第一篇组成人体的细胞 第五章细胞的功能 细胞作为生物体的基本单位,具有多种多样的生理功能,不仅包括细胞形态 的改变和维持,细胞内的物质代谢和能量代谢、内吞外排、免疫行为、细胞运动 而且还包括了细胞的增殖、分化和衰老,细胞对外界环境的反应、信息传递等等。 研究和了解细胞的生理功能对于认识生命现象的本质是十分重要的。 第一节巨噬细胞的吞噬功能 高等动物体内的巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞,具有吞噬的功能。它 们广泛分布在组织和血液中,在机体的非特异免疫功能中起着重要的作用。当病 原微生物或其它异物侵入机体时,能招引巨噬细胞,而巨噬细胞又具有趋化性, 它通过产生活跃的变形运动,主动向病原体和异物移行聚集,首先把异物吸附在 细胞表面,随之,吸附区域的细胞膜向内凹陷,伸出伪足包围异物,并吞入胞质, 形成吞噬泡,继而在细胞质中的初级溶酶体与吞噬泡融合,形成吞噬溶酶体,把 病原体杀死,异物消化分解 所需试剂及设备 显微镜、髙压灭菌锅、解剖盘、解剖剪、lm注射器、吸管、载玻片、盖玻 片;小鼠(体重20g左右),鸡血:6%淀粉肉汤(含0.3%台盼蓝) 、操作步骤 1.实验前2天,每天给小白鼠腹腔注射6%淀粉肉汤(含台盼蓝)lml。 2.实验时,再往腹腔内注射lml1%鸡红细胞悬液,并轻揉腹部,使鸡红细 胞悬液分散。 3.20~30min后,用脊椎脱臼法处死小鼠(右手抓住鼠尾,用力向后拉, 左手拇指与食指同时按住鼠头,使脊髓与脑髓间断开致死)。 迅速剖开腹腔,用未装针头的注射器或吸管吸取腹腔液
第一篇 组成人体的细胞 第五章 细胞的功能 细胞作为生物体的基本单位，具有多种多样的生理功能，不仅包括细胞形态 的改变和维持，细胞内的物质代谢和能量代谢、内吞外排、免疫行为、细胞运动， 而且还包括了细胞的增殖、分化和衰老，细胞对外界环境的反应、信息传递等等。 研究和了解细胞的生理功能对于认识生命现象的本质是十分重要的。 第一节 巨噬细胞的吞噬功能 高等动物体内的巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞，具有吞噬的功能。它 们广泛分布在组织和血液中，在机体的非特异免疫功能中起着重要的作用。当病 原微生物或其它异物侵入机体时，能招引巨噬细胞，而巨噬细胞又具有趋化性， 它通过产生活跃的变形运动，主动向病原体和异物移行聚集，首先把异物吸附在 细胞表面，随之，吸附区域的细胞膜向内凹陷，伸出伪足包围异物，并吞入胞质， 形成吞噬泡，继而在细胞质中的初级溶酶体与吞噬泡融合，形成吞噬溶酶体，把 病原体杀死，异物消化分解。 一、所需试剂及设备 显微镜、高压灭菌锅、解剖盘、解剖剪、1ml 注射器、吸管、载玻片、盖玻 片；小鼠（体重 20g 左右），鸡血；6％淀粉肉汤（含 0.3％台盼蓝） 二、操作步骤 1．实验前 2 天，每天给小白鼠腹腔注射 6％淀粉肉汤（含台盼蓝）1ml。 2．实验时，再往腹腔内注射 1ml 1％鸡红细胞悬液，并轻揉腹部，使鸡红细 胞悬液分散。 3．20～30ｍin 后，用脊椎脱臼法处死小鼠（右手抓住鼠尾，用力向后拉， 左手拇指与食指同时按住鼠头，使脊髓与脑髓间断开致死）。 4．迅速剖开腹腔，用未装针头的注射器或吸管吸取腹腔液
5.取一张干净的载玻片,滴一滴腹腔液,盖上盖玻片,显微镜下检査ε 观察时,将视野光线调暗。在髙倍镜下,先分辨清鸡红细胞和巨噬细胞。鸡红细 胞为淡黄色、椭圆形、有核的细胞。而数量较多、体积较大圆形或不规则的细胞, 其表面有许多似毛刺状的小突起(伪足),胞质中有数量不等的蓝色颗粒(为吞 入的含台盼蓝淀粉肉汤形成的吞噬泡)即为巨噬细胞。变换视野,仔细观察巨噬 细胞吞噬鸡红细胞的过程。可见有的鸡红细胞(一至多个)紧贴附于巨噬细胞的 表面;有的巨噬细胞已将1至数个红细胞部分吞入;有的巨噬细胞已吞入1个或 几个红细胞在胞质中刚刚形成椭圆形的吞噬泡;有的巨噬细胞内的吞噬泡体积缩 小,并呈现圆形,这是与初级溶酶体发生融合,泡内物正在被消化分解。 6.绘图示出所观察到的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的各种形态。 计算吞噬百分比,即每100个吞噬细胞中吞有鸡红细胞的吞噬细胞数。 三、注意 1.小鼠腹腔注射时注意不要刺伤内脏 腹腔内的细胞浓度过大,可用生理盐水稀释。 第二节细胞膜的通透性 细胞膜在不断变化的环境中,必须保持自身的稳恒状态,才能生存。细胞膜 允许一些物质通透,又能降低甚至阻挡另一些物质的通透,所以细胞膜具有选择 通透性。水分子可以自由通过细胞膜,当细胞处于低渗液环境时,水分子大量渗 到细胞内,使细胞膨胀,进而破裂,血红蛋白释放到介质中,由不透明的红细胞 悬液变为红色透明的血红蛋白溶液,这就是溶血现象。溶血现象可作为测量物质 进入红血细胞速度的一种指标 红细胞置于乙二醇、丙三醇(甘油)、葡萄糖等摩尔浓度的高渗液中,乙二 醇等分子进入红血细胞,使细胞内的渗透性活性分子的浓度大为增加,继而导致 水的摄入,使细胞膨胀,细胞膜破裂,发生溶血。溶血现象发生的快慢与进入细 胞的物质的分子量大小有关。分子量大的进入细胞慢,发生溶血所需时间也长。 非极性化合物易溶于脂溶剂,但在水中溶解度甚小。碳链越长,脂溶性越大。 一种化合物在脂溶剂中的溶解度与其在水中溶解度之比,叫分配系数
5．取一张干净的载玻片，滴一滴腹腔液，盖上盖玻片，显微镜下检查。 观察时，将视野光线调暗。在高倍镜下，先分辨清鸡红细胞和巨噬细胞。鸡红细 胞为淡黄色、椭圆形、有核的细胞。而数量较多、体积较大圆形或不规则的细胞， 其表面有许多似毛刺状的小突起（伪足），胞质中有数量不等的蓝色颗粒（为吞 入的含台盼蓝淀粉肉汤形成的吞噬泡）即为巨噬细胞。变换视野，仔细观察巨噬 细胞吞噬鸡红细胞的过程。可见有的鸡红细胞（一至多个）紧贴附于巨噬细胞的 表面；有的巨噬细胞已将 1 至数个红细胞部分吞入；有的巨噬细胞已吞入 1 个或 几个红细胞在胞质中刚刚形成椭圆形的吞噬泡；有的巨噬细胞内的吞噬泡体积缩 小，并呈现圆形，这是与初级溶酶体发生融合，泡内物正在被消化分解。 6．绘图示出所观察到的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的各种形态。 7．计算吞噬百分比，即每 100 个吞噬细胞中吞有鸡红细胞的吞噬细胞数。 三、注意 1．小鼠腹腔注射时注意不要刺伤内脏。 2．腹腔内的细胞浓度过大，可用生理盐水稀释。 第二节 细胞膜的通透性 细胞膜在不断变化的环境中，必须保持自身的稳恒状态，才能生存。细胞膜 允许一些物质通透，又能降低甚至阻挡另一些物质的通透，所以细胞膜具有选择 通透性。水分子可以自由通过细胞膜，当细胞处于低渗液环境时，水分子大量渗 到细胞内，使细胞膨胀，进而破裂，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞 悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这就是溶血现象。溶血现象可作为测量物质 进入红血细胞速度的一种指标。 红细胞置于乙二醇、丙三醇（甘油）、葡萄糖等摩尔浓度的高渗液中，乙二 醇等分子进入红血细胞，使细胞内的渗透性活性分子的浓度大为增加，继而导致 水的摄入，使细胞膨胀，细胞膜破裂，发生溶血。溶血现象发生的快慢与进入细 胞的物质的分子量大小有关。分子量大的进入细胞慢，发生溶血所需时间也长。 非极性化合物易溶于脂溶剂，但在水中溶解度甚小。碳链越长，脂溶性越大。 一种化合物在脂溶剂中的溶解度与其在水中溶解度之比，叫分配系数
各种非电解质溶液,只要单位面积中所含的分子数相同,就具有相同的渗透 压。电解质溶液,如氯化钠与葡萄糖分子数相等时,氯化钠产生的渗透压要大的 多。具有相同渗透压的某非电解溶液与某电解质溶液浓度之比,叫等渗系数。用 i来表示。 葡萄糖的等渗摩尔浓度/氯化钠的等渗摩尔浓度 发生溶血者为低渗液,所以把发生溶血的前一管溶液的浓度近似视为红细胞 等渗 、所需试剂及设备 小烧杯、试管、试管架、刻度吸管、注射器、秒表:含适量肝素的兔血或鸡 血;IM乙二醇水溶液、IM丙三醇水溶液、IM葡萄糖水溶液、3M甲醇、3M 乙醇、3M丙醇、M8、M9、M12、M/13葡萄糖溶液、M⑧8、M9、MI2、M3 氯化钠溶液 二、操作步骤: (一)分子量大小对膜通透性的影响 在编号的三支试管中,分别用吸管吸入2mIM乙二醇,1M丙三醇,1M 葡萄糖高渗液。 2.先后分别用注射器滴加两滴血液,用手指按住管口,倒置一次。 3.观察溶血时间,最长延至10min 4.记录实验结果 溶液 相对分子质量 溶血时间 Imo/L乙二醇 lmoⅥL丙三醇 92 lmoL葡萄糖 180 (二)脂溶性大小对细胞膜透性的影响 1.编号的三支试管分别加入2ml3M的甲醇、乙醇、丙醇溶液。 2.分别先后加入两滴血液,按住管口倒置一次。 3.观察溶血时间 4.记录实验结果 溶液 相对分子质量 分配系数 溶血时间
各种非电解质溶液，只要单位面积中所含的分子数相同，就具有相同的渗透 压。电解质溶液，如氯化钠与葡萄糖分子数相等时，氯化钠产生的渗透压要大的 多。具有相同渗透压的某非电解溶液与某电解质溶液浓度之比，叫等渗系数。用 i 来表示。 i= 葡萄糖的等渗摩尔浓度/ 氯化钠的等渗摩尔浓度 发生溶血者为低渗液，所以把发生溶血的前一管溶液的浓度近似视为红细胞 等渗。 一、所需试剂及设备 小烧杯、试管、试管架、刻度吸管、注射器、秒表；含适量肝素的兔血或鸡 血；1M 乙二醇水溶液、1M 丙三醇水溶液、1M 葡萄糖水溶液、3M 甲醇、3M 乙醇、3M 丙醇、M/8、M/9、M/12、M/13 葡萄糖溶液、M/8、M/9、M/12、M/13 氯化钠溶液 二、操作步骤： （一）分子量大小对膜通透性的影响 1．在编号的三支试管中，分别用吸管吸入 2ml 1M 乙二醇，1M 丙三醇，1M 葡萄糖高渗液。 2．先后分别用注射器滴加两滴血液，用手指按住管口，倒置一次。 3．观察溶血时间，最长延至 10min。 4．记录实验结果。 溶液 相对分子质量 溶血时间 lmol/L 乙二醇 62 lmol/L 丙三醇 92 lmol/L 葡萄糖 180 （二）脂溶性大小对细胞膜透性的影响 1．编号的三支试管分别加入 2ml 3M 的甲醇、乙醇、丙醇溶液。 2．分别先后加入两滴血液，按住管口倒置一次。 3．观察溶血时间。 4．记录实验结果。 溶液 相对分子质量 分配系数 溶血时间
3moL甲醇 32.04 0.0097 3molL乙醇 46.07 0.035 3molL丙醇 58.0 0.156 三)电解质和非电解质溶液对细胞膜透性的影响 1.将试管编号,注明溶质名称及摩尔浓度。 2.按编号分别加入不同浓度的葡萄糖及氯化钠溶液2ml。 3.每管各加入两滴血液,按住管口,倒置一次 4.室温放置l5min,观察发生溶血的浓度,确定等渗浓度。 5.记录实验结果 物质的浓度(lmoL) 溶质 1/8M 1/9M l/12M 1/13M 葡萄糖 NaCl 6.计算等渗摩尔系数。 第三节细胞的迁移 上皮细胞,成纤维细胞,癌细胞等,在生理状态下,常形成单层或者复层上 皮。当病理状态下,比如创伤愈合,细胞迁移的时候,以侧向运动为主,细胞划 痕实验很好的模拟了这种运动形式,是很好的模型。 多年来,细胞划痕实验( Wound healing assays/scrape migration assay)一直 被用来检测不同细胞的迁移能力。在单层培养细胞中,通过针或枪尖划痕使小片 细胞损伤脱落,进而借助显微镜对细胞再次迁入并填充缺口处进行适时观察。根 据细胞类型、培养条件及划痕大小的不同,迁移时间也会有所差异。 、细胞划痕实验 (一)、所需试剂及设备: 6孔细胞培养板、 marker笔、直尺、20微升枪头、无血清培养基、PBS (二)、操作步骤: 1.先用 marker笔在6孔板背后,用直尺比着,均匀划横线,每隔0.5~lcm
3mol/L 甲醇 32.04 0.0097 3mol/L 乙醇 46.07 0.035 3mol/L 丙醇 58.0 0.156 （三）电解质和非电解质溶液对细胞膜透性的影响 1．将试管编号，注明溶质名称及摩尔浓度。 2．按编号分别加入不同浓度的葡萄糖及氯化钠溶液 2ml。 3．每管各加入两滴血液，按住管口，倒置一次。 4．室温放置 15min ，观察发生溶血的浓度，确定等渗浓度。 5．记录实验结果。 溶质 物质的浓度/(lmol/L) 1/8M 1/9M 1/12M 1/13M 葡萄糖 NaCl 6．计算等渗摩尔系数。 第三节 细胞的迁移 上皮细胞，成纤维细胞，癌细胞等，在生理状态下，常形成单层或者复层上 皮。当病理状态下，比如创伤愈合，细胞迁移的时候，以侧向运动为主，细胞划 痕实验很好的模拟了这种运动形式，是很好的模型。 多年来，细胞划痕实验（Wound healing assays/scrape migration assay）一直 被用来检测不同细胞的迁移能力。在单层培养细胞中，通过针或枪尖划痕使小片 细胞损伤脱落，进而借助显微镜对细胞再次迁入并填充缺口处进行适时观察。根 据细胞类型、培养条件及划痕大小的不同，迁移时间也会有所差异。 一、细胞划痕实验 （一）、所需试剂及设备： 6 孔细胞培养板、marker 笔、直尺、20 微升枪头、无血清培养基、PBS （二）、操作步骤： 1．先用 marker 笔在 6 孔板背后，用直尺比着，均匀划横线，每隔 0.5~1cm
道,横穿过孔。每孔至少穿过5条线 2.在空中加入约2×106个Rat-1细胞 3.次日用枪头比着直尺,尽量垂至于背后的横线划痕,枪头要垂直,不能 倾斜 4.用PBS洗细胞3次,去除划下的细胞,加入无血清培养基。 5.放入37℃5%CO2培养箱,培养。按0,6,12,24小时取样,拍照。 第四节 Transwell实验 Transwell是一类有通透性的杯状的装置,根据 Corning公司的 Transwell说 明书中的介绍,可以认为这是一种膜滤器( Membrane filters),也可认为是一种 有通透性的支架( permeable supports)。更准确地说, Transwell I应该是一种实验 技术,这项技术的主要材料是 Transwell小室( Transwell chamber, Transwell Insert),其外形为一个可放置在孔板里的小杯子,根据实验需要,可有不同选择。 其关键部分都是一致的,那就是杯子底层的一张有通透性的膜,而杯子其余部分 的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔,孔径大小有0.1-12.0μm,根据 不同需要可用不同材料,一般常用的是聚碳酸酯膜( polycarbonate membrane)。 将 Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上室内 盛装上层培养液,下室内盛装下层培养液,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我 们将细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响 到上室内的细胞,从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细 胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 、 Transwell!侵袭实验 (一)、所需试剂及设备 ① Transwell小室;②上层培养液:上层培养液采用无血清培养基,为维 持渗透压,需加入0.05%0.2%BSA:③细胞:值得注意的是,有侵袭能力 的细胞才可用于 Transwell侵袭实验。另外,为了让实验结果更明显,可先 撤血清让细胞饥饿12-24h,再进行实验;④下层培养液:下层常用含5%
一道，横穿过孔。每孔至少穿过 5 条线。 2．在空中加入约 2×106 个 Rat-1 细胞。 3．次日用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能 倾斜。 4．用 PBS 洗细胞 3 次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。 5．放入 37℃ 5% CO2 培养箱，培养。按 0，6，12，24 小时取样，拍照。 第四节 Transwell 实验 Transwell 是一类有通透性的杯状的装置，根据 Corning 公司的 Transwell 说 明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种 有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell 应该是一种实验 技术，这项技术的主要材料是 Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，根据实验需要，可有不同选择。 其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分 的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有 0.1－12.0µm，根据 不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将 Transwell 小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内 盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我 们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响 到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细 胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 一、Transwell 侵袭实验 （一）、所需试剂及设备： ① Transwell 小室；② 上层培养液：上层培养液采用无血清培养基，为维 持渗透压，需加入 0.05%-0.2% BSA；③ 细胞：值得注意的是，有侵袭能力 的细胞才可用于 Transwell 侵袭实验。另外，为了让实验结果更明显，可先 撤血清让细胞饥饿 12－24h，再进行实验；④下层培养液：下层常用含 5%
10%FBS的培养基,具体浓度根据细胞侵袭力而定,侵袭力弱的细胞可适 当提高FBS浓度;⑤细胞培养板:常用于 Transwell侵袭实验的细胞培养板 有6孔板、12孔板、24孔板等,以24孔最常用。细胞培养板没什么特殊要 求,普通的细胞培养板就可以。但要注意,细胞培养板应当与购买的 Transwell 小室相配套:⑥此外,膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白( fibronectin,FN, Sigma 有售),这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上,也可用胶原 ( collagen)或明胶( gelatin) (二)、操作步骤: 有基质胶的 Transwell小室制备 将小室放入培养板中,在上室加入300u预温的无血清培养基,室温下静置 15-30min,吸去培养液。 2.制备细胞悬液 (1)制备细胞悬液前可先以无血清培养基洗涤细胞。 (2)消化细胞:终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1-2遍,用含BSA 的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105。 3.接种细胞 (1)取细胞悬液100-200山加入 Transwell小室。24孔板小室一般200l (2)24孔板下室加入500u含FBS或趋化因子的培养基,注意避免出现气 泡 (3)培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。时间点 的 选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 结果统计 检测穿过的细胞数有两种方法: (1)直接计数法 、“贴壁”细胞数:这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在 膜的下室侧而不会掉到下室里面去。通过细胞染色,可在镜下计数细胞。①用棉 签擦去基质胶和上室内的细胞;②染色:常用的染色方法有结晶紫染色、台胎蓝 染色、 Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。本实验采用0.1%结晶紫染色
－10% FBS 的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适 当提高 FBS 浓度；⑤细胞培养板：常用于 Transwell 侵袭实验的细胞培养板 有 6 孔板、12 孔板、24 孔板等，以 24 孔最常用。细胞培养板没什么特殊要 求，普通的细胞培养板就可以。但要注意，细胞培养板应当与购买的 Transwell 小室相配套；⑥此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin，FN，Sigma 有售)，这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原 （collagen）或明胶（gelatin）。 （二）、操作步骤： 1．有基质胶的 Transwell 小室制备 将小室放入培养板中，在上室加入 300µl 预温的无血清培养基，室温下静置 15－30min，吸去培养液。 2．制备细胞悬液 （1）制备细胞悬液前可先以无血清培养基洗涤细胞。 （2）消化细胞：终止消化后离心弃去培养液，用 PBS 洗 1－2 遍，用含 BSA 的无血清培养基重悬。调整细胞密度至 1－10×105。 3．接种细胞 （1）取细胞悬液 100－200µl 加入 Transwell 小室。24 孔板小室一般 200µl。 （2）24 孔板下室加入 500µl 含 FBS 或趋化因子的培养基，注意避免出现气 泡。 （3）培养细胞：常规培养 12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点 的。 选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 4．结果统计 检测穿过的细胞数有两种方法： （1）直接计数法 A、“贴壁”细胞数：这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在 膜的下室侧而不会掉到下室里面去。通过细胞染色，可在镜下计数细胞。①用棉 签擦去基质胶和上室内的细胞；②染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝 染色、Giemsa 染色、苏木精染色、伊红染色等。本实验采用 0.1%结晶紫染色；
③细胞计数:使用正置显微镜进行观察和拍照,把 Transwell小室反过来底朝上 就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也可用手术刀将膜切下后染色,再 贴在玻片上,滴二甲苯,再盖上盖玻片,就可以长期保存。 随机选取5个视野计数细胞个数。 B、“非贴壁”细胞计数由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系,有时细 胞在穿过膜后不能附着在膜上,而是掉进下室。可以收集下层培养液,用流式细 胞仪计数细胞量,也可用细胞计数的方法直接在镜下计数 (2)间接计数法 间接计数法主要用于穿过细胞过多,而无法通过计数获得准确的细胞数所采 用的方法,与常用的MTT实验是同样的原理。①用棉签擦去基质胶和上室内的 细胞:②24孔板中加入500μ含0.5ng/mMTT的完全培养基,将小室置于其中, 使膜浸没在培养基中,37℃4h后取出;③24孔板中加入500μ L DMSO,将小室 置于其中,使膜浸没在DMsO中,振荡l0min,使甲臢充分溶解。取出小室, 24孔板于酶标仪上测OD值。 (江苏大学金洁,复旦大学刘晓宇)
③细胞计数：使用正置显微镜进行观察和拍照，把 Transwell 小室反过来底朝上 就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也可用手术刀将膜切下后染色，再 贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，就可以长期保存。 随机选取 5 个视野计数细胞个数。 B、“非贴壁”细胞计数由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细 胞在穿过膜后不能附着在膜上，而是掉进下室。可以收集下层培养液，用流式细 胞仪计数细胞量，也可用细胞计数的方法直接在镜下计数。 （2）间接计数法 间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采 用的方法，与常用的 MTT 实验是同样的原理。①用棉签擦去基质胶和上室内的 细胞；②24 孔板中加入 500µl 含 0.5mg/ml MTT 的完全培养基，将小室置于其中， 使膜浸没在培养基中，37℃ 4h 后取出；③24 孔板中加入 500µl DMSO，将小室 置于其中，使膜浸没在 DMSO 中，振荡 10min，使甲臜充分溶解。取出小室， 24 孔板于酶标仪上测 OD 值。 （江苏大学 金洁，复旦大学 刘晓宇）