液。 4.制片视细胞多少,加入适量新配固定液制成细胞悬液,将细胞悬液2-3 滴,滴到清洁的冰玻片上,在酒精灯火焰上来回过几下(勿全烤干),空气中晾 5.染色晾干的标本用 Giemsa染液( Giemsa原液:pH68磷酸缓冲液为 1:9)染色8~10min、自来水冲洗、晾干 (四)镜检 将制备好的染色体玻片放置到显微镜下,先用低倍镜找到分散良好的分裂 相,然后后换髙倍镜、油镜、认真观察 四、注意事项 PHA是体外淋巴细胞培养成败的关键问题,因此,要考虑它的质量和浓 度。盐水提取物一般冰冻保存的时间不宜过长,时间长了效价减低。浓度一般用 200~-300μg/ml,每毫升培养液加02~0.3ml,浓度过高可能会导致红细胞凝集。 2.秋水仙素浓度与处理时间,一般最终浓度以005μg/m为宜,处理时间为2 小时。如果浓度太低,处理时间太短,则分裂相少;浓度太高,处理时间太长, 则分裂相虽多,但因染色体缩得太短而形态特征模糊 3.培养温度应严格控制在37℃±0.5℃, 4.双蒸水pH值应在6-7之间。 5.低渗一步极为重要,关系到染色体分散的好坏,因此低渗液的浓度与低渗 的时间应掌握好 6.离心速度不宜过高,速度太高细胞团不易打散,反之,分裂相易丢失 7.固定液应临用时新鲜配制,固定时一定要彻底吹匀,若吹打不够则细胞在 玻片上成堆,反之则细胞易碎,以至染色体数目不完整。 8.培养液的pH值应掌握在70-7.2左右,偏酸细胞发育不良,偏碱则细胞 出现轻度固缩 9.玻璃器皿要十分干净、无酸,所用试剂以分析纯的为好
3 离心 8～10min，弃去上清液。 （2）固定：沿离心管壁加入新配固定液 8ml 打匀， 1000 r/min 再离心 8～ 10min，弃去上清液。 （3）再固定：再加入新配固定液 8ml，打匀（静置 30min），1000 r//min 离 心 8～10min，弃去上清液。 4. 制片 视细胞多少，加入适量新配固定液制成细胞悬液，将细胞悬液 2-3 滴，滴到清洁的冰玻片上，在酒精灯火焰上来回过几下（勿全烤干），空气中晾 干。 5. 染色 晾干的标本用 Giemsa 染液（Giemsa 原液∶pH6.8 磷酸缓冲液为 1∶9）染色 8～10min、自来水冲洗、晾干。 （四）镜检 将制备好的染色体玻片放置到显微镜下，先用低倍镜找到分散良好的分裂 相，然后后换高倍镜、油镜、认真观察。 四、注意事项 1．PHA 是体外淋巴细胞培养成败的关键问题，因此，要考虑它的质量和浓 度。盐水提取物一般冰冻保存的时间不宜过长，时间长了效价减低。浓度一般用 200~300μg/ml，每毫升培养液加 0.2～0.3ml，浓度过高可能会导致红细胞凝集。 2．秋水仙素浓度与处理时间，一般最终浓度以 0.05μg/ml 为宜，处理时间为 2 小时。如果浓度太低，处理时间太短，则分裂相少；浓度太高，处理时间太长， 则分裂相虽多，但因染色体缩得太短而形态特征模糊。 3．培养温度应严格控制在 37℃+0.5℃。 4．双蒸水 pH 值应在 6-7 之间。 5．低渗一步极为重要，关系到染色体分散的好坏，因此低渗液的浓度与低渗 的时间应掌握好。 6．离心速度不宜过高，速度太高细胞团不易打散，反之，分裂相易丢失。 7．固定液应临用时新鲜配制，固定时一定要彻底吹匀，若吹打不够则细胞在 玻片上成堆，反之则细胞易碎，以至染色体数目不完整。 8．培养液的 pH 值应掌握在 7.0~7.2 左右，偏酸细胞发育不良，偏碱则细胞 出现轻度固缩。 9．玻璃器皿要十分干净、无酸，所用试剂以分析纯的为好
10.无菌操作过程应保持高度无菌概念,严防细菌和病毒污染。 在外周血培养过程中,HHA对淋巴细胞的刺激效应个体差异较大,同样 方法和条件,分裂相多少及分散情况可各不相同。 第二节染色体G显带技术 染色体显带技术是在非显带染色体的基础上发展起来的,它能显示染色体本 身更细微的结构。自20世纪60年代末以来,染色体显带技术得到了很大的发展 这一技术的应用,可以准确识别23对不同类型的染色体,并能识别同一号染色 体上的不同区带。从而提髙了染色体核型分析的精确度,为临床上某些疾病的诊 断提供了更有效的手段。 显带染色体是染色体标本经过一定程序处理,并用特定染料染色,使染色体 沿其长轴显现明暗或深浅相间的带纹,称为染色体带,这种染色体显带的技术, 称为显带技术。通过显带技术,使各号染色体都显现出独特的带纹,这就构成了 染色体的带型。每对同源染色体的带型基本相同而且稳定,不同对染色体的带型 不同。20世纪70年代以来,显带技术得到了很大发展,在众多的显带(Q带、G 带、C带、R带、T带)技术中,G带是目前应用最广泛的一种带型。因为它主 要是被 Giemsa染料染色后而显带,故称之为G显带技术。因其方法简便,带纹 清晰,染色体标本可以长期保存,而被广泛用于染色体病的诊断和硏究。一套单 倍体染色体带纹数有320条带。70年代后期,由于技术的改进,可以从早中期、 前中期、晚前期细胞得到更长、带纹更丰富的染色体。一套单倍体染色体即可显 示550~850条或更多的带纹称为高分辨显带染色体( high resolution band ing chromosome,HRBC)。 、显色原理 关于G带的形成机理,迄今尚不十分清楚。有人认为,在胰蛋白酶的作用下, 蛋白质不均匀丢失是G带产生的原因。在染色体上的蛋白质经处理而丢失后,这 些区域呈现出浅染(浅带)。染色体上蛋白质和DNA结合牢固的区域,由于蛋白质 丢失少而呈现深染(深带)。还有人认为,染色体经蛋白酶消化后,染色体的核蛋 白破坏,这些区域裸露的DNA分子的磷酸基团能与吉姆萨染料中的天青和甲基 蓝等噻嗪分子结合而使染色体着色。也有人认为,染色体上TA和C-G碱基
4 10．无菌操作过程应保持高度无菌概念，严防细菌和病毒污染。 11．在外周血培养过程中，PHA 对淋巴细胞的刺激效应个体差异较大，同样 方法和条件，分裂相多少及分散情况可各不相同。 第二节 染色体 G 显带技术 染色体显带技术是在非显带染色体的基础上发展起来的，它能显示染色体本 身更细微的结构。自 20 世纪 60 年代末以来，染色体显带技术得到了很大的发展。 这一技术的应用，可以准确识别 23 对不同类型的染色体，并能识别同一号染色 体上的不同区带。从而提高了染色体核型分析的精确度，为临床上某些疾病的诊 断提供了更有效的手段。 显带染色体是染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体 沿其长轴显现明暗或深浅相间的带纹，称为染色体带，这种染色体显带的技术， 称为显带技术。通过显带技术，使各号染色体都显现出独特的带纹，这就构成了 染色体的带型。每对同源染色体的带型基本相同而且稳定，不同对染色体的带型 不同。20 世纪 70 年代以来，显带技术得到了很大发展，在众多的显带（Q 带、G 带、C 带、R 带、T 带）技术中，G 带是目前应用最广泛的一种带型。因为它主 要是被 Giemsa 染料染色后而显带，故称之为 G 显带技术。因其方法简便，带纹 清晰，染色体标本可以长期保存，而被广泛用于染色体病的诊断和研究。一套单 倍体染色体带纹数有 320 条带。70 年代后期，由于技术的改进，可以从早中期、 前中期、晚前期细胞得到更长、带纹更丰富的染色体。一套单倍体染色体即可显 示 550～850 条或更多的带纹,称为高分辨显带染色体（high resolution banding chromosome，HRBC）。 一、显色原理 关于 G 带的形成机理，迄今尚不十分清楚。有人认为，在胰蛋白酶的作用下， 蛋白质不均匀丢失是 G 带产生的原因。在染色体上的蛋白质经处理而丢失后，这 些区域呈现出浅染(浅带)。染色体上蛋白质和 DNA 结合牢固的区域，由于蛋白质 丢失少而呈现深染(深带)。还有人认为，染色体经蛋白酶消化后，染色体的核蛋 白破坏，这些区域裸露的 DNA 分子的磷酸基团能与吉姆萨染料中的天青和甲基 蓝等噻嗪分子结合而使染色体着色。也有人认为，染色体上 T—A 和 C—G 碱基
的含量和分布不同,也与染色体上深浅带的形成有关。A—T碱基对较多的区域, 易与吉姆萨染料结合而染成深色区带;而G-C碱基对较多的区域则相反,染成 浅染区带。总之,目前说法较多,主要概括为三种观点,即显带是由于①DNA 的作用:②蛋白质的作用;③DNA、染料和蛋白质三者之间相互作用的结果。这 些都有待于进一步硏究探讨。人染色体标本经胰蛋白酶、NaOH、柠檬酸盐或尿 素等试剂处理后,再用 Giemsa染色,可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹, 这就是染色体的G带 G显带制备方法简便易行,标本可长期保存,带纹清晰,成本低廉,制备周 期短,普通光学显微镜即可观察。故已成为研究分析染色体的主要常规方法之一。 、实验用品和材料 (一)器械 普通光学显微镜、37℃恒温水浴箱、立式染色缸、刻度吸管、橡皮吸头、pH 试纸。 (二)试剂 2.5%胰蛋白酶原液、0.25%的胰蛋白酶工作液、生理盐水、 Giemsa原液 Giemsa工作液、1molL磷酸缓冲液(pH40~4.5)。 、基本步骤(胰蛋白酶法) 1.将常规制备的人染色体玻片标本(未染色的白片)置于70℃烤箱中处理 2h,然后转入37℃培养箱中备用,一般在第3~7天进行显带。 2.取0.25%胰蛋白酶溶液5m,倒入染色缸中,加入45m生理盐水,用1 mol/L HCl和1 mol/L Naoh及酚红调节胰蛋白酶溶液pH68~7.2。 3.将配好的胰蛋白酶工作液放入37℃恒温水浴箱中预温 4.将玻片标本浸入胰蛋白酶液中,不断摆动使胰蛋白酶的作用均匀,处理 1~2min(精确的时间需自行摸索)。 5.立即取出玻片,放入生理盐水中漂洗2次 6.将标本浸入37℃预温的 Giemsa工作液( Giemsa原液和pH6.8的磷酸缓 冲液比例为19)中染色10min左右。 7.自来水冲洗(用细水小心冲洗),空气晾干
5 的含量和分布不同，也与染色体上深浅带的形成有关。A—T 碱基对较多的区域， 易与吉姆萨染料结合而染成深色区带；而 G—C 碱基对较多的区域则相反，染成 浅染区带。总之，目前说法较多，主要概括为三种观点，即显带是由于:①DNA 的作用；②蛋白质的作用；③DNA、染料和蛋白质三者之间相互作用的结果。这 些都有待于进一步研究探讨。人染色体标本经胰蛋白酶、NaOH、柠檬酸盐或尿 素等试剂处理后，再用 Giemsa 染色，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹， 这就是染色体的 G 带。 G 显带制备方法简便易行，标本可长期保存，带纹清晰，成本低廉，制备周 期短，普通光学显微镜即可观察。故已成为研究分析染色体的主要常规方法之一。 二、实验用品和材料 （一）器械 普通光学显微镜、37℃恒温水浴箱、立式染色缸、刻度吸管、橡皮吸头、pH 试纸。 （二）试剂 2.5%胰蛋白酶原液、0.25%的胰蛋白酶工作液、生理盐水、Giemsa 原液、 Giemsa 工作液、1 mol/L 磷酸缓冲液（pH 4.0～4.5）。 三、基本步骤（胰蛋白酶法） 1．将常规制备的人染色体玻片标本（未染色的白片）置于 70℃烤箱中处理 2 h，然后转入 37℃培养箱中备用，一般在第 3～7 天进行显带。 2．取 0.25%胰蛋白酶溶液 5 ml，倒入染色缸中，加入 45 ml 生理盐水，用 1 mol/L HCl 和 1 mol/L NaOH 及酚红调节胰蛋白酶溶液 pH 6.8～7.2。 3．将配好的胰蛋白酶工作液放入 37℃恒温水浴箱中预温。 4．将玻片标本浸入胰蛋白酶液中，不断摆动使胰蛋白酶的作用均匀，处理 1～2 min（精确的时间需自行摸索）。 5．立即取出玻片，放入生理盐水中漂洗 2 次。 6．将标本浸入 37℃预温的 Giemsa 工作液（Giemsa 原液和 pH 6.8 的磷酸缓 冲液比例为 1:9）中染色 10 min 左右。 7．自来水冲洗（用细水小心冲洗），空气晾干
8.镜检显带效果:在低倍镜下选择分散良好的长度适中的分裂相,转换油 镜观察,若染色体未出现带纹,则为显带不足;若染色体边缘发毛为显带过头 此时应根据具体情况增减胰蛋白酶处理时间重新处理一张标本。 四、G显带核型分析 准备G显带中期分裂相照片一张,将各条染色体逐一剪下,根据其大小、带 型特点和着丝粒位置,依次分组、配对和排列组合,待检查无误后,贴在报告纸 上,写出核型的简式(繁式)。 五、注意事项 1、良好的培养效果为:标本片上中期分裂相要多,且染色体分散要好。 2、胰蛋白酶溶液需在使用前新配制。 3、染色体长度应能适应显带分析技术的要求。 4、烤片时间也很重要。 5、G显带成败之关键取决于胰蛋白酶液的浓度和处理时间之搭配,故每次 进行染色体G显带时,最好先试做一张制片,摸索胰蛋白酶处理时间,以保证获 得最好的染色体G显带标本。 第三节姐妹染色单体技术 姊妹染色单体交换( Sister chromatial exchange,SCE)是染色体同源座位上复 制产物间的相互交换,是同一染色体的两条单体之间发生的一类特殊的同源重 组,主要在DNA合成期形成,可能与DNA双链的断裂与复制有关,SCE的发生 的频率可反映细胞在S期的受损程度。如果一个个体的SCE率明显增高,可表明 染色体受到环境中的一定因素的影响,或是受到遗传缺陷的内在制约因素所致 、姐妹染色单体互换概念 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5- bromodeoxy- uridine,BrdU)是脱氧胸腺嘧啶核苷 的类似物,在DNA链的复制过程中,可替代胸腺嘧啶。在细胞培养过程中,加 入一定是的5-溴脱氧尿苷(BrdU),当细胞在DNA复制过程时,BdU能作为核 苷酸的前体取代胸腺嘧啶而被掺入到新合成的DNA中。因此,当细胞处于第 个分裂周期时,同一染色体的两条姐妹染色单体,一条由双股都含有BrU的DNA
6 8．镜检显带效果：在低倍镜下选择分散良好的长度适中的分裂相，转换油 镜观察，若染色体未出现带纹，则为显带不足；若染色体边缘发毛为显带过头， 此时应根据具体情况增减胰蛋白酶处理时间重新处理一张标本。 四、G 显带核型分析 准备 G 显带中期分裂相照片一张，将各条染色体逐一剪下，根据其大小、带 型特点和着丝粒位置，依次分组、配对和排列组合，待检查无误后，贴在报告纸 上，写出核型的简式（繁式）。 五、注意事项 1、良好的培养效果为：标本片上中期分裂相要多，且染色体分散要好。 2、胰蛋白酶溶液需在使用前新配制。 3、染色体长度应能适应显带分析技术的要求。 4、烤片时间也很重要。 5、G 显带成败之关键取决于胰蛋白酶液的浓度和处理时间之搭配，故每次 进行染色体 G 显带时，最好先试做一张制片，摸索胰蛋白酶处理时间，以保证获 得最好的染色体 G 显带标本。 第三节 姐妹染色单体技术 姊妹染色单体交换（Sister chromatial exchange,SCE）是染色体同源座位上复 制产物间的相互交换，是同一染色体的两条单体之间发生的一类特殊的同源重 组，主要在 DNA 合成期形成，可能与 DNA 双链的断裂与复制有关，SCE 的发生 的频率可反映细胞在 S 期的受损程度。如果一个个体的 SCE 率明显增高，可表明 染色体受到环境中的一定因素的影响，或是受到遗传缺陷的内在制约因素所致。 一、姐妹染色单体互换概念 5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxy- uridine，BrdU）是脱氧胸腺嘧啶核苷 的类似物，在 DNA 链的复制过程中，可替代胸腺嘧啶。在细胞培养过程中，加 入一定是的 5-溴脱氧尿苷（BrdU）,当细胞在 DNA 复制过程时，BrdU 能作为核 苷酸的前体取代胸腺嘧啶而被掺入到新合成的 DNA 中。因此，当细胞处于第二 个分裂周期时，同一染色体的两条姐妹染色单体，一条由双股都含有 BrdU 的DNA
链构成,而另一条为单股含有BdU的DNA链。在结构上双股含BU的DNA 螺旋化程度较低,故对染色剂亲合力低,在用 Giemsa染色时其单体着色浅,只 有单股含BrdU的DNA链组成的单体则着色深而形成差别着色。应用姐妹染色单 体交换技术研究来自一个染色体的两条单体之间在同一个位点发生同源片段的 交换,称为姊妹染色单体互换。当姊妹染色体间存在同源片段交换时,可根据每 条单体夹杂着深浅不一的着色片段加以区分。由于姐妹染色单体的DNA序列相 同,SCE并不改变遗传物质组成,但SCE是由于染色体发生断裂和重接而产生的, 因此,SCE显示方法通常用来检测染色体断裂频率,用来研究药物和环境因素的 致畸效应。 、实验用品和材料 材料:人外周血(或培养细胞) 2.器械:光学显微镜、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、20w紫外线灯、 培养瓶、10ml刻度离心管、吸管、试管架、注射器(lm、2ml)、酒精灯、载玻 片、天平、小烧杯、染色缸、黑纸、擦镜纸。 3.试剂:RPM1640培养液、PHA、肝素、2xSSC、500ug/ml的BrdU、pH68 磷酸缓冲液、 Giemsa染液 4.试剂的配制 (1)500μ g/ml BrdU称取Buu42mg,加入84m无菌生理盐水,摇匀后 即成500μg/mnl的BrdU溶液,4℃冰箱避光保存, (2)2×SSC溶液先配制A液(0.30molL氯化钠:17.54克氯化钠溶解 在蒸馏水中,定容至l00om)和B液(0030mo柠檬酸钠:882克柠檬酸钠溶 解在蒸馏水中,定容至1000mn);使用时将A和B两溶液等体积混合即成2×SSC 溶液 (3)常规配制RPMI1640培养液、 Giemsa染液、肝素液。 实验方法与步骤 (一)细胞培养(人外周血淋巴细胞培养) 1.接种无菌抽取外周全血0.2~0.3ml(肝素抗凝),接种在5ml含有PHA 的RPM1640培养液中,37℃培养箱培养。 2.加BrdU培养24h后加500ug/ ml brdu液0.1ml,终浓度为10ug/m
7 链构成，而另一条为单股含有 BrdU 的 DNA 链。在结构上双股含 BrdU 的 DNA 螺旋化程度较低，故对染色剂亲合力低，在用 Giemsa 染色时其单体着色浅，只 有单股含 BrdU 的 DNA 链组成的单体则着色深而形成差别着色。应用姐妹染色单 体交换技术研究来自一个染色体的两条单体之间在同一个位点发生同源片段的 交换，称为姊妹染色单体互换。当姊妹染色体间存在同源片段交换时，可根据每 条单体夹杂着深浅不一的着色片段加以区分。由于姐妹染色单体的 DNA 序列相 同，SCE 并不改变遗传物质组成，但 SCE 是由于染色体发生断裂和重接而产生的， 因此，SCE 显示方法通常用来检测染色体断裂频率，用来研究药物和环境因素的 致畸效应。 二、实验用品和材料 1. 材料：人外周血（或培养细胞） 2. 器械：光学显微镜、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、20w 紫外线灯、 培养瓶、10ml 刻度离心管、吸管、试管架、注射器（1ml、2ml）、酒精灯、载玻 片、天平、小烧杯、染色缸、黑纸、擦镜纸。 3. 试剂：RPMI1640 培养液、PHA、肝素、2×SSC、500g/ml 的 BrdU、pH6.8 磷酸缓冲液、Giemsa 染液。 4. 试剂的配制 （1）500g/ml BrdU 称取 Brdu 4.2mg，加入 8.4 ml 无菌生理盐水，摇匀后 即成 500g/ml 的 BrdU 溶液，4℃冰箱避光保存。 （2）2×SSC 溶液 先配制 A 液（0.30mol/L 氯化钠 ：17.54 克氯化钠溶解 在蒸馏水中，定容至 1000ml）和 B 液（0.030mol/L 柠檬酸钠：8.82 克柠檬酸钠溶 解在蒸馏水中，定容至 1000ml）；使用时将 A 和 B 两溶液等体积混合即成 2×SSC 溶液 （3）常规配制 RPMI1640 培养液、Giemsa 染液、肝素液。 三、实验方法与步骤 （一）细胞培养（人外周血淋巴细胞培养） 1. 接种 无菌抽取外周全血 0.2~0.3ml（肝素抗凝），接种在 5ml 含有 PHA 的 RPMI1640 培养液中，37℃培养箱培养。 2. 加 BrdU 培养 24h 后加 500μg/ ml BrdU 液 0.1 ml，终浓度为 10μg/ ml
混匀后,避光培养。 3.加秋水仙素在收获细胞前2h加秋水仙素(终浓度为0.2ugml培养液)。 (二)收获细胞和制备染色体玻片 收获细胞及染色体标本制片均与人类染色体标本的制备相同 (三)标本老化 将制好的染色体玻片置37℃培养箱2天或在60℃干烤箱烤片2h (四)差别染色—紫外线照射法 1.将老化好的染色体标本片放入一平皿中(最好用牙签放在玻片下面),在 玻片上盖一张稍大些的擦镜纸,使纸的四边垂于平皿中,滴加2×SSC液到纸上, 使擦镜纸全部润湿,使平皿中放入的2×SSC溶液与玻片水平,保证有充足的 2×SSC液渗至标本上保持标本湿润。 2.将平皿置于56℃的水浴箱中,使平皿底部接触水面。 3.在水浴箱上架一支20W的紫外线灯,使灯管与标本的距离6cm左右,开 灯照射30min。 4!.照射完毕,用镊子轻轻揭去擦镜纸,用自来水轻轻冲洗玻片 5.1:10 lema染料染色8~10min(不要着色过深) 6.自来水冲洗晾干后即成SCE标本 四、注意事项 BrdU溶液最好现用现配,一次用不完,必须4℃避光保存。 2.BrdU是强的致突变剂,使用浓度不易太高,在每毫升含25mg 左右的剂量下不影响细胞增殖。外周血培养24h后加入均可。 3.用紫外线照射诱发姐妹染色单体分化时,如紫外灯功率大,照射时间应 相应减少。一般在20w的紫外灯距标本距离应在6cm左右;如果在15w紫外线 灯照射时距离标本应在4cm左右。温度要控制在50℃~60℃(冬天最好是 55℃~60℃),但不应超过60℃。如果时间过长或温度过高都易造成染色体肿胀 五、预期实验结果及分析 (一)预期实验结果 在某些进入第二次复制中期的分裂相中,清晰可见姐妹染色单体分染为一深 浅图像,可观察到姐妹染色单体同源片段等位交换相。 (二)实验结果观察分析
8 混匀后，避光培养。 3. 加秋水仙素 在收获细胞前 2h 加秋水仙素（终浓度为 0.2μg/ml 培养液）。 （二）收获细胞和制备染色体玻片 收获细胞及染色体标本制片均与人类染色体标本的制备相同。 （三）标本老化 将制好的染色体玻片置 37℃培养箱 2 天或在 60℃干烤箱烤片 2h。 （四）差别染色——紫外线照射法 1. 将老化好的染色体标本片放入一平皿中（最好用牙签放在玻片下面），在 玻片上盖一张稍大些的擦镜纸，使纸的四边垂于平皿中，滴加 2×SSC 液到纸上， 使擦镜纸全部润湿，使平皿中放入的 2×SSC 溶液与玻片水平，保证有充足的 2×SSC 液渗至标本上保持标本湿润。 2. 将平皿置于 56℃的水浴箱中，使平皿底部接触水面。 3. 在水浴箱上架一支 20W 的紫外线灯，使灯管与标本的距离 6 ㎝左右，开 灯照射 30min。 4. 照射完毕，用镊子轻轻揭去擦镜纸，用自来水轻轻冲洗玻片。 5. 1:10Giemsa 染料染色 8～10min（不要着色过深）. 6. 自来水冲洗晾干后即成 SCE 标本. 四、注意事项 1．BrdU 溶液最好现用现配，一次用不完，必须 4℃避光保存。 2．BrdU 是强的致突变剂，使用浓度不易太高，在每毫升含 25mg 左右的剂量下不影响细胞增殖。外周血培养 24h 后加入均可。 3．用紫外线照射诱发姐妹染色单体分化时，如紫外灯功率大，照射时间应 相应减少。一般在 20w 的紫外灯距标本距离应在 6cm 左右；如果在 15w 紫外线 灯照射时距离标本应在 4 ㎝左右。温度要控制在 50℃~60℃（冬天最好是 55℃~60℃），但不应超过 60℃。如果时间过长或温度过高都易造成染色体肿胀。 五、预期实验结果及分析 （一）预期实验结果 在某些进入第二次复制中期的分裂相中，清晰可见姐妹染色单体分染为一深 一浅图像，可观察到姐妹染色单体同源片段等位交换相。 （二）实验结果观察分析
1.选择在加入Bdu之后经过两个复制周期,姐妹染色单体分化着色清晰, 染色体分散良好,长短合适和染色数目完整的中期分裂,进行观察分析。 2.SCE交换次数判定:染色体某臂端部交换算1次交换,臂间交换算2次; 着丝粒处发生交换(需排除染色体在此发生扭曲)计一次。 3.每个标本分析30-50个中期分裂相。 4.SCE率计算:SCE率=累计互换数观察细胞数=SCE细胞 第四节小鼠骨髓嗜多染红细胞微核检测 微核是游离于细胞质中的核物质小体,一般为主核的1/3~1/4。微核是染色 体畸变的一种特殊表现形式,是细胞分裂后期滞留的染色体断片或整条染色体在 子代细胞分裂间期的细胞质中形成的游离团块物。由于染色体受化学诱变剂和辐 射损伤而断裂成一些无着丝粒的染色体断片或纺锤体受到某些毒物作用而损伤, 当细胞进入分裂后期时,染色体不受纺锤丝牵引而滞留在赤道板附近。在末期以 后,单独形成一个或几个规则的次核,包含在子细胞的胞质内,由于比主核小得 多,故称微核。微核同主核一样,是由DNA物质所组成。现已证实,微核率同 外界作用因子的剂量呈线性正比关系。因此,微核检测技术已广泛应用在辐射防 护、损伤,化学诱变剂研究和新药、保健食品的毒理实验中。 微核检测技术 微核的产生与染色体和DNA损伤有较大关系,常将微核的检出率作为DNA 损伤的一种指标 微核试验( Micronucleus test,MNT)方法可分成两大类,一类是从外周血中 分离淋巴细胞,常规涂片即可,称直接法。该法制作简便、快速,适用于大面积 的人群普査,但检出率低,敏感性较差,在准确反映染色体损伤方面一直有质疑 另一类是培养法,即将细胞经体外培养后再制片,该法检岀率髙,敏感性较强, 而且制备的标本胞浆完整、染色清晰。 微核的形成需要经过一次细胞分裂。有丝分裂阻断法微核检测技术是利用 定浓度的细胞松弛素B阻断淋巴细胞细胞质的分裂而不影响细胞核的分裂,即在 淋巴细胞培养过程中加入细胞松弛素B,使经过一次分裂的淋巴细胞呈双核,选 择这部分细胞进行微核计数而提高了实验的敏感性。同时也成为检测致突变、致
9 1．选择在加入 Brdu 之后经过两个复制周期，姐妹染色单体分化着色清晰， 染色体分散良好，长短合适和染色数目完整的中期分裂，进行观察分析。 2．SCE 交换次数判定：染色体某臂端部交换算 1 次交换，臂间交换算 2 次； 着丝粒处发生交换（需排除染色体在此发生扭曲）计一次。 3．每个标本分析 30~50 个中期分裂相。 4．SCE 率计算：SCE 率=累计互换数/观察细胞数=SCE/细胞 第四节 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核检测 微核是游离于细胞质中的核物质小体，一般为主核的 1/3～1/4。微核是染色 体畸变的一种特殊表现形式，是细胞分裂后期滞留的染色体断片或整条染色体在 子代细胞分裂间期的细胞质中形成的游离团块物。由于染色体受化学诱变剂和辐 射损伤而断裂成一些无着丝粒的染色体断片或纺锤体受到某些毒物作用而损伤， 当细胞进入分裂后期时，染色体不受纺锤丝牵引而滞留在赤道板附近。在末期以 后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，由于比主核小得 多，故称微核。微核同主核一样，是由 DNA 物质所组成。现已证实，微核率同 外界作用因子的剂量呈线性正比关系。因此，微核检测技术已广泛应用在辐射防 护、损伤，化学诱变剂研究和新药、保健食品的毒理实验中。 一、微核检测技术 微核的产生与染色体和 DNA 损伤有较大关系，常将微核的检出率作为 DNA 损伤的一种指标。 微核试验（Micronucleus test，MNT）方法可分成两大类，一类是从外周血中 分离淋巴细胞，常规涂片即可，称直接法。该法制作简便、快速，适用于大面积 的人群普查，但检出率低，敏感性较差，在准确反映染色体损伤方面一直有质疑。 另一类是培养法，即将细胞经体外培养后再制片，该法检出率高，敏感性较强， 而且制备的标本胞浆完整、染色清晰。 微核的形成需要经过一次细胞分裂。有丝分裂阻断法微核检测技术是利用一 定浓度的细胞松弛素 B 阻断淋巴细胞细胞质的分裂而不影响细胞核的分裂，即在 淋巴细胞培养过程中加入细胞松弛素 B，使经过一次分裂的淋巴细胞呈双核，选 择这部分细胞进行微核计数而提高了实验的敏感性。同时也成为检测致突变、致
癌、致畸物质对机体遗传效应的一种重要手段。 材微核技术与其他技术结合,实验方法日趋完善,试验选范围越来越广,如 小鼠、大鼠、中国仓鼠、猕猴、豚鼠等,各种实验动物中,小鼠价格便宜,骨髓 中干扰因素少,是微核试验的常用动物。 、骨髓微核试验 环磷酰胺因具有显著的诱变作用,而常被用作骨髓微核试验的阳性对照物。 除此之外,射线、顺铂等也常用作阳性对照物或诱导剂 骨髓嗜多染红细胞( polychromatic erythrocyte,PCE)中主核已排出,微核经 Giemsa染色后色泽鲜红,胞质内含有核糖体,被染成淡灰蓝色,微核与胞质形成 鲜明的对比,易于鉴别;而成熟红细胞中的核糖体已溶解,被染成淡桔红色,与 PCE区别明显。 、实验用品和材料 (一)材料 2~3月龄、体重18g~22g的健康小鼠。 (二)试剂 小牛血清(经灭活处理)、 Giemsa原液、磷酸盐缓冲液(pH68)、甲醇、环 磷酰胺。 (三)器械 lm注射器、解剖器械、低速离心机、5ml离心管、毛细吸管、载玻片、染色 缸、显微镜、计数器 四、实验方法与步骤 1.染毒小鼠腹腔注射一定量的化学物质及环磷酰胺(40mg/kg体重)。 2.取材以颈椎脱臼法处死小鼠,取两腿股骨,剔净肌肉,擦去附着在上面 的血污,剪取两端股骨头,暴露骨髓腔,用注射器吸取1m灭活小牛血清,将针 头插入骨髓腔上段冲洗,用试管接收冲洗液,即成骨髓细胞悬液。 3.离心1000mpm离心5min,弃大部分上清液,留少许液体,用毛细吸管 将细胞团块轻轻吹打均匀。 4.涂片混匀后的液体滴1滴于载玻片上,血常规涂片法涂片,自然干燥。 5.固定玻片标本置于甲醇溶液中固定5min~10min,晾干 6.染色 Giemsa原液用磷酸缓冲液按1:9的比例稀释,染色10min。自来
10 癌、致畸物质对机体遗传效应的一种重要手段。 材微核技术与其他技术结合，实验方法日趋完善，试验选范围越来越广，如 小鼠、大鼠、中国仓鼠、猕猴、豚鼠等，各种实验动物中，小鼠价格便宜，骨髓 中干扰因素少，是微核试验的常用动物。 二、骨髓微核试验 环磷酰胺因具有显著的诱变作用，而常被用作骨髓微核试验的阳性对照物。 除此之外，射线、顺铂等也常用作阳性对照物或诱导剂。 骨髓嗜多染红细胞（polychromatic erythrocyte，PCE）中主核已排出，微核经 Giemsa 染色后色泽鲜红，胞质内含有核糖体，被染成淡灰蓝色，微核与胞质形成 鲜明的对比，易于鉴别；而成熟红细胞中的核糖体已溶解，被染成淡桔红色，与 PCE 区别明显。 三、实验用品和材料 （一）材料 2～3 月龄、体重 18g～22g 的健康小鼠。 （二）试剂 小牛血清（经灭活处理）、Giemsa 原液、磷酸盐缓冲液（pH6.8）、甲醇、环 磷酰胺。 （三）器械 1ml 注射器、解剖器械、低速离心机、5ml 离心管、毛细吸管、载玻片、染色 缸、显微镜、计数器。 四、实验方法与步骤 1．染毒 小鼠腹腔注射一定量的化学物质及环磷酰胺（40mg/kg 体重）。 2．取材 以颈椎脱臼法处死小鼠，取两腿股骨，剔净肌肉，擦去附着在上面 的血污，剪取两端股骨头，暴露骨髓腔，用注射器吸取 1ml 灭活小牛血清，将针 头插入骨髓腔上段冲洗，用试管接收冲洗液，即成骨髓细胞悬液。 3．离心 1000rpm 离心 5min，弃大部分上清液，留少许液体，用毛细吸管 将细胞团块轻轻吹打均匀。 4．涂片 混匀后的液体滴 1 滴于载玻片上，血常规涂片法涂片，自然干燥。 5．固定 玻片标本置于甲醇溶液中固定 5min～10min，晾干。 6．染色 Giemsa 原液用磷酸缓冲液按 1∶9 的比例稀释，染色 10min。自来
